3 Material und Methoden
4.8 Strukturveränderung durch DEK
4.8.3 Analyse der Struktur über Mikrokokkennuklease-Verdau
Nun sollten die Strukturveränderungen, die durch DEK hervorgerufen werden, durch Mikrokokkennuklease-Abbau weiter charakterisiert werden. Hierfür wurde SV40 DNA und SV40 Minichromosomen mit steigenden Mengen DEK inkubiert, anschließend wurden die Proben mit Mikrokokkennuklease für 1 min, 5 min und 10 min verdaut.
Die Analyse der Produkte erfolgte über ein 1,5%-iges Agarosegel. Proteinfreie DNA, die nicht mit DEK inkubiert wurde, ist sehr sensitiv gegenüber dem Verdau mit Mikrokokkennuklease. Nach 1 min sind nur noch kleine DNA-Fragmente zu finden, und nach 5 min ist die DNA schon vollständig abverdaut (Abbildung 4.21, DNA, DEK/DNA = 0). Mit steigender DEK-Konzentration wird die DNA immer resistenter gegenüber dem Verdau. Bei einem DEK/DNA-Verhältnis von 30 kann sie schon nicht mehr vollständig verdaut werden (Abbildung 4.21, DNA, DEK/DNA = 30), bei 150 findet man beim ersten Zeitwert noch sehr große DNA-Fragmente, die zwischen 2000 bp und 500 bp lang sind (Abbildung 4.21, DNA, DEK/DNA = 150, erster Zeitwert). Nach 5 und 10 min kann bei diesem Verhältnis eine resistente Bande von ungefähr 80 bis 100 bp Länge detektiert werden (Abbildung 4.21, DNA, DEK/DNA = 150, zweiter und dritter Zeitwert), die sich auch schon bei geringeren DEK-Mengen andeutet (Abbildung 4.21, DNA, DEK/DNA = 30). Der gleiche Versuchsaufbau wurde
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mit SV40 Minichromosomen durchgeführt. Hier sieht man in Abwesenheit von DEK das typische Bandenmuster von nukleosomaler DNA. Das Monomer, ein Nukleosom, ist schon nach 1 min deutlich zu erkennen, die zweite Bande stellt das Dinukleosom dar, die nächste ein Trinukleosom (Abbildung 4.21, Minichromosomen, DEK/DNA = 0). In Gegenwart von DEK werden die Mini-chromosomen, wie schon für proteinfreie DNA beobachtet, deutlich resistenter gegenüber der Mikrokokkennuklease. Gleichzeitig wird die regelmäßige Struktur der Minichromosomen aufgehoben, was sich durch den starken DNA-„Schmier“ andeutet (Abbildung 4.21, Minichromosomen, DEK/DNA = 30 und 150). Dennoch kann man noch eine Monomerbande erkennen, die aber auf eine Höhe von ca. 200 bp gerutscht ist (Abbildung 4.21, Minichromosomen, DEK/DNA = 30 und 150, zweiter und dritter Zeitwert). DEK verlängert also den geschützten Bereich der Nukleosomen um ungefähr 50 bp.
Abbildung 4.21: Mikrokokkennuklease-Verdau von SV40 DNA und Minichromosomen
2 µg SV40 DNA bzw. SV40 Minichromosomen wurden mit steigenden Mengen an DEK unter Standardbedingungen inkubiert. Nach einer Stunde wurden die Proben mit 10 u Mikrokokkennuklease verdaut, nach 1, 5 und 10 min wurde jeweils ein Alliquot entnommen und mit SDS abgestoppt. Nach einer Proteinase K-Behandlung wurden die DNA gefällt und auf einem 1,3%-igem Agarosegel mit anschließender EtBr-Färbung analysiert. 0: Proben, die nicht mit Mikrokokkennuklease verdaut wurden. M: 123 bp Marker.
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Die salzgewaschenen SV40-Minichromosomen, bestehend aus der DNA und den
„Core“-Histonen, stellen ein gereinigtes System dar, dem andere chromatin-gebundene Faktoren wie das Histon H1, die Nicht-Histon-Proteine oder Remodelingfaktoren fehlen. Daher ist es interessant, wie sich die Strukturveränderung durch DEK an Substraten darstellt, die mehr den in vivo-Verhältnissen entsprechen. Ein gutes System, um solche Chromatinsubstrate herzustellen, ist die Rekonstitution von Minichromosomen in Drosophila-Embryoextrakten. Diese Extrakte haben eine sehr hohe Konzentration an Histonen und enthalten alle Faktoren, die für ein Chromatinassembly notwendig sind (Becker et al. 1994). Man inkubiert den Extrakt mit proteinfreier DNA und einem ATP-regenerierenden System. Danach wird die DNA über kleine Entsalzungsäulen aufgereinigt, um die nicht-gebundenen Proteine zu entfernen. DEK kann die Topologie dieser Minichromosomen ebenso gut verändern, wie die der gereinigten SV40 Minichromosomen (Daten nicht gezeigt). Daher wurden diese Minichromosomen mit steigenden Mengen DEK unter Standardbedingungen inkubiert. Um zu überprüfen, ob ATP einen Einfluss hat, wurde jeder Ansatz ohne und mit ATP untersucht. Anschließend wurden die Proben für 15 und 30 Sekunden mit 100 units Mikrokokkennuklease verdaut. Die Ansätze ohne DEK weisen wieder das typische Bandenmuster der nukleosomalen DNA auf (Abbildung 4.22, A Spuren 1 und 2), das noch deutlicher wird, wenn mit weniger Mikrokokkennuklease verdaut wird (Daten nicht gezeigt). In Gegenwart von DEK ist, wie bei den SV40 Minichromosomen, eine sehr starke Resistenz gegenüber die Mikrokokkennuklease zu beobachten. Aber im Gegensatz zu den gereinigten SV40 Minichromosomen bleibt das regelmäßige Bandenmuster der nukleosomalen DNA erhalten (Abbildung 4.22, A Spuren 2-8). Wie bei den SV40 Minichromosomen bewirkt DEK auch hier einen „Shift“ der Mono- und Dinukleosomen-Bande nach oben, wenn auch nicht so weit wie bei den SV40 Minichromosomen. ATP hat hierbei keinen Einfluss auf die Chromatinstruktur, wobei zu bedenken ist, dass das Chromatinassembly in Gegenwart von ATP durchgeführt wurde und somit auch in den Ansätzen ohne ATP, trotz der Reinigung über die Entsalzungssäulen, noch ATP vorhanden sein könnte.
