Fehlerhafte Antigenpräsentation durch MHCII-Komplexe, kostimulatorische Moleküle

Obwohl die UEA-1⁺Ep-CAM⁺-Zellen in der thymischen Medulla von CCR7-defizienten Mäusen existieren, wäre es möglich, dass diese Zellen trotzdem nicht in der Lage sind, Antigene zu präsentieren. Für den effizienten Vorgang der negativen Selektion sind nicht nur die TCR seitens der Thymozyten, sondern auch die MHC-Komplexe und die kostimulatorischen Moleküle auf der Oberfläche der antigenpräsentierenden Zellen unabdingbar. Bei dem Vorgang der negativen Selektion geht der TCR/CD3-Komplex und der Ko-Rezeptor CD4 oder CD8 eine Bindung mit dem antigenpräsentierenden MHCII (bzw.

MHCI)-Komplex ein. Diese Bindung setzt eine Kaskade von Kinasen, Phosphatasen und Aktivierungen von weiteren zytosolischen Proteinen in Gang, die in der Induktion von Transkriptionsfaktoren münden. Diese wiederum induzieren im Zellkern eine spezifische Gentranskription, die zur Proliferation und Differenzierung der T-Zellen führt. Die kostimulatorischen Signale, die durch die Bindung von CD80/CD86 auf Seiten der APC und TEC an den CD28 seitens der T-Zellen nahe des TCR/MHC-Komplex ins Zellinnere geschickt werden, bewirken die zusätzliche, notwendige Stimulation zur klonalen Vermehrung der T-Zellen.

Eine weitere Möglichkeit, um die Beeinträchtigung der negativen Selektion in CCR7-defizienten Mäusen zu erklären, wäre somit, dass die Reifung der mTEC zu antigenpräsentierenden Zellen im Abwesenheit von CCR7-Signalen beeinträchtig ist. Aus diesem Grund wurde von mir das Vorhandensein von MHCII und kostimulatorischen Molekülen anhand qualitativer Analysen mittels Immunfluoreszenz untersucht. Die Vergleiche der beiden Mausstämme ergaben, dass kein signifikanter Unterschied im Expressionsmuster von MHCII-Komplexen und dem kostimulatorischen Molekül CD86 in beiden Mäusen beobachtet werden konnte (Abb. 7, 8 und 9).

Auch das Vorhandensein von thymischen dendritischen Zellen (TCD), sowie ihre Verteilung und ihre Expression von MHCII- und kostimulatorischen Molekülen in Wildtyp- und mutanten Thymi ist vergleichend überprüft worden (Abb. 10 und 12). Laut Wu et al.

(2005) existieren zwei Arten von DC im Thymus, die konventionellen (cDC) und die plasmazytischen (pDC) dendritischen Zellen. Den laufenden Ergebnissen nach entsteht der Hauptteil der cDC im Thymus und nur die Minderheit strömt aus dem Blut ein. Die Herkunft der pDC blieb vorerst unklar. Die Mehrheit der cDC exprimiert niedrige Level an AIRE und kann somit auch endogene Selbst-Antigene präsentieren. Außerdem haben die cDC die

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Fähigkeit, TSA von den mTEC zu übernehmen und diese den T-Zellen zu kreuzpräsentieren (Gallegos und Bevan, 2004). Meine Ergebnisse zeigen, dass auch bezüglich der DC die qualitativen Untersuchungen zwischen den beiden Mauslinien nicht voneinander abweichen (Abb. 10). Beide Thymi enthalten DC, die auch bei beiden Mausstämmen hauptsächlich in der Medulla zu finden sind. Diese dendritischen Zellen exprimieren des Weiteren in beiden Mauslinien auch das kostimulatorische Molekül CD86.

Um diese qualitativen Ergebnisse auch quantitativ bestätigen zu können, habe ich abschließend angestrebt, die TEC- und TDC-Populationen mittels durchflusszytometrischer Analysen zu verifizieren. Dieses gestaltete sich anfangs als unerwartet schwierig, da es nicht einfach war, ein geeignetes Protokoll zu etablieren, mit welchem sich bei jeder Präparation eine konstante Anzahl an thymischen Epithelzellen aus dem gesamten Thymus isolieren ließ.

Die TEC zeigten sich sehr empfindlich gegenüber Verdauung mit Collagenase/Dispase, Zentrifugation und Trennung durch einen Dichtegradienten und reagierten mit massivem Zellsterben.

Nach Etablierung eines geeigneten Protokolls ergab der Vergleich der MHCII-Expression auf cTEC, mTEC und TDC zwischen Wildtyp- und CCR7-defizienten Mäusen keinen signifikanten Unterschied. Der prozentuale Anteil der kortikalen und medullären Epithelzellen, die MHCII exprimieren, ist nur leicht zu Gunsten der Wildtypmaus verschoben (Abb. 11). Das umgekehrte Bild zeigt sich bei den prozentualen Anteilen der MHCII-exprimierenden DC. Diese kommen in der CCR7^-/--Maus geringfügig höher vor (Abb. 12). Da anhand der qualitativer und quantitativer Analysen bezüglich der MHCII-Expression auf cTEC und mTEC sowie TDC keine signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp- und CCR7^-/--Mäusen festzustellen sind, kann man davon ausgehen, dass die Fähigkeit, Antigene zu präsentieren, zwischen beiden Mausstämmen vergleichbar ist. Es bleibt jedoch noch ungeklärt, ob die Funktionalität der entsprechenden antigenpräsentieren Zellen auch übereinstimmt. Vollendens ließe sich die Frage bezüglich der Funktionalität der MHC-Komplexe erst durch Stimulationsversuche beantworten. Hierzu könnten die kortikalen und medullären Epithelzellpopulationen und TDC sortiert und ihre MHCII-Komplexe mit OVA (Ovalbumin im Eiklar von Vogeleiern) beladen werden. Die TEC und TDC beider Mauslinien würden dann getrennt mit DO11.10-Zellen kokultiviert. DO11.10-T-Zellen besitzen einen transgenes T-Zell Rezeptor, bei dem die Gene Vβ 8.1 und Vα 13 des T-Zell Rezeptors so um arrangiert wurden, dass die T-Zellen nur spezifisch auf ein Peptid, das Huhn-Ovalbumins (OVA323-339), reagieren. Da die DO11.10-Zellen hierbei einen normal agierenden TCR besitzen (im Gegensatz zum TCR der CCR7^-/--Thymozyten, wie Misslitz et al., 2007

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berichteten), der nur spezifisch auf OVA reagiert, kann somit das Augenmerk ausschließlich auf die antigenpräsentierenden Zellen und ihre Funktion vergleichend zwischen beiden Mauslinien gelegt werden.

Des Weiteren wäre es interessant zu untersuchen, ob die zwar in den CCR7^-/--Mäusen vorkommenden negativ selektierenden Zellen (UEA-1⁺Ep-CAM⁺) denn auch ausreichend periphere gewebsspezifische Antigene exprimierten. Dieses ließe sich zum Beispiel mit Hilfe von (semi) quantitative real-time PCR verifizieren. Hierbei kann zusätzlich bestimmt werden, ob und welche der Antigene, die der Kontrolle von AIRE unterliegen, in welcher Stärke vorhanden sind.

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