Bandshift- und Topologie-Assay

Alle bisherigen Versuche wurden mit bakteriell exprimiertem GST-DEK durchgeführt.

Allerdings ist schon GST allein relativ groß (26 kDa) und es ist bekannt, dass GST mit sich selbst dimerisieren kann (Tudyka and Skerra 1997). Um einen Effekt von GST allein auszuschließen, wurden sowohl die Bandshiftversuche als auch die Topologieanalysen mit rekombinantem his-DEK aus dem Baculovirussystem wiederholt.

Abbildung 4.9: Bandshift- und Topologie-Assay mit his-DEK

A: Bandshift-Assay mit his-DEK: 175 ng Form I, II, III SV40 DNA wurden mit his-DEK-Protein aus dem Baculo-Virus-System für eine Stunde bei 37°C inkubiert und direkt auf einem 0,6%-igem Agarosegel analysiert. Das molare Verhältnis von DEK/DNA war für jede DNA Form jeweils 0 und 180. B:

Topologie-Assay mit his-DEK. 175 ng SV40 DNA und SV40 Minichromosomen wurden mit his-DEK für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Nach einem Proteinase K-Verdau und einer Ethanolfällung wurde die DNA-Topologie auf einem 0,8%-igem Agarosegel (0,5x TBE, 2 V/cm 16 h) analysiert. Die molaren Verhältnisse von DEK/DNA waren jeweils 0 und 180. I: supergecoilte DNA, II: geschlossen relaxierte oder genickte DNA, III: lineare DNA.

Wie zuvor das GST-DEK bindet auch his-DEK an alle drei DNA-Formen mit gleicher Effizienz (Abbildung 4.9, A). Außerdem hat his-DEK die gleiche Aktivität bei den Topologieanalysen, denn his-DEK verändert ebenso wie GST-DEK die Topologie sowohl von proteinfreier DNA, als auch von Chromatin (Abbildung 4.9, B). Man kann nun davon ausgehen, dass die beobachteten Effekte ausschließlich durch DEK

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zustande kommen und keine Artefakte sind, die durch GST hervorgerufen wurden.

Ein zusätzlicher Beweis hierfür sind auch die Ergebnisse von Alexiadis et al., denn diese Versuche wurden mit nativem, endogenem DEK aus HeLa-Zellkernen durchgeführt, das die gleiche Aktivität wie GST-DEK und his-DEK aufweist (Alexiadis et al. 2000).

4.6 Modell

Der Mechanismus der DEK-induzierten Topologieveränderung ist bisher noch nicht bekannt. Eine einfache Erklärung für die Veränderung der Topologie bei den Minichromosomen könnte sein, dass DEK Nukleosomen von der DNA entfernt.

Dadurch würden fixierte negative Supercoils für die Topoisomerase I relaxierbar werden und dadurch würde es zu einer Abnahme der negativen Supercoils kommen.

Wenn nicht an jedem DNA-Molekül die gleiche Anzahl an Nukleosomen entfernt wird, könnte dies die Topoisomerleiter erklären. Diese Möglichkeit wurde schon von Alexiadis et al. mit Hilfe von Glyceringradienten überprüft. Es stellte sich heraus, dass man nach Behandlung der Minichromosomen mit DEK keinen Verlust von Nukleosomen feststellen konnte (Alexiadis et al. 2000). Allerdings würde dies auch nur die Topologieveränderung der Minichromosomen erklären, nicht aber die der proteinfreien DNA.

Ein Modell, das die Entstehung der Topoisomerleiter für beide Substrate erklären würde, ist in Abbildung 4.10 dargestellt. Hierbei wird postuliert, dass DEK durch seine Bindung fixierte, positive Supercoils einführt. Wie im Modell dargestellt, würde das für die proteinfreie DNA bedeuten, dass sie nach einem Proteinase K-Verdau positive Supercoils aufweisen würde. Bei den Minichromosomen dagegen würden die negativen Supercoils, die durch die Nukleosomen entstanden sind, durch die positiven, die DEK einführt, kompensiert werden. Ein Minichromosom würde also nach den einzelnen Behandlungen weniger negative Supercoils aufweisen als am Anfang. In den folgenden drei Abschnitten sollte nun dieses Modell überprüft werden.

