Methoden

4.3.1 Immunfluoreszenz-Mikroskopie Grundprinzip

Bei dieser Methode werden acetonfixierte Kryoschnitte der Mäusethymi auf Objektträgern mit verschiedenen Antikörpern gefärbt, welche spezifisch nur die zu untersuchenden Zellstrukturen (Antigene) binden. Bei der direkten Immunfluoreszenzfärbung ist der Primärantikörper gleich an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt (konjugiert). Bei der indirekten Färbungsmethode wiederum wird im ersten Schritt ein unmarkierter oder Streptavidin-gekoppelter Primärantikörper verwendet, der im zweiten Schritt von einem mit Farbstoff konjugierten Sekundärantikörper abgegriffen wird. Die Fluoreszenzfarben werden nach der Färbung mit dafür geeigneten Filtern durch ein Fluoreszenzmikroskop sichtbar.

Dazu muss die jeweilige Fluoreszenzfarbe mit Licht in ihrer bestimmten Wellenlänge, zwischen 360 nm und 700 nm, angeregt werden, um die für sie typischen Fluoreszenzfarbe zu emittieren. Bei den in dieser Arbeit verwendeten Farbstoffen handelt es sich um:

- DAPI (4’,6-Diamidin-2’-phenylindol): 360 nm (Anregung) - 470 nm (Emission) - FITC (Fluoreszeinisothiocyanat): 480 +/- 40 nm - 535 +/- 50 nm

- TRITC (Rhodamin): 535 +/- 50 nm - 620 +/-60 nm - Cy3: 545 +/- 30 nm - 610 +/- 75 nm

- Cy5: 620 +/- 60 nm - 700 +/- 75 nm.

4.3.2 Herstellung und Färbung der Kryoschnitte

Für jeden Färbungsversuch wurden jeweils vier Mäuse beider Mausstämme verwendet. Den Mäusen wird nach Tötung durch CO2-Inhalation der Thymus entnommen und in der Hälfte durchtrennt. Jede Thymushälfte wird einzeln in OCT eingebettet und auf Trockeneis Schock gefroren. Mit dem Leica CM S Kryotom werden aus dem gefrorenen Block 8-9 μm dünne Kryoschnitte angefertigt und je zwei bis drei auf einen Objektträger aufgenommen.

Diese trocknen zunächst eine halbe Stunde an der Luft und werden anschließend für 10 Minuten in eiskaltem Aceton fixiert. Danach ist nochmaliges Trocknen von einer halben Stunde unter dem Abzug empfohlen. Für jede neue Färbung wurden pro Mausstamm jeweils

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vier Objektträger ausgesucht. Dafür wurden die getrockneten Objektträger unter ein invertiertes Mikroskop mit 10er Vergrößerung gelegt und nach Unversehrtheit der Schnittfläche ausgewählt.

Damit die Immunfluoreszenzfärbung gegen die unterschiedlichen Keratine und Oberflächenstrukturen erfolgen kann, werden die Schnitte nach eine halbe Stunde Trocknen unter dem Abzug für 10 Minuten in Kunststoff- oder Glasständern mit TBS/T rehydriert.

Danach werden die Objektträger mit Coverplates (Thermo Shandon) in Färbeschienen eingespannt. Der entstehende Raum zwischen Objektträger und Coverplate sorgt für eine dauerhafte Benetzung des Gewebes und enthält ein relativ kleines Volumen für die Antikörperlösungen (150 μl pro Schnitt).

Um unspezifisches Binden des Primärantikörpers zu vermeiden, werden die Kryoschnitte zwei Mal 15 Minuten mit 10% Serum (in TBS/T) der entsprechenden Spezies geblockt. Danach folgt eine 1,5 stündige Einwirkzeit des konjugierten, bzw., unmarkierten ersten Antikörpers in seiner jeweiligen Konzentration (in TBS/T). Nach der Einwirkzeit wird der Antiköper drei Mal mit TBS/T ausgewaschen. Danach folgt entweder die Inkubation mit dem Sekundärantikörper und 3% Serum (in TBS/T) für 15 Minuten oder bei schon konjugierten Erstantikörpern eine erneute Blockierung des nächsten Serums für zwei Mal 15 Minuten für eine weitere Färbung. Jede Färbung wird mit der zweiminütigen DAPI-Inkubation (1:10000 in TBS/T) die die Zellkerne unter dem Fluoreszensmikroskop sichtbar macht, beendet. Die DAPI-Verbindung lagert sich bevorzugt an AT-reiche Regionen in der kleinen Furche der DNA an. Die Schnitte werden erneut drei Mal mit TBS/T ausgewaschen, anschließend mit Mowiol beschichtet und mit einem Objektglas eingedeckelt.