Deshalb wurde die Chromatinrekonstitution nochmals durchgeführt, dieses Mal aber ohne ATP und ATP-regenerierendem System. Dieses Chromatin ist sehr unregelmäßig und bildet nach Mikrokokkennuklease-Verdau einen starken Schmier (Abbildung 4.22, B Spur 3). Der Grund hierfür ist das Fehlen von ATP für die
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sogenannten Nukleosomen-„Spacing“-Aktivitäten wie CHRAC oder ACF (Ito et al.
1997; Varga-Weisz et al. 1997). Wird zu diesen Minichromosomen nach der Reinigung über die Entsalzungssäulen wieder ATP zugegeben, wird die Struktur wieder regelmäßig (Abbildung 4.22, B Spur 4) und vergleichbar mit dem in Gegenwart von ATP assemblierten Chromatin (Abbildung 4.22, B vgl. Spur 1 und 4).
Die „Spacing“-Faktoren binden also auch in Abwesenheit von ATP an das Chromatin und können im Nachhinein aktiviert werden. DEK wurde nun zu verschiedenen Zeitpunkten mit diesen Minichromosomen inkubiert. Zuerst direkt nach dem Chromatinassembly ohne und mit ATP im Ansatz (Abbildung 4.22, B Spuren 5 und 6). Wieder ist eine deutliche Unzugänglichkeit für Mikrokokkennuklease zu beobachten und das Chromatin bleibt unregelmäßig. Auch ATP kann dies nicht verhindern, obwohl es in Abwesenheit von DEK die Herstellung von regelmäßigem Chromatin erlaubt (Abbildung 4.22, B Spur 4). Ein möglicher Grund hierfür könnte sein, dass DEK schneller an die DNA bindet, als ATP die „Spacing“-Aktivitäten stimulieren kann. Deshalb wurde das Chromatin ohne und mit ATP für 30 Minuten vorinkubiert, dann erst wurde DEK zu den Ansätzen gegeben. Auch dieses Verfahren kann die regelmäßige Struktur nicht wieder herstellen (Abbildung 4.22, B Spuren 7 und 8). Um nun sicher zu gehen, dass die „Spacing“-Faktoren die einstündige Inkubation überstehen, wurde das Chromatin ohne und mit DEK vorinkubiert, danach erst wurde ATP zum Ansatz gegeben. In Abwesenheit von DEK kann auch nach einer Stunde die regelmäßige Struktur durch ATP wieder hergestellt werden (Abbildung 4.22, B Spur 9). Die regelmäßige Chromatinstruktur in Anwesenheit von DEK dagegen kann nicht mehr etabliert werden (Abbildung 4.22, B Spur 10). Aus den Ergebnissen der Abbildung 4.22, B könnte geschlossen werden, dass DEK die „Spacing“-Aktivitäten im Extrakt hemmt oder deren Zugänglichkeit an das Chromatin verhindert. Die Ergebnisse aus Abbildung 4.22, A sprechen hingegen dafür, dass es weitere Faktoren im Embryoextrakt geben muss, die nur in Anwesenheit von ATP an die DNA binden können und eine geordnete DEK-Bindung ermöglichen.
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Abbildung 4.22: Mikrokokkennuklease-Verdau von im Drosophilaembryoextrakt assembliertem Chromatin
A: 4 µg SV40 DNA wurden in 240 µl dialysiertem Drosophilaembryoextrakt in Gegenwart von ATP für 5 Stunden bei 26°C assembliert. Davon wurden je 10 µl (= 70 ng Chromatin) ohne DEK (DEK/DNA = 0) und mit steigenden Mengen an DEK, in Ab- und Anwesenheit von ATP (-, +) unter Standardbedingungen inkubiert. Die molaren Verhältnisse DEK/DNA sind angegeben. Die Proben wurden dann mit 100 u Mikrokokkennuklease für 15 und 30 Sekunden bei 30°C verdaut. Nach einem Proteinase K-Verdau und Ethanolfällung wurden die Proben auf einem 1,3 %-igem Agarosegel aufgetrennt und über Southernblot analysiert. B: 4 µg SV40 DNA wurden in 240 µl dialysiertem Drosophilaembryoextrakt in Abwesenheit von ATP für 5 h bei 26°C assembliert. Davon wurden je 10 µl (= 70 ng Chromatin) ohne DEK (-) oder mit DEK (+, molares Verhältnis DEK/DNA = 130) inkubiert. DEK oder/und ATP wurde zu verschiedenen Zeitpunkten zu den Ansätzen gegeben, entweder direkt in den Ansatz oder nach 1 h Inkubation. Die Ansätze wurde dann mit 50 U Mikrokokkennuklease für 1 und 3 Minuten verdaut. Zur Kontrolle wurde in Gegenwart von ATP assembliertes Chromatin ohne (Spuren 1) und mit DEK (Spuren 2) inkubiert und verdaut.