2. Ergebnisse
2.1 In situ Charakterisierung des thymischen Stromas in Wildtyp- und CCR7 -/- -Mäusen –
2.1.1 Die charakterisierten Zellpopulationen
Das Interstitium des Thymus besteht unter anderem aus dendritischen Zellen, Makrophagen und Stroma-, bzw. Epithelzellen. Diese letztgenannten Zellen besitzen die besondere Fähigkeit, als einzige Epithelzellen des Körpers ein dreidimensionales Netzwerk ausbilden zu können, welches eine funktiologisch wichtige Umgebung für die T-Zell-Entwicklung bietet (van Ewijk et al., 1999). Ein besonderes Merkmal dieser Epithelzellen ist die Expression von Keratinen. Im Thymus können auf Grund der Keratinexpression verschiedene Untergruppen von Epithelzellen unterschieden werden (Klug et al., 1998 und 2002). Kortikale Epithelzellen exprimieren Keratin 8 (K8) und 18 (K18), medulläre Epithelzellen hingegen Keratin 5 (K5) und 14 (K14). Darüber hinaus gibt es neben den Keratinen noch weitere Marker, die die Identifizierung von Epithelzell-Untergruppen ermöglichen. Dazu gehören das Epithelzell-Adhäsionsmolekül (Ep-CAM), welches durch den Antikörper G.8.8 angefärbt werden kann, sowie das Lektin Ulex europaeus agglutinin-1 (UEA-1). Beide binden ausschließlich an eine Subpopulation der medullären Epithelzellen.
Um den Phänotyp der Epithelzellen im Thymus von Wildtyp- und CCR7-defizienten Mäusen vergleichen zu können, wurden Kryoschnitte der Thymi angefertigt und mit verschiedenen Antikörpern gegen die erwähnten Oberflächenmoleküle gefärbt. Für die Färbungen wurden vier Tiere von jedem Mausstamm präpariert und pro Färbung jeweils die unversehrtesten vier Objektträger à zwei bis drei Thymusschnitte verwendet. Diese Angaben gelten für alle histologischen Färbungen.
2.1.2 Kortex und Medulla - K8+ und K14+
Wie in Abb. 2a und b dargestellt, verdeutlicht die Färbung mit den Antikörpern gegen K8 und K14 die zwei anatomischen Hauptbereiche des Thymus, den Kortex (in grün) und die Medulla (in rot). Keratin 8 wird hauptsächlich von den Epithelzellen des Kortex exprimiert.
Die Immunfluoreszenzfärbung in Abb. 2c, d erlaubt die Morphologie dieses
Epithelzell-2. Ergebnisse 23
Subtypus nachzuvollziehen. Es handelt sich hierbei um längliche, verzweigte, sternförmige Zellen, die eine netzgitterartige Struktur bilden. Keratin 14 wird hingegen ausschließlich von den Epithelzellen der Medulla exprimiert und kennzeichnet dadurch deutlich den medullären Bereich. In den Wildtypmäusen ist dieser großflächig miteinander verbunden und eher in der Mitte eines Thymuslappens zu finden. Im Gegensatz dazu besteht die Medulla in CCR7-/- -Mäusen aus vielen kleineren Anteilen, die überall im Läppchen verteilt sind.
Darüber hinaus wurde eine weitere medulläre Epithelzell-Subpopulation, welche beide Keratin-Moleküle gleichzeitigt exprimiert, mittels Immunfluoreszenz identifiziert (gelb in der Detailaufnahme, Überlagerung von grün und rot, Abb. 2c, d). Diese K8+K14+-Zellpopulation weist eine weniger verzweigte Morphologie auf und entspricht einer der medullären Sub-Population, die von Klug und Kollegen (2002) beschrieben wurde.
Obwohl diese drei Hauptpopulationen der Epithelzellen sowohl im Thymus von Wildtyp- als auch im Thymus von mutanten Mäusen vorhanden sind, unterscheidet sich die Morphologie der Medulla eindeutig innerhalb beider Mausstämme. Dementsprechend bestätigt die vorliegende Immunfluoreszenzfärbung die Phänotypen, die bei der Hämatoxylin/Eosin Färbung bereits beschrieben wurden. (Vergleich mit Abb.1).