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Abbildung 4.10: Modell

Modell für die Entstehung der Topologieveränderung. Auf der linken Seite ist die proteinfreie DNA dargestellt, auf der rechten Seite die Situation für die Minichromosomen. (+5): fixierte positive Supercoils; +5: nicht fixierte positive Supercoils, (-10): fixierte negative Supercoils; -10: nicht fixierte negative Supercoils; blaue Kreise: DEK Protein; rote Kreise: Nukleosomen.

4.6.1 Reversibilität

Eine erste Voraussetzung für die Richtigkeit des Modells ist, dass die Supercoils fixiert sind, d. h. wenn DEK gebunden ist, sollten sie nicht durch Topoisomerase I relaxiert werden können. Um dies zu überprüfen, wurden zwei DNA-Substrate hergestellt, zum einen welche an die DEK noch gebunden ist und zum anderen solche, von denen DEK entfernt wurde. Die Produkte wurden dann wieder mit Topoisomerase I behandelt und auf einem Agarosegel analysiert. Um sicherzustellen, dass die Herstellung dieser Substrate keinen Einfluss auf die Aktivität der Topoisomerase I hat, wurde proteinfreie DNA, ohne Inkubation mit DEK, unter gleichen Bedingungen behandelt (Abbildung 4.11, B Kontrolle). Aus Abbildung

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4.11, B ist ersichtlich, dass die Substrate, von denen DEK entfernt wurde, wieder vollständig in Form II-DNA überführt werden können (Abbildung 4.11 B, Spur 7).

Dagegen kann die DNA, die DEK noch gebunden hat, durch Topoisomerase I nicht relaxiert werden (Abbildung 4.11 B, Spur 3). Dieses Ergebnis ist ein eindeutiger Hinweis darauf, dass die Supercoils durch DEK fixiert werden. Darüber hinaus kann man die Aussage machen, dass die, durch DEK induzierte, Topologieveränderung reversibel ist.

Abbildung 4.11: Behandlung von DEK-depletierter DNA mit Topoisomerase I

A: Modell. (+5): fixierte positive Supercoils; +5: nicht fixierte positive Supercoils, blaue Kreise: DEK Protein. B: DEK-gebundene SV40 DNA wurde mit Proteinase K (-DEK) oder mit Puffer (+DEK) behandelt. Die DNA wurde mittels Chloroform-Phenol-Extraktion und Ethanolfällung aufgereinigt. Die DNA wurde dann wieder mit (+)Topoisomerase I oder mit Puffer allein (-) behandelt. Zur Kontrolle wurde proteinfreie DNA unter gleichen Bedingungen behandelt (Kontrolle). Die Ansätze wurden mit Proteinase K verdaut und einer Ethanolfällung unterzogen. Die DNA-Topologie wurde auf einem 0,8%-igem Agarosegel (0,5x TBE, 2V/cm, 16h) analysiert. I: supergecoilte DNA, II: geschlossen relaxierte oder genickte DNA.

Die gleiche Prozedur sollte nun mit Minichromosomen durchgeführt werden. Um nur DEK, nicht aber die Histone, von den Minichromosomen zu entfernen, wurden Glyceringradienten, die 700 mM NaCl enthielten, verwendet. Bei diesen Bedingungen bleiben die Histone an der DNA gebunden (Daten nicht gezeigt), DEK dagegen wird vom Chromatin entfernt und sedimentiert in den ersten Fraktionen (Abbildung 4.12, 700 mM Mc mit DEK, vgl. DNA-Analyse und Western blot). Das

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Sedimentationsverhalten entspricht in diesem Fall genau dem von freiem DEK (Abbildung 4.12, 700 mM freies DEK). Die Substrate, an denen DEK noch gebunden ist, wurden ebenfalls über Gradienten gereinigt, die aber in diesem Fall 100 mM NaCl enthielten. Das sind Bedingungen bei denen DEK an den Minichromosomen gebunden bleibt, denn DEK sedimentiert exakt in den gleichen Fraktionen wie die DNA (Abbildung 4.12, 100 mM Mc mit DEK, vgl. DNA-Analyse und Westernblot). Die Topoisomerleiter bleibt sowohl bei den depletierten als auch bei den DEK-gebundenen Minichromosomen erhalten (Abbildung 4.12, Mc mit DEK, vgl. 100 mM und 700 mM). Wenn das Modell in Abbildung 4.10 korrekt ist, kann das im Fall der DEK-depletierten Minichromosomen nur möglich sein, wenn die zugesetzte Topoisomerase I zusammen mit DEK abgetrennt wurde, denn ansonsten würden die fixierten Supercoils frei und somit von der Topoisomerase I relaxiert werden. Dass dies tatsächlich der Fall ist, konnte mit einem Topoisomerase I-Aktivitätstest der einzelnen Fraktionen nachgewiesen werden. Hierfür wurde jede Fraktion mit einem kleineren Plasmid (Litmus) inkubiert und auf den Toplogiestatus hin analysiert. Es zeigte sich, das die Topoisomerase-Aktivität in den ersten Fraktionen zu finden ist, nicht aber in den Minichromosomen-enthaltenden Fraktionen (Daten nicht gezeigt).

