Die Entwicklung und Reifung der T-Zellen im Thymus

In der hier vorliegenden Arbeit wurde der Thymus untersucht und analysiert. In ihm spielt sich die vollständige T-Zell-Reifung unter Einwirkungen verschiedenster Einflüsse auf molekularer und zellulärer Ebene ab. Der Thymus ist ein primäres lymphatisches, zwei-gelapptes Organ und befindet sich im Mediastinum unter dem Brustbein, kaudal der Schilddrüse und kranial des Perikards. Der Thymus hat bei neugeborenen Menschen das ungefähre Volumen von 2 x 5 ml pro Lappen und wiegt insgesamt 10 – 15 g. Er wächst bis zum Kleinkindalter und hält bis zur Pubertät sein Volumen von 30 – 40 g. Nach der Pubertät beginnt der Prozess der Involution (Verfettung). Im Alter von 20 Jahren ist die Hälfte des Thymusgewebes mit Fett durchwachsen, im Verlauf der Jahre schreitet dieser Vorgang weiter voran. Jeder Thymus-Lappen wird durch Bindegewebsstränge in einzelne Läppchen aufgeteilt. In jedem Läppchen trennt der kortiko-medulläre Übergang (cortico medullary junction, CMJ) das Thymusmark (Medulla) von der Thymusrinde (Kortex) ab.

Normalerweise befindet sich die Medulla in der Mitte der einzelnen Thymusläppchen und ist vom Kortex umgeben.

Es ist momentan noch Teil reger Diskussionen, welche verschiedenen molekularen Mechanismen die T-Vorläuferzellen auf dem Weg vom Knochenmark in den Thymus benötigen, welcher Stammzelle sie wirklich entstammen und welcher Phänotyp sie kennzeichnet. Einer Theorie folgend, befinden sich im Knochenmark selbst-erneuerbare hämatopoietische Stammzellen (hematopoietic stem cells, HSC), die die Oberflächenmoleküle CD117 (cKit) und Sca-1 exprimieren und negativ für ausdifferenzierte Zelllinien-Marker, wie Gr1, CD19, CD11c, Ter119, NK1.1, CD8, TCRβ, sind (lineage-negative Sca-1 Kit^hi, LSK) (Sprangrude et al., 1988; Ikuta et al., 1992). Diese LSK-Zellen differenzieren sich unter

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anderem in nicht selbst-erneuerbare multipotente Progenitoren (multipotential progenitor, MPP), die zu einem Anteil CD135^hi (Flt3^hi) sind (Adolfsson et al., 2001). Diese Subpopulation initiiert die Transkription von RAG-1- und RAG-2-(recombination activating gene)-Genen und wird deshalb als frühe lymphopoietische Progenitoren bezeichnet (early lymphoid progenitor, ELP) (Igarashi et al., 2002). Aus den ELP entwickeln sich unter anderem lymphoid-restricted common lymphoid progenitor (CLP), aus denen sich weiter CLP-2 bilden, die T- und B-Zelllinien-Potenzial besitzen (Gounari et al., 2002; Martin et al., 2003).

Der überwiegende Teil dieser verschiedenen Vorläuferzellen tritt vom Knochenmark ins Blut über und ein bestimmter Teil davon hat die Fähigkeit, in den Thymus einzutreten.