2. Ergebnisse 24
Wildtyp
K8 K14
CCR7-/-Abb. 2: Keratinexpression in Thymi von Wildtyp- (a, c) und CCR7-defizienten (b, d) Mäusen. Kryoschnitte von Thymi gefärbt mit Antikörpern gegen Keratin 8 (grün), welches von den Thymusepithelzellen im Kortex (cTEC) exprimiert wird und Keratin 14 (rot), das nur die medullären Thymusepithelzellen (mTEC) exprimieren.
Die Detailaufnahmen c und d zeigen das Vorhandensein von beiden K14+ (rot) und K14+K8+ (gelb, Überlagerung von rot und grün) medullären Epithelzellpopulationen im Thymus von Wildtyp (c) und CCR7-/--Mäusen (d) .
d
c d
b
500µm 500µm
a
2. Ergebnisse 25
2.1.3 Medulläre Epithelzell-Subpopulation - K8+K5+
Klug et al. (1998, 2002) beschreiben zwei mTEC Populationen im Thymus von Wildtyp-Mäusen, welche K5 exprimieren. Die Hauptpopulation koexprimiert K5 und K14 und grenzt die medullären Bereiche gegenüber dem Kortex ab. Zusätzlich wird Keratin 5 von einer kleineren Population exprimiert, die doppelt positiv für K5 und K8 ist. Diese Minor-Population befindet sich normalerweise ausschließlich im Grenzübergang zwischen Kortex und Medulla, dem sogenannt kortiko-medullären Übergang (cortico medullary junction, CMJ). An dieser Stelle treten die Knochenmarksprogenitoren für die T-Zell-Reifung in den Kortex ein (Lind et al., 2001; Misslitz et al., 2006).
Um zu überprüfen, ob diese Populationen auch im Thymus von CCR7-defizienten Mäusen vorhanden sind, wurde in der nächsten Färbung Keratin 5 anstelle des Keratins 14 als medullärer Marker verwendet (Abb. 3). Interessanterweise weist die Verteilung von K5+ Thymus-Epithelzellen erhebliche Unterschiede zwischen beiden Mausstämmen auf.
Wildtyp K8 K5 CCR7
-/-Abb. 3 a, b: Keratinexpression in Thymi von Wildtyp- (a) und CCR7-defizienten (b) Mäusen. Kryoschnitte von Thymi gefärbt mit Antikörpern gegen Keratin 8 (grün), welches von cTEC exprimiert wird und Keratin 5 (rot), das vorwiegend die mTEC exprimieren. Bei beiden Mausstämmen ist die K8+K5+-Population um die Medulla herum vorhanden (gelb). Diese Population ist jedoch im Thymus der mutanten Maus stärker ausgeprägt. Darüber hinaus sind die Protusionen der doppelt positiven Epithelzellen an der CMJ, die in die kortikalen Bereiche hinein reichen, auch in der CCR7-/--Mausviel markanter ausgebildet (Pfeile).
a
2. Ergebnisse 26
Im Abb. 3 ist die schon beschriebene Hauptpopulation (K5+K14+) durch die einfach-Rotfärbung (K5+) sichtbar, da K14 nicht mit gefärbt wurde. Diese definiert die medullären Bereiche (umrandete Fläche, M) und ist gleichermaßen im Thymus von CCR7-/--Mäusen vorhanden. In der Medulla verteilt sind auch einzelne grün angefärbte Zellen in beiden Mäusen zu erkennen. Diese entsprechen der bereits beschriebenen K14+K8+ -mTEC-Subpopulation, welche in Abb. 2c und d dargestellt sind. Die K8+K5+-Population (gelb) ist im Thymus von Wildtypmäuse wie erwartet um die Medulla herum erkennbar (Abb. 3a, Pfeile).
In der knock-out Maus hingegen, streckt sich diese Population deutlich weiter in den Kortex hinein (Abb. 3b, Pfeile). Zusätzlich bilden die K8+K5+-Zellen im CCR7-defizienten Thymus Protusionen, die weiter verzweigt sind als die des Wildtyp-Thymus. Dieses Ergebnis legt die Vermutung nah, dass das Fehlen von CCR7 die Differenzierung von Thymusepithelzellen beeinträchtigt.