Es fällt ausserdem auf, dass sich das Sedimentationsverhalten der Minichromosomen in Gegenwart von DEK verändert. Minichromosomen, die kein DEK gebunden haben, sedimentieren mit einem S-Wert von ca. 50 S in Fraktion 12 (Abbildung 4.12, Mc ohne DEK 100 mM), während DEK-gebundene Minichromosomen um zwei Fraktionen nach unten verschoben sind (Abbildung 4.12, Mc ohne DEK 100 mM). Die DEK-depletierten Minichromosomen dagegen sedimentieren exakt in den gleichen Fraktionen wie die Minichromosomen, die nie DEK gebunden hatten (Abbildung 4.12, 700 mM vgl. Mc mit DEK und Mc ohne DEK).

Dieser Effekt wird später noch genauer untersucht (Kapitel 4.8.1). Für den folgenden Versuch ist es aber wichtig festzuhalten, dass die beiden gewünschten Substrate, DEK-gebundene und DEK-depletierte Minichromosomen, zur Verfügung stehen.

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Abbildung 4.12: Topologie nach Entfernung von DEK von Minichromosomen

SV40 Minichromosomen wurden in Anwesenheit von Topoisomerase I mit (Mc mit DEK) und ohne DEK (Mc ohne DEK) für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Ansätze wurden auf Glyceringradienten (10%-35%, 3 h, 40000rpm, SW40), die entweder 100 mM NaCl oder 700 mM NaCl enthielten, aufgetrennt. Die DNA-Topologie wurde auf einem Agarosegel, das Sedimentationsverhalten des DEK-Proteins wurde mittels PA-Gel, Westernblot und Immunfärbung, ermittelt. Das Sedimentationsverhalten von Minichromosomen-gebundenem DEK wurde mit freiem DEK (freies DEK) verglichen. Hierfür wurde gereinigtes GST-DEK ohne Minichromosomen unter gleichen Bedingungen inkubiert. Bei den Versuchen mit freiem DEK wurde kein Load aufgetragen I:

supergecoilte DNA, II: geschlossen relaxierte oder genickte DNA.

Um zu untersuchen, ob die Reaktion auch bei den Minichromosomen reversibel ist, wurden die Fraktionen, die Minichromosomen enthielten, vereinigt und gegen einen geeigneten Puffer dialysiert und dann mit Topoisomerase I inkubiert. Die DEK-depletierten Minichromosomen werden in Gegenwart von Topoisomerase I vollständig in Form I-DNA überführt (Abbildung 4.13, B Spur 7), während die DEK-gebundenen Minichromosomen noch die vollständige Topoisomerleiter zeigen (Abbildung 4.13, B Spur 3). Festzuhalten ist also, dass auch die Reaktion mit Minichromosomen reversibel ist und die Supercoils ebenso wie bei der proteinfreien DNA (Abbildung 4.11) auch bei den Minichromosomen durch DEK fixiert werden.

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Abbildung 4.13: Behandlung von DEK-depletierten Minichromosomen mit Topoisomerase I A: Modell. (+5): fixierte positive Supercoils; +5: nicht-fixierte positive Supercoils, (-10): fixierte negative Supercoils; -10: nicht-fixierte negative Supercoils; blaue Kreise: DEK-Protein; rote Kreise:

Nukleosomen. B: Die Fraktionen der 100 mM NaCl (+DEK) und 700 mM NaCl (-DEK) Gradienten wurden vereinigt und gegen nE100-Puffer dialysiert. Die DNA wurde dann mit (+hTopo I) oder mit Puffer allein (-hTopo I) behandelt. Zur Kontrolle wurde proteinfreie DNA auf Gradientenbedingungen eingestellt und genau gleich behandelt (Kontrolle). Nach einem Proteinase K-Verdau wurde die DNA Ethanol-gefällt und auf einem 0,8%-igem Agarosegel (0,5x TBE, 2 V/cm, 16 h) analysiert.