Diese T-Vorläufer-Zellen besitzen nach Suniara et al., (1999) den Phänotyp CD45⁺CD34⁺ CD44⁺CD25^-CD117⁺ und benötigen, um aus der Blutbahn in den Thymus eintreten zu können, unter anderem die Bindung ihres Liganden P-Selektin-Glykoproteinligand-1 (PSGL-1) an das P-Selectin (ein Carbohydrat-Bindungsprotein), welches auf dem thymischen Endothel ansässig ist, damit sie durch die kleinen venösen Kapillaren in das Thymusgewebe in die CMJ gelangen können (Rossi et al., 2005). Des Weiteren benötigen sie den Oberflächen-Rezeptor CD44 zur Zielsuche und zur Zell-Adhäsion (Wu et al., 1993). Nach dem Eintreten in die CMJ werden die Thymozyten-Progenitoren als doppelt negative Thymozyten (DN-Thymozyten) bezeichnet. Die Bezeichnung „doppelt negativ“ bezieht sich auf die fehlende Expression der Oberflächenmarker (Rezeptoren) CD4 und CD8. Die Ko-Rezeptoren weisen die Zugehörigkeit der reifen T-Zellen entweder der T-Helfer- (CD4) oder der zytotoxischen T-Zellreihe (CD8) zu (s. Abs. 1.1). Diese Oberflächenrezeptoren werden erst zum Ende der Entwicklungsreihe der T-Zellen hin exprimiert. Der Reife- und Entwicklungsstatus der DN-Thymozyten wird bis dahin mittels Expression der Oberflächenmoleküle CD25 (Interleukin-2-Rezeptor α-Kette, IL-2R α-Kette) und CD44 (Phagozyten Glykoprotein-1, pgp-1) definiert (Godfey et al., 1993; Ceredig, 2002). Diese werden je nach Entwicklungsstadium von den DN-Zellen herauf- oder herunterreguliert. Die Progenitoren durchlaufen auf ihrem Differenzierungsweg im Thymus mehrere Stadien, bis sie sich letztendlich zu einfach-positive (single positive, SP) CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zellen, entwickeln. Während ihres Differenzierungsvorgangs wandern die sich entwickelnden Thymozyten durch unterschiedliche Thymus-Mikrokompartiment, wo sie von den dort ansässigen Stromazellen, insbesondere von den den Thymus auskleidenden Epithelzellen, Differenzierungssignale erhalten.

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Die anfangs durch den Blutstrom in die CMJ des Thymus eintretenden T-Zell-Progenitoren sind, wie bereits erwähnt, CD25^-CD44⁺CD117⁺CD4^-CD8^- und werden abkürzend DN1 genannt. In diesem Stadium besitzen diese Progenitorzellen noch die Fähigkeit, sich in weitere Zelllinien, wie B-Zellen, NK- oder DC, entwickeln zu können (Lian et al., 1997). Die erste Veränderung ihrer Oberflächenmoleküle, die Induktion des CD25, unterlaufen die DN1 nach dem Eintreten in die CMJ. Für diese Vorgänge werden spezielle Signaltransduktionswege diskutiert, die die Proliferation und die jeweiligen Stadienänderungen induzieren und vorantreiben. Für die Differenzierung von DN1 zu DN2 ist laut Godfrey et al. (1992) die Signalkaskade durch die Transmembran-Rezeptor-Tyrosin-Kinase (c-Kit) und ihres Liganden Stamm-Zell-Faktor (stem cell factor, SCF) unabdingbar.

Radtke et al. (1999), Schmitt et al. (2002 und 2004) und Tan et al. (2006) beschrieben zusätzlich die Signalkaskade via des Transmembran-Rezeptors Notch-1 und seines Liganden Delta-like-1 als unerlässlich für die T-Zellentwicklung und Unterdrückung des B-Zell-Potentials während der ersten zwei Stadien. Zusätzlich sorgen Signale via Notch für vermehrte Expression von cKit (Massa et al., 2006). Des Weiteren stellt nach Wang et al.

(2006) Interleukin IL-7 einen ebenfalls benötigten Induktor für die Proliferation und das Überleben der Thymozyten dar. Wang et al. verdeutlichten zudem, wie wichtig die Balance zwischen Notch, IL-7 und cKit für eine erfolgreiche T-Zell-Differenzierung ist. Als ein essentieller Mediator für die Aufrechterhaltung der gerade in die CMJ eingetretenen T-Zell-Progenitoren und auch für das folgende Stadium wird nach El Andaloussi et al. (2006) der Wachstumsfaktor Hedgehog angesehen, der durch den Lymphozyten-Rezeptor Smoothened die erforderlichen Differenzierungssignale auslöst.

Nach dem ersten Differenzierungsvorgang werden die Thymozyten als DN2 bezeichnet, weil ihr Phänotyp CD25⁺CD44⁺CD117⁺CD4^-CD8^- lautet. Während dieses Differenzierungsvorgangs von DN1 zu DN2 (kurz: DN1-2) exprimieren die Progenitoren stark die Chemokinrezeptoren CCR7 und CXCR4. Diese helfen ihnen, die CMJ zu verlassen.

Angelockt werden die DN1-2 durch Chemokine, Liganden für die jeweiligen Rezeptoren.