2.1.4 Medulläre Epithelzell-Subpopulationen - K8-G8.8+ und K8+G8.8+
Um den Epithelzell-Phänotyp von CCR7-defizienten Thymi weiter charakterisieren zu können, wurde zusätzlich zum Antikörper gegen K8 (grün) der Antikörper G8.8, welcher das Epithelzell-Adhäsionsmolekül Ep-CAM erkennt (rot), hinzugenommen. Das Ergebnis ist in Abb. 4 dargestellt. Der Antikörper G8.8 (rot), der Ep-CAM anfärbt, kennzeichnet deutlich die medullären Bereiche. Da bei der Wildtypmaus (Abb. 4a) die Medulla etwas lockerer gepackt ist, kann man eindeutiger erkennen, dass zwei G8.8-exprimierende Populationen in der Medulla zu finden sind. Eine Population ist K8-G8.8+ (rot), die andere Population ist K8+G8.8+ (gelb). Die K8+G8.8+-Zellen weisen eher eine schollige Form auf und befinden sich mehr am äußeren Rand der Medulla (Abb. 4a und b, Pfeile). Dies ist in Wildtyp- und knock-out Maus der Fall. Bei der CCR7-defizienten Maus sind die Konturen der einzelnen Ep-CAM+-Zellen jedoch oft nicht vollständig erkennbar, da die Zellen in der Medulla kompakter angeordnet sind und sich oft überlagern (Abb. 4b).
2. Ergebnisse 27
Wildtyp K8 Ep-CAM CCR7-/-
Abb. 4: Keratin- und Ep-CAM-Expression in Thymi von Wildtyp (a) und CCR7-defizienten (b) Mäusen. Kryoschnitte von Thymi gefärbt mit Antikörpern gegen Keratin 8 (grün) und Ep-CAM (Epithelzell-Adhäsionsmolekül, rot), welches nur die medullären Epithelzellen exprimieren. Wie erwartet färbt der G8.8 Antikörper ausschließlich die medullären Bereiche an. Da im Wildtypthymus (a) die mTEC nicht so dicht aneinander liegen, wird gut sichtbar, dass die medullären K8+ Ep-CAM+-Zellen eher eine schollige Form aufweisen und sich mehr am äußeren Rand der Medulla befinden (Pfeile, beispielweise). In der CCR7-/--Maus ist die Zellenform wegen der kompakteren Medullastruktur weniger gut zu erkennen.
b
500µm
a
500µm
2. Ergebnisse 28
2.1.5 Medulläre Epithelzell-Subpopulationen - K5+Ep-CAM+ und K8+K5+Ep-CAM+ Um den Phänotyp der K8+K5+-Zellen weiter zu untersuchen, wurden die folgenden Thymusschnitte mit Antikörpern gegen K8, K5 und Ep-CAM angefärbt. In Abb. 5 ist in blau Keratin 8, Keratin 5 in grün und Ep-CAM, durch den Antikörper G8.8 angefärbt, in rot dargestellt. Die kortikalen K8+-Epithelzellen lassen ihre Morphologie durch die blaue Färbungwieder sehr gut nachvollziehen. Die K8+K5+-Epithelzellen kommen auch in dieser Färbung (in türkis, Überlagerung von blau und grün) klar zu Geltung, wie sie sich von der CMJ leicht (beim Wildtyp, Abb. 5a) und deutlich (bei der CCR7-/-, Abb. 5b) in den Kortex erstrecken.
Interessanterweise ist zu bemerken, dass gerade in der äußeren Medullaregion, in der die meisten einfach-Ep-CAM+-Zellen liegen, auch viele K5+Ep-CAM+ Epithelzellen ansässig sind. Diese Zellen erscheinen in gelb (Überlagerung von grün und rot). Hierbei ist darauf hinzuweisen, dass nicht nur die größeren scholligen, sondern auch einige, die typisch länglich verzweigte Epithelzellstruktur aufweisende Zellen, im Randbereich gelb leuchten. Sogar dreifach-positive Zellen (K8+K5+G8.8+, weiß) sind eindeutig im Thymus beider Mausstämme zu erkennen.
Ein Unterschied zwischen beiden Mäusen wird dennoch sichtbar. In der Wildtypmaus (Abb.
5a) sind in fast jeder medullären Region einfach positive K5+-Zellen sichtbar (grün, Pfeile).