Die Fluoreszensaufnahmen werden mit dem IX81 Mikroskop von Olympus angefertigt und mit der analysis^D software und adobe photoshop ausgewertet und bearbeitet.

4.3.3 Epithelzellisolierung

Der ganze Thymus wird nach Entnahme (s. o.) in 500 µl RPMI 1640-Medium in ein Well einer 6-Well-Platte gelegt und in kleinste Stücke geschnitten. Das Well wird auf ungefähr 10 ml RPMI/10% FCS aufgefüllt und zehn Minuten auf einem Magnetrührer gerührt. Bei diesem Vorgang werden die Thymozyten aus dem Gewebe geschwemmt. Der Überstand wird vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt, verworfen und die Auswaschung noch einmal mit der gleichen Menge Medium wiederholt.

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Danach wird der zerstückelte Thymus drei Mal 30 Minuten mit einer Collagenase/Dispase-Lösung (5mg Collagenase/Dispase in 10 ml RPMI 1640) bei 30°C auf einem Magnetrührer bei langsamen Umdrehungen inkubiert. Nach 30 Minuten wird der Überstand jedes Mal vorsichtig mit einer Pipette abgenommen und mit RPMI/10% FCS verdünnt auf Eis aufbewahrt. Beim zweiten und dritten Wechsel wird jeweils noch eine Spatelspitze DNAse in die Verdauungslösung dazugegeben. Die Überstände und Reststückchen werden anschließend durch ein 70 μm Nylonsieb filtriert, bzw. vorsichtig durchgedrückt, und 15 Minuten bei 1250 rpm zentrifugiert.

Der Überstand wird abgesaugt, das Pellet wird in 4 ml RPMI/5% FCS aufgenommen und auf einen Percoll-Gradienten geschichtet. [10 ml 70% Percoll: 7 ml Percollstock (10ml 10xPBS + 90 ml Percoll) und 3 ml Medium (RPMI/5% FCS); 10 ml 40% Percoll: 4 ml Percollstock und 6 ml Medium.]

Der geschichtete Percollgradient (von unten nach oben: 70% Percoll - 40% Percoll - Medium inklusive Epithelzellen) wird 20 Minuten bei 2000 rpm und 20°C ohne Beschleunigung und Bremse zentrifugiert. Die Epithelzellen sammeln sich in dem Ring zwischen dem Medium und der 40%-Percoll-Schicht an, die Thymozyten zwischen der 40%- und 70%-Schicht. Der Epithelzellen-Ring wird vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt, auf 10 ml mit RPMI/5% FCS aufgefüllt und für 10 Minuten bei 1250 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig abgesaugt und das Pellet wird in 1ml RPMI/5% FCS gelöst. Die Anzahl der gewonnenen Epithelzellen wird in einer Neubauer Zählkammer gezählt.

Anschließend erfolgt die Durchflusszytometrie-Färbung.

4.3.4 Neubauer-Zählkammer

Um die Zellzahl der isolierten Epithelzellen für die weiteren durchflusszytometrischen Färbungen zu ermitteln, wird ein ganz kleiner Teil der Epithelzelllösung im Verhältnis 1:10 mit 1%-iger Tryptanblaulösung verdünnt (zum Beispiel 2µl Epithelzelllösung in 20µl Tryptanblau). Tryptanblau färbt nur die toten Zellen blau an. Dadurch sind die lebenden Epithelzellen auf Grund der Farbe von den toten Zellen und auf Grund ihrer größeren Form gut von den kleineren Lymphozyten abgrenzbar. 10 μl dieser Mischlösung wird nun unter das Deckglas in die Neubauer-Zählkammer überführt. Zählt mal in allen vier Großquadraten der Neubauer-Zählkammer unter einem invertierten Mikroskop mit 10-er Vergrößerung die Epithelzellen durch, errechnet sich die Zellzahl pro ml:

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Mittelwert der Zellanzahl aller vier Großquadranten x 10⁴ (Volumenausgleich) x 10 (Verdünnungsfaktor) = Zellzahl/ml