Chemokine stellen eine der Hauptgruppen der Zytokine dar (s. Abs. 1.1). Sie sind kleine, basische und als Mediatoren agierende Polypeptide, die durch Bindung an Chemokinrezeptoren auf den T-Zell-Progenitoren eine G-Protein-gekoppelte Signalkaskade anstoßen und dadurch Zellmigration stimulieren können (Kelvin et al., 1993). Bei den an CCR7 bindenden Chemokinen handelt es sich um CCL19 und CCL21. An CXCR4 bindet das Chemokin CXCL12 (stromal cell-derived factor, SDF). Die Chemokine werden von den kortikalen Epithelzellen sezerniert und exprimiert. Dadurch wird die Richtung der DN1-2 und

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DN2 in den Kortex polarisiert (Pelletier et al., 2000). Die DN1 verweilen im Mittel um die 10 Tage an ihrem Eintrittsort und expandieren dort ihre Zellanzahl um das 1000-fache, bevor sie sich durch die oben erwähnten Vorgänge in den äußeren Kortex begeben (Shortman et al., 1990; Porritt et al., 2003).

Die Wanderung der DN2-Zellen korreliert mit ihrer weiteren Differenzierung. Hierbei spielen polarisierend Richtung-weisend die Chemokine CXCL12 und CCL25, auf Seiten der Epithelzellen, mit den Rezeptoren CXCR4 und CCR9 seitens der DN2 eine große Rolle.

Direkte Zellmigration benötigt jedoch nicht nur Polarisierungssignale, wie die Chemokine, um sich in eine bestimmte Richtung bewegen zu können, sondern auch Moleküle, die Adhäsion der Thymozyten an die den Thymus auskleidenden Stroma- und Epithelzellen gewähren. Hierbei sei das Molekül VCAM-1⁺ auf den Epithelzellen erwähnt, an welches die DN2 mit Hilfe des VLA-4 Integrins (α4β1) auf ihrer Oberfläche binden und somit des Weges geleitet werden (St-Pierre et al., 1996).

Ungefähr in der Kortexmitte erreichen die sich entwickelnden DN2-Thymozyten das Stadium DN3. Auch hier sind einige Moleküle und Signale bekannt, die die Zellveränderungen bedingen. CCL25 auf den TEC dirigiert die DN3 Richtung Kortex (Uehara et al., 2006). VCAM-1 ermöglicht weiterhin, zusammen mit den Molekülen Fibronektin und Laminin, die Adhäsion der Thymozyten-Progenitoren an die Stromazellen (Prockop et al., 2002). Für die Proliferation und Differenzierung der DN3-Zellen sind auch hier weiterhin Signale durch Notch-Liganden notwendig (Balciunaite et al., 2005; Ciofani et al., 2005).

Die DN3 kennzeichnen sich jetzt durch den Phänotyp CD44^-CD25⁺CD4^-CD8^-. Sie beginnen außerdem, das prä-TCR-Molekül zu exprimieren, indem sie mit der Umordnung der ersten Kette des TCR, die β-(γ-δ-)-Kette, starten. Der TCR ist ein aus einer α- und β-Kette (oder γ- und δ-Kette) bestehendes Transmembranprotein, das auf seiner extrazellulären Seite (N-terminal), wie die Immunglobuline, eine variable Region aufweist. Die dafür benötigten Proteine entstehen ähnlich wie die Immunglobuline (Ig) der B-Zellen durch zufällig genetische Rekombination aus einer großen Anzahl von V-, D- und J-Genen (variable, diversity, joining) was zu einer sehr hohen Vielfalt der entstandenen Rezeptorphänotypen führt. Mit dieser Rezeptordiversität lässt sich die große Anzahl von spezifischen Peptidantigenen erkennen, die dem TCR reifer T-Zellen später von antigenpräsentierenden Zellen, z. B. von DC, in Verbindung mit einem MHC-Komplex angeboten werden. Für diesen ersten Prozess der β-Kette-Genumlagerung werden die RAG-1-(recombinase-activating gene-1) und RAG-2-Proteine exprimiert, welche die VDJ-Neuanordnung an dem Tcrb- (T-cell