Diese sind in der mutanten Maus (Abb. 5b) stark vermindert. Das Fehlen dieser Population lässt die einzelnen medullären Bereiche im Thymus der CCR7-/--Maus an Ep-CAM+-Zellen reicher erscheinen. Zusammengefasst deuten die Ergebnisse daraufhin, dass die Entwicklung des medullären, im Gegensatz zum kortikalen Epithelium, durch die Abwesenheit von CCR7 als unvollendeter erscheint.
2. Ergebnisse 29
Wildtyp K8 K5 Ep-CAM CCR7
-/-Abb. 5: Keratin- und Ep-CAM-Expression in Thymi von Wildtyp- (a) und CCR7-defizienten (b) Mäusen. Kryoschnitte von Thymi gefärbt mit Antikörpern gegen Keratin 8 (blau), Keratin 5 (grün) und Ep-CAM (rot). Im Gegensatz zu der Keratin 8-Expression, die in beiden Mausstämmen morphologisch gleich ist, sind die Protusionen der K8+K5+-Epithelzellen (türkis, Überlagerung von blau und grün) im Kortex der CCR7-/--Thymus viel deutlicher zu erkennen. In beiden Mausstämmen wiederum sind K5+Ep-CAM+ (gelb, Überlagerung von grün und rot) sowie K8+K5+Ep-CAM+ (weiß, Überlagerung von blau, grün und rot) -mTEC gleichermaßen sichtbar. Im Wildtyp-Thymus (a) sind des Weiteren auch viele einfach K5+-mTEC erkennbar (grün, dünne Pfeile), die inmitten der Medulla liegen. Diese scheinen bei der mutanten Maus (b) vermindert zu sein. Die dicken Pfeile in (b) weisen auf ein Artefakt im Schnitt und nicht auf eine reale grün-Färbung.
2.1.6 Negativ selektierende medulläre Epithelzellen - UEA-1+Ep-CAM+
Wie in der Einleitung erwähnt, unterscheiden sich die kortikalen und medullären Epithelzellen in ihrer Funktion erheblich. Kortikale Epithelzellen spielen eine wichtige Rolle in der positiven Selektion von heranreifenden Thymozyten. Die medullären Epithelzellen hingegen sind essentiell notwendig für die negative Selektion von autoreaktiven T-Zellen.
Diesbezüglich zeigten Kurobe et al. (2006) und Davalos-Misslitz et al. (2007), dass CCR7-/- -Mäuse eine Neigung zur Entwicklung von Autoimmunitäten besitzen. Es stellte sich somit die Frage, ob im Thymus von CCR7-defizienten Tieren die mTEC-Subpopulationen, die die negative Selektion betreiben, vorhanden sind.
500µm
a b
500µm
2. Ergebnisse 30
Gray et al. (2006) und Derbinski et al. (2005) fanden heraus, dass mTEC, die eine hohe Expression von MHC-Klasse-II oder CD80-Moleküle auf ihre Oberfläche aufweisen, diejenigen Zellen sind, die für den Vorgang der negativen Selektion besonders wichtig sind.
Diese Zellen lassen sich auch an der Höhe des Transkriptionsfaktors AIRE (autoimmune regulator) ermitteln, da die Expression der meisten gewebespezifischen Antigenen in den mTEC abhängig vom Vorhandensein des AIRE ist (Liston et al., 2003; Derbinski et al., 2005). Leider stand mir zum Zeitpunkt dieser Arbeit noch kein käuflicher Antikörper gegen AIRE zur Verfügung. Mir war dennoch eine indirekte Identifizierung dieser Zellen möglich, da die mTEC, die gewebespezifische Antigene präsentieren, auch Ep-CAMexprimierenund gleichzeitig das Lektin UEA-1 binden (Derbinski et al. 2001; Gillard et al., 2007).
Diese Zellen werden in Abb.6 untersucht. Die cTEC (K8+-Zellen) sind in blau
Abb. 6: Keratin- und Ep-CAM-Expression sowie UEA-1-Bindung in Thymi von Wildtyp- (a) und CCR7-defizienten (b) Mäusen. Kryoschnitte von Thymi gefärbt mit Antikörpern gegen Keratin 8 (blau), UEA-1 (Ulex europaeus agglutinin-1, grün), ein Lektin, welches nur spezifische Kohlenhydratstrukturen auf einigen medullären Epithelzellen bindet und Ep-CAM (rot). Die doppelt positiven mTEC UEA-1+Ep-CAM+ (gelb, Überlagerung von grün und rot, Pfeile) spielen bei der negativen Selektion der SP-Thymozyten eine wichtige Rolle. Sie sind in beiden Mausstämmen sichtbar, wirken jedoch bei der CCR7-/--Maus zahlreicher, was durch die kompaktere Medulla-Struktur nur den Anschein macht.