4.3.5 Durchflusszytometrie Grundprinzip

Bei dieser Methode werden die Zellen aus einer mit Antikörpern angefärbten Zellsuspension in ein Zytofluorometer (in dieser Arbeit: LSRII) aufgesaugt und durch eine Kapillare in den sogenannten Mantelstrahl (sheath) gedrückt, der die Zellen beschleunigt und jede Zelle einzeln und in einem bestimmten Abstand in der Messkammer an einem Laser vorbeifließen lässt. Durch die Laserbestrahlung kommt es an jeder Zelle zu einer Lichtstreuung, welche dann Fotodetektoren (Fotomultipler) bei 180° (FSC = forward light scatter) und bei 90° (SSC = sideward light scatter) messen. An der Lichtablenkung kann dadurch die Größe (FSC) und Granularität (SSC) jeder Zelle ermittelt werden. Sind an der Zelle zusätzlich ein oder mehrere fluoreszierende Antikörper gebunden, emittieren diese bei Laserbestrahlung das Licht in ihrer bestimmten Wellenlänge und werden gesondert detektiert.

Die Intensität dieser Emission ist proportional zum Maß der Antikörperbindung und somit auch zur Antigenexpression auf der jeweiligen Zelloberfläche.

Alle Informationen der einzelnen Zellen werden von einem Computerprogramm (in dieser Arbeit: FACSDiva software/ CellQuest) erfasst und ausgewertet. Sichtbar werden die Zelleigenschaften in Form eines zweidimensionalen Punkt-Wolken-Diagramms (dot plots), in dem entweder eine einzelne Fluoreszenzintensität gegen die absolute Zellzahl oder zwei der jeweiligen Fluoreszenzfarben gegeneinander aufgetragen werden. Jeder Punkt im Diagramm stellt eine Zelle dar. Die unterschiedlichen Dichte-Anhäufungen der Punkte lassen Zelluntergruppen erkennen, die je nach Position im dot plot-Diagramm entweder für einen oder beide Antikörper positiv sind oder keines der gefärbten Oberflächenproteine exprimieren. Durch das Setzen eines “Gates“ werden die gewünschten Zellgruppen eingegrenzt, um von anderen Zelltypen oder von toten Zellen für die Analyse getrennt gewertet werden zu können. Desweiteren ist das Softwareprogramm unter anderem fähig, die Zellanzahl der Gruppen in jedem Gate zu ermitteln. Mit Negativ-Kontrollen ermittelt man die Eigenfluoreszenz (Autofluoreszenz) der Zellen und subtrahiert diese Störgrößen am Computer von der eigentlich gefärbten Fluoreszenz.

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4.3.6 FACS (fluorescent-activated-cell-scanner)-Färbung

Die Färbungen für die Durchflusszytometrie-Analysen erfolgen in einer 96-Wellplatte mit V-Form allzeit auf Eis. Von der gezählten Zelllösung der vorangegangenen Epithelzellisolierung (s. o.) wird die ausgerechnete Menge der Zellen, die man pro Well färben möchte, abgenommen, jeweils in die Wells pipettiert und vier Minuten bei 1250 rpm herunter zentrifugiert. Der Überstand wird abgeklopft, das am Boden der Wells haftende Epithelzellpellet mit 10% Serum (in 50μl RPMI/5%FCS) resuspensiert und für 15 Minuten blockiert, um unspezifisches Binden der folgenden Antikörper zu verhindern. Nach Zugabe von 50 μl RPMI/5%FCS, inklusive der doppelten Konzentration des gewählten Antikörpers, inkubiert die Lösung für weitere 15 Minuten. Anschließend wird mit 100 μl RPMI/5%FCS gewaschen (falls danach ein Steptavidin-Sekundär-Antikörper folgt, statt RPMI mit PBS/3%FCS) und vier Minuten auf 1250 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird abgeklopft.

Darauf folgt entweder eine erneute Blockierung mit dem jeweiligen Serum (10% in RPMI/5%FCS) für 15 Minuten oder die Inkubation mit einem Sekundärantikörper und 5%

Serum in RPMI/5%FCS (oder PBS%3%FCS) für ebenfalls 15 Minuten. Dem schließ sich ein Auswaschgang und Zentrifugation auf 1250 rpm für vier Minuten an. Nach allen Immunfluoreszenz-Färbeschritten erfolgt abschließend eine zweiminütige Färbung mit DAPI (1:20000), welches danach je zweimal mit RPMI/5%FCS ausgewaschen und zentrifugiert wird. Anschließend wird das Pellet mit 50-100 μl Medium resuspensiert, in eine Messpipette gefüllt und mit dem LSRII durchflusszytometrisch gemessen. Die Auswertung der Durchflusszytometriedaten erfolgt mit WinList 5.0.