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receptor β-chain), Tcrg-, und/oder Tcrd-Lokus initiieren. Als bekannter und bedeutender Induktor für die Tcrb-Lokus wird IL-7 angesehen (Muegge et al., 1993; Crompton et al., 1997). Weitere unabdingbare Induktionsprozesse und Differenzierungssignale werden auch hier via Notch-Liganden vermittelt (Ciofani et al., 2004). Die T-Zellen, die eine komplett funktionierende Tcrb-Umordnung vollzogen haben, können die Proteine der β-Kette des TCR exprimieren, die danach auf der Zelloberfläche als precursor-TCR-(prä-TCR)Komplex erscheinen. Der Prozess zeigt endgültig das Stadium DN3 an (Livák et al., 1999). Dieser Schritt führt auch zum unwiderruflichen Einschlagen der DN3-Zellen in die T-Zell-Linie (Moore et al., 1995; Bhandoola et al., 2006). Nach Erreichen der subkapsulären Zone exprimieren die DN3-Thymozyten weiterhin CXCR4 und CCR9 (Misslitz et al., 2006).

Der Übergang in das DN4 Stadium (auch prä-DP genannt) findet in der subkapsulären Region statt. Als Adhäsionsprotein wird hier nicht mehr VCAM-1, sondern Laminin-5 angesehen, das über den Liganden α6β4 auf Seiten der prä-DP nicht nur Adhäsion vermittelt, sondern durch den MAP-(mitogen-activated protein)Kinase-Weg auch Proliferation und Überleben induzieren kann (Giancotti et al., 1996). Stadium DN4 ist weiterhin durch den Verlust von CD25 gekennzeichnet, sowie durch das Heraufregulieren des prä-TCR/CD3-Komplexes. Der prä-TCR besteht aus der schon fertig umgeordnete ß-Kette, die nach ihrem Erscheinen die Signale gibt, den Umlagerungsprozess für die ß-Kette einzustellen, die Moleküle CD4 und CD8 hochzuregulieren und die Umlagerung der Gene für die α-Kette zu beginnen (Irving et al., 1998; Yamasaki et al., 2006). Diese Vorgänge führen zu einer doppelt positiven T-Zelle (DP, doppelt positiv für CD4 und CD8) (Borgulya et al., 1992).

Mit dem vollständigen TCR-Komplex ist die T-Zelle anschließend fähig, Selbst-Antigene, die an MHC-Komplexe gebunden sind, auf den kortikalen Epithelzellen zu erkennen und dadurch positive Selektion zu durchlaufen. Unter positiver Selektion versteht man den ersten Prozess, durch den herausgefunden wird, ob die sich entwickelnde T-Zelle mit ihrem TCR fähig ist, körpereigene Peptide im Kontext zu MHC-Molekülen zu erkennen und diese mit nur geringer Kraft zu binden. Wenn sie diesen Vorgang vollführt hat, ist der erste Schritt in Richtung erworbener Immunität getan. (Selbst)-Antigene werden durch zwei verschiedene Typen von MHC-Molekülen präsentiert.

MHCI ist ein integrales Membranprotein, das Peptidfragmente aus dem Proteasom präsentiert, welche durch Proteolyse intrazellulär synthetisierter Proteine entstehen. Da viele Viren ihre Erbinformationen im Zytosol replizieren lassen, werden somit auch jene Peptide von den MHCI-Molekülen präsentiert. Diese werden von CTL und ihrem Ko-Rezeptor CD8 erkannt. MHCI-Moleküle sind auf allen kernhaltigen Körperzellen zu finden.

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MHCII wird nur von B-Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen und Langerhanszellen exprimiert. Diese zählen zu den antigenpräsentierenden Zellen, die Antigene durch spezielle Rezeptoren endozytisch aufnehmen, im Lysosom in Peptidgröße spalten und mit Hilfe von Molekülen auf ihrer Oberfläche präsentieren. Der MHCII-Komplex mit dem gebundenen Antigenfragment wird von T-Helferzellen und ihrem Ko-Rezeptor CD4 erkannt.

Durch den Vorgang der positiven Selektion wird sichergestellt, dass nur die T-Zellen sich weiterentwickeln, die körpereigene Peptide, an MHC-Molekülen gebunden, erkennen können und mit dem Komplex keine zu starke Bindung eingehen. Dieser Vorgang ist später bei der Erkennung von durch MHC-Moleküle präsentierten, körperfremden Antigenpeptiden während einer Immunabwehr unerlässlich (Ignatowicz et al., 1996).