500µm
a
500µm
b
2. Ergebnisse 31
Klug et al. (1998) definierten zwei medulläre Epithelzell-Untergruppen, bei denen eine für UEA-1 und Ep-CAM+ doppelt positiv färbt. Diese Subpopulation befindet sich eher in den äußeren Bereichen der Medulla. Unsere Ergebnisse bestätigen diese Beobachtung, da die Bindung von UEA-1 an Epithelzellen hauptsächlich in den äußeren medullären Bereichen zu sehen ist. Dort befinden sich sowohl UEA-1+ (grün) als auch UEA-1+Ep-CAM+ doppelt positive mTEC (gelb, Überlagerung von grün und rot, Abb. 6a Pfeile). Diese doppelt positiven Zellen haben eine eher rundliche Form, im Gegensatz zu den nur UEA-1 bindenden grünen Zellen, die mehr zum verzweigten, netzartigen Aufbau der meisten Epithelzellen tendieren.
Beide Zelltypen sind auch deutlich im Thymus von der CCR7-/--Maus vorhanden (Abb. 6b Pfeile). Die doppelt positive Population scheint in der Mutante dem Wildtyp mengenmäßig sogar überlegen, nichtsdestotrotz sind auch sie mehr am äußeren Rand der Medulla lokalisiert und haben dieselbe Morphologie. Zwischen den UEA-1+Ep-CAM+ doppelt-positiven Zellen sind in der CCR7-/--Maus immer wieder nur UEA-1+-Zellen zu erkennen (grün, Abb. 6b). Ihre Form ähnelt der verzweigten der Wildtypmaus. Die Ergebnisse von Abb. 6 zeigen, dass die Epithelzellen, die für die negative Selektion notwendig sind, auch im Thymus von CCR7-defizienten Mäusen vorhanden sind, trotz des offensichtlichen Defektes in der mTEC-Entwicklung.
2.1.7 MHC-Klasse-II-Moleküle in Kortex und Medulla
Da offenbar die zur positiven und negativen Selektion benötigten Zellen im Thymus von CCR7-/--Mäusen zu finden sind, stellte sich mir nun die Frage, ob diese Zellen auch funktionell gleichwertig zu denen der Wildtyp-Tiere sind. Aus diesem Grund habe ich die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen (MHCII) (Abb. 7) und des kostimulatorischen Moleküls CD86 (Abb. 8) auf den Thymusepithelzellen beider Mausstämme untersucht, da diese Moleküle für die Antigenpräsentation und somit für die negative Selektion von reifenden Thymozyten unabdingbar sind.
Wie in Abb. 7a und b dargestellt, kann die Expression der MHCII-Moleküle im Thymus von beiden, Wildtyp- und CCR7-defizienten, Mäusen nachgewiesen werden. Die kortikalen Epithelzellen sind blau (K8+-Zellen), die medullären rot (K5+-Zellen) dargestellt. Wie erwartet, werden sowohl im Kortex als auch in der Medulla MHCII (grün) exprimierende Zellen beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt, dass positive Selektion im Kortex, bzw., negative Selektion in der Medulla, sowohl im Wildtyp als auch in der mutanten Maus, von MHCII+
-2. Ergebnisse 32
Zellen vermutlich gewährleistet werden kann. Auffallend ist jedoch, dass in der Medulla der CCR7-/--Mäuse eine höhere Anzahl von K5+MHCII+-Zellen (gelb), sowie K8+K5+MHCII+ -Zellen (weiß)pro medullärer Fläche vorhanden ist (Abb. 7b und Detailaufnahme 7d). Dies ist möglicherweise auf der dichtere Anordnung der Zellen in der Medulla von CCR7-/--Mäusen zurückzuführen. Bei den K5-MHCII+-Zellen (grün) in der Medulla wird es sich wahrscheinlich um die thymischen dendritischen Zellen handeln.
Wildtyp K8 K5 MHCII CCR7-/-
Abb. 7: Keratin- und MHCII-Expression in Thymi von Wildtyp- (a, c) und CCR7-defizienten (b, d) Mäusen. Kryoschnitte von Thymi gefärbt mit Antikörpern gegen Keratin 8 (blau), Keratin 5 (rot) und dem MHCII-Molekül (grün). Auffallend ist die vermehrte Anzahl von K5+MHCII+- (gelb, Überlagerung von rot und grün), sowie K8+K5+MHCII+- (weiß, Überlagerung von blau, grün und rot) Zellen in der Medulla der CCR7-defizienten Maus (b).
Detailaufnahme der medulläre Bereichen (c, d): Die dünnen Pfeile zeigen auf die K5+MHCII+mTEC (gelb), die dicken Pfeile auf die K8+K5+MHCII+ mTEC (weiß). Beide Zellarten scheinen im CCR7-defizienten Thymus (d) in höherer Anzahl vorhanden zu sein.
a a
200µm
a
200µm
b
c d
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2.1.8 Kostimulatorisches Molekül CD86 in Kortex und Medulla
Während der positiven und negativen Selektion müssen die sich entwickelnden T-Zellen durch ihren T-Zell-Rezeptor stimuliert und aktiviert werden. Diese T-Zell-Aktivierung benötigt zusätzlich zu der TCR/MHC-Bindung noch weitere Signale, die von sogenannten kostimulatorischen Molekülen vermittelt werden. Bei den hierbei bedeutenden kostimulatorischen Molekülen handelt es sich um die Glykoproteine CD80 und CD86.
In Abb. 8 wird das Expressionsmuster des kostimulatorischen Moleküls CD86 im Thymus von Wildtyp- und mutanter Maus verglichen. Dargestellt werden die kortikalen Epithelzellen in blau (K8+-Zellen), die medullären in grün (K5+-Zellen) und das kostimulatorische Molekül CD86 in rot. CD86+-Zellen sind bei beiden Mäusen sowohl im Kortex als auch in der Medulla zu finden. Wie erwartet sind sie, wie die MHCII+-Zellen, bei beiden Mausstämmen auch vermehrt in der Medulla zu beobachten, da dort die negative Selektion stattfindet. Interessanterweise ist eine Minderheit der CD86 exprimierenden Zellen in der Medulla zusätzlich K5+ (gelb, Überlagerung von rot und grün, dünne Pfeile in Detailaufnahme 8c, d). Diese eher verzweigten gelben Zellen sind sowohl im Wildtyp- als auch in der knock-out Maus zu erkennen. In Gegensatz dazu sind die kugelförmigen K5-K8+- Zellen häufig CD86+ (violett, Überlagerung von rot und blau, dicke Pfeile in Detailaufnahme 8c, d). Auch die violetten Zellen sind gleichermaßen in beiden Mäusen vorhanden. Die kugelige Morphologie der violetten Zellen deutet darauf hin, dass ein Teil der CD86+-Zellen in der Medulla zu der K8+K5-UEA-1+-Population (Abb. 6a und b) gehört, die diese rundliche Form besitzt und maßgeblich an der negativen Selektion beteiligt ist.
2. Ergebnisse 34
Wildtyp K8 K5 CD86 CCR7-/-
Abb. 8: CD86-Expression im Thymus-Epithelzellen von Wildtyp- (a, c) und CCR7-defizienten Mäusen (b, d). Kryoschnitte von Thymi mit Antikörpern gefärbt gegen Keratin 8 (blau), exprimiert von den Thymusepithelzellen im Kortex, Keratin 5 (grün), hauptsächlich auf den medullären Epithelzellen zu finden, sowie gegen CD86, ein kostimulatorisches Molekül, welches u. a. die antigenpräsentierenden Epithelzellen tragen. In den Medullae beider Mausstämme sind wenige K5+CD86+ Zellen zu sehen (gelb, Überlagerung von grün und rot). Zahlreich überlegen sind die K8+K5-CD86+ Zellen (violett, Überlagerung von blau und rot), die sowohl in der Medulla als auch im Kortex aufzufinden sind. Diese Zellen spielen bei der positiven und negativen Selektion eine tragende Rolle.