Während der zufälligen α-Ketten-Umlagerung (nach Erscheinen des prä-TCR/CD3-Komplexes) werden so lange so viele verschiedene Rezeptorsegmente synthetisiert, bis die T-Zelle mit ihrem dann passenden TCR/CD3-Komplex einen MHC/Peptid-Komplex erkennt und binden kann (Petrie et al., 1993). Zwei klassischen Theorien nach entscheidet entweder die Stärke der Bindung zu MHC-I- oder MHC-II-Molekülen und die damit verbundenen Signalkaskaden die Weiterdifferenzierung der zu dem Zeitpunkt noch DP-T-Zelle in die CD4⁺- bzw. CD8⁺-SP-T-Zellen. Die jeweils andere Genexpression wird dadurch unterdrückt (Robey et al., 1991; Yasutomo et al., 2000); oder es spielt der Zufall für die folgende Entwicklungsrichtung der DP-Zelle mit, der die weiteren Schritte der TCR- und Ko-Rezeptor-Ausprägung bestimmt (Chan et al., 1993; Davis et al, 1993). Neuere Studien zeigen jedoch, dass selbst an MHCII-Molekülen selektionierte CD4⁺CD8^low-T-Zellen noch die Fähigkeit besitzen, sich durch, insbesondere IL-7-Signale, vollständig in CD8⁺-T-Zellen zu entwickeln.

Dies wird von den Autoren mit „coreceptor reversal“ betitelt (Yu et al., 2003 und 2006;

Brugnera et al. 2000).

Auf die Zelllinien-Differenzierung folgt die klonale Expansion. Wurde der MHC/Peptid-Komplex nicht erkannt, stirbt die DN-Zelle durch Vernachlässigung (neglect), da sie keine zellerhaltenden Signale bekommt (Petrie et al., 1993). Nach Kontakt mit den MHC-Komplexen auf den kortikalen Epithelzellen, durch die positiv selektioniert wurde, wird die Migrationspolarität der entwickelnden Thymozyten geändert und der Weg wieder in Richtung Thymusmitte, der Medulla, eingeschlagen. Dazu wird CXCR4 herunterreguliert, die erneute Induktion von CCR7 und das erstmalige Hochregulieren von CCR4, sowie das stärkere Exprimieren von CCR9 angeregt. Die Chemokine, Liganden dieser Rezeptoren, werden in

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Kortex und Medulla sezerniert. CCL17 und CCL22, Liganden des CCR4, sind hierbei eine Ausnahme. Sie kommen ausschließlich in der Medulla vor (Misslitz et al., 2006).

Mit Hilfe der Chemokin-Polaritäten erfolgreich in der Medulla angelangt, werden den SP-Zellen von den dort ansässigen dendritischen Zellen, Makrophagen und den medullären Epithelzellen unterschiedlichste Antigene, erneut an MHC-Komplexe gebunden, präsentiert.

Hiermit wird getestet, ob die SP-Zellen mit ihrem TCR fähig sind, körperfremdes von körpereigenem Antigen zu unterscheiden und nur mit körperfremdem Antigen an MHC-Komplexen eine feste Bindung einzugehen, die später zur Erregerelimination benötigt wird.

Bei zu starker Bindung zwischen dem TCR und den körpereigenen präsentierten Antigenen wird in den T-Zellen Apoptose eingeleitet, da sich aus ihnen sonst autoaggressive T-Zellen entwickeln, die später in der Peripherie zu Autoimmunerkrankungen führen können. Dieser zweite Vorgang wird negative Selektion genannt und zusammen mit der vorangegangenen positiven Selektion unter dem Begriff zentrale Toleranzentwicklung zusammengefasst.

Nach erfolgreichem Erlangen der zentralen Toleranz verlassen die reifen CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen den Thymus durch Bindung ihres Spingosin-1-Phosphat-Moleküls an den SP-1-Rezeptor, der in den Kapillarwänden der CMJ ansässig ist, in die Blutbahn. Auf diesem Weg gelangen sie in die sekundären lymphatischen Organe, wie z. B. Lymphknoten, wo sie sowohl Immunität als auch die periphere Toleranz in Form von Immunreaktionen entwickeln können.