Detailaufnahme der medullären Bereiche von Wildtyp- (c) und mutanten Mäusen (d). Die dünnen Pfeile zeigen auf die wenigen K5+CD86+-mTEC (gelb), die dicken Pfeile auf die K8+CD86+-mTEC (violett). Beide Zellarten sind im Thymus beider Mausstämme gleichermaßen wenig, bzw., viel vorhanden.
a b
d b
200µm
c a
200µm
2. Ergebnisse 35
2.1.9 Medullären antigenpräsentierende Epithelzellen - UEA-1+CD86+
Um zu überprüfen, ob die K5-CD86+-mTEC auch UEA-1 binden können, wurden die Thymusschnitte als nächstes mit Antikörpern gegen K5, CD86 und dem Lektin UEA-1 angefärbt. In Abb. 9 ist das Lektin UEA-1 in blau, K5 in grün und das kostimulatorische Molekül CD86 in rot dargestellt.
Es wird in Abb. 9 nun deutlich, dass viele der UEA-1+ Zellen (blau) auch CD86+ exprimieren (rot). Sie erscheinen violett (Überlagerung von blau und rot, Pfeile in Detailaufnahme 9c, d) und sind in beiden Mausstämmen gleichermaßen vorhanden. Aufgrund der Morphologie dieser Zellen, größer und kugeliger, sowie der Bindung von UEA-1 und der Expression von CD86, kann ich davon ausgehen, dass es sich hierbei um die medullären antigenpräsentierende Epithelzellen handelt, die am Vorgang der negativen Selektion beteiligt sind.
2. Ergebnisse 36
Wildtyp K5 UEA-1 CD86 CCR7-/-
Abb. 9: CD86-Expression im mTEC von Wildtyp- (a, c) und CCR7-defizienten (b, d) Mäusen. Kryoschnitte von Thymi gefärbt mit Antikörpern gegen Keratin 5 (grün), UEA-1 (blau) und CD86 (rot,). Bei den K5--mTEC, die CD86 (rot) exprimieren und zusätzlich UEA-1 (blau) binden, handelt es sich um die Zellen, die bei der negativen Selektion eine tragende Rolle spielen (violett, Überlagerung von rot und blau). Diese Zellen sind größer und kugelig und in der ganzen Medulla verteilt aufzufinden. Alle benannten Zellen sind in beiden Mausstämmen vorhanden.
In Detailaufnahme
(
c) und (d) sind diese Zellen mit weißen Pfeilen markiert.500µm
b
500µm
a
c d
2. Ergebnisse 37
2.1.10 CD86+-dendritische Zellen in Kortex und Medulla
Wie in Abb. 8 und 9 zu erkennen, ist der Hauptteil der CD86+ Zellen in der Medulla weder K5+ noch UEA-1+ (nur rot, keine Überlagerungen). Somit stellte sich mir die Frage, von welchen Zellart(en) CD86 weiterhin exprimiert wird. Da CD86 überdies von Monozyten, aktivierte B-Zellen und dendritische Zellen exprimiert wird, war für mich am ehesten ersichtlich, dass es sich hierbei um DC handelt, da Monozyten und B-Zellen kaum im Thymus zu finden sind. Thymische dendritische Zellen (TDC) spielen indessen neben medullären Epithelzellen eine wichtige Rolle in den Vorgängen der negativen Selektion (Hogquist et al., 2005). Dementsprechend habe ich nachfolgend die Expression von CD86 auf TDC überprüft. Für die Kennzeichnung der dendritischen Zellen wurde der Marker CD11c (grün) verwendet. Die Färbung in Abb. 10 demonstriert, dass TDC hauptsächlich in der Medulla ansässig sind. Wie erwartet, wird CD86 (rot) überwiegend von den TDC exprimiert (gelb, Überlagerung von rot und grün). CD86+-TDC sind in beide Mausstämmen zu beobachten.
Wildtyp CD11c CD86 CCR7-/-
Abb. 10: Dendritische Zellen und kostimulatorische Moleküle in Kortex und Medulla von Wildtyp- (a) und CCR7-defizienten (b) Mäusen. Kryoschnitte von Thymi gefärbt mit Antikörpern gegen CD11c, ein Oberflächenmarker für
Abb. 10: Dendritische Zellen und kostimulatorische Moleküle in Kortex und Medulla von Wildtyp- (a) und CCR7-defizienten (b) Mäusen. Kryoschnitte von Thymi gefärbt mit Antikörpern gegen CD11c, ein Oberflächenmarker für