Nachdem eine „spontane“ IgM-Sezernierung mittels ELISpot nachgewiesen werden konnte und mehr Transkripte für sezerniertes als für membranständiges IgM, sowie
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eine Expression der J-Kette aufgefunden werden konnte, sollte mit weiteren Methoden aufgeklärt werden, ob das IgM-Molekül im Serum aus UCB oder PB bevorzugt eine pentamere oder hexamere Struktur aufweist. Die genaue Funktion des hexameren IgM ist noch unbekannt, obwohl bereits nachgewiesen werden konnte, dass hexameres IgM das Komplementsystem effizienter aktiviert als pentameres IgM (Randall et al., 1990; Wiersma et al., 1998). Auf Grund der erhöhten Effizienz der Komplementaktivie-rung durch das hexamere IgM sollte seine SezernieKomplementaktivie-rung streng kontrolliert werden und nur erfolgen, wenn eine starke Aktivierung des Komplementsystems erforderlich ist.
Dies könnte bei Neugeborenen der Fall sein, da sie mit vielen unbekannten Pathoge-nen in Kontakt treten, aber noch kein ausgereiftes adaptives Immunsystem aufweisen (Gibbons et al., 2014). Aus diesem Grund liegt die Vermutung nahe, dass der erste Abwehrmechanismus bei Neugeborenen durch „natürliches“ IgM gebildet wird, wel-ches als Hexamer vorliegen könnte. Zudem wurde bereits diskutiert, ob „natürliches“
IgM Einfluss auf eine frühe Virusdissemination hat (Ochsenbein et al., 1999). In Maus-modellen konnte nachgewiesen werden, dass „natürliches“ IgM aus Serum von naiven Mäusen Influenzaviren komplementabhängig neutralisieren und aggregieren kann (Gong & Ruprecht, 2020). Ein konstanter Titer von „natürlichem“ IgM konnte in keimfrei gehaltenen Mausmodellen gezeigt werden (Haury et al., 1997). Dabei sind B-1a-Zellen die Quelle für „natürliches“ IgM. Wird davon ausgegangen, dass humane reife CD5+ B-Zellen Eigenschaften ähnlich zu murinen B-1a-Zellen aufweisen, so könnten hu-mane reife CD5+ B-Zellen ebenfalls „natürliches“ IgM sezernieren, welches als hexa-meres IgM vorliegen könnte. Die Tatsache, dass humane reife CD5+ B-Zellen „natürli-ches“, möglicherweise hexameres IgM sezernieren, könnte eine mögliche Erklärung dafür sein, warum hauptsächlich erwachsene Menschen mit SARS-CoV-2 (engl.: se-vere acute respiratory syndrome coronavirus type 2) infiziert werden. Neugeborene und kleine Kinder werden dabei möglicherweise durch einen konstanten Titer an „na-türlichem“ IgM geschützt. In SARS-CoV-2-infizierten Personen wurde eine reduzierte Anzahl an CD5+ B-Zellen festgestellt (Rébillard et al., 2020). Die Anzahl an CD5+ B-Zellen nimmt mit dem Alter ab und somit wird ebenfalls weniger „natürliches“ IgM ge-bildet. Mit dieser Annahme müsste hexameres IgM vorrangig im Serum aus UCB auf-zufinden sein. Zur Überprüfung der Annahme wurde zuerst eine Gelelektrophorese mit
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Serum aus UCB und PB durchgeführt und das Gel anschließend mit Coomassie ge-färbt. Es konnte in der Spur des Serums aus PB eine schmale Bande, die auf hexa-meres IgM hindeutet, und eine etwas breitere Bande in der Spur mit Serum aus UCB aufgefunden werden, die möglicherweise keine Trennung von pentamerem und hexa-merem IgM aufweist. Für einen Nachweis auf Protein-Ebene wurde eine native Gel-elektrophorese mit WB durchgeführt. Dabei konnte nicht das gleiche Bild erzielt wer-den wie bei dem Coomassie-gefärbten Gel zuvor. Während auf dem WB mit Serum aus PB eine Bande, vergleichbar mit der aus dem Coomassie-gefärbten Gel zu sehen war, war auf dem WB mit Serum aus UCB kein IgM-Protein nachweisbar. Zum Pro-teinnachweis wurde ein monoklonaler Antikörper, der gegen Cµ gerichtet war, verwen-det. Cµ weist fünf N-Glykosylierungen auf, bei denen N-Glykane über N-Acetyl-β-D-Glucosamin an Asparagin gebunden sind (Arnold et al., 2007; Monica et al., 1995).
Glykane tragen zur Löslichkeit und Konformation des Antikörpers bei (Mimura et al., 2000), erleichtern den subzellulären Transport, die Sezernierung (Gala & Morrison, 2002) und erhalten die Effektorfunktionen aufrecht, indem sie eine optimale Bindung der Fc-Region an Fc-Rezeptoren sicherstellen (Mimura et al., 2001). Auf Grund des-sen, dass im Serum aus UCB mittels WB keine Bande nachgewiesen werden konnte, besteht die Möglichkeit, dass hexameres IgM anders glykosyliert ist als pentameres IgM, an das der monoklonale Antikörper binden konnte. Außerdem könnte durch die Glykosylierung die Konformation von hexamerem IgM anders sein als die von penta-merem IgM, wodurch eine zusätzliche sterische Behinderung für die Bindung des mo-noklonalen Antikörpers bestehen kann. Ein weiterer Grund für das Ausbleiben des Proteinnachweises im Serum aus UCB könnte eine zu geringe Konzentration des he-xameren IgMs sein. Aus diesem Grund wurde zur Aufkonzentrierung die LigaTrap-Säulen-Methode verwendet und anschließend erneut ein WB durchgeführt. Mit Hilfe von LigaTrap-Säulen konnte ebenfalls kein IgM-Protein im Serum aus UCB nachge-wiesen werden. Zum Vergleich wurde die LigaTrap-Säulen-Methode auch mit Serum aus PB durchgeführt, in dem hauptsächlich pentameres IgM zu erwarten wäre (Petrušić et al., 2011). Die ermittelte IgM-Protein-Bande aus Serum von PB war viel schwächer und kleiner als ohne Aufkonzentrierung mit den Säulen. Aus diesem Grund
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ist die durchgeführte Analyse mit LigaTrap-Säulen nicht aussagekräftig, da ein Anti-körper-Verlust durch die Säulen stattgefunden hat. LigaTrap-Säulen sind Harzsäulen, dessen Mechanismus vom Hersteller geheim gehalten wird.
In einer denaturierenden Gelelektrophorese mit WB konnte sowohl für Serum aus PB als auch für Serum aus UCB eine schwere Kette von IgM nachgewiesen werden. Somit enthielt das Serum aus UCB nachweislich IgM. Da nur pentameres IgM eine J-Kette aufweist und hexameres IgM keine J-Kette enthält, wurde ein WB zum Nachweis des J-Kette-Proteins mit IgM-Konzentrationen aus der denaturierenden Gelelektrophorese durchgeführt. Dabei konnte nur im Serum aus PB ein Proteinnachweis für die J-Kette erbracht werden. Dieses Ergebnis spricht wieder für eine bevorzugte hexamere IgM-Form im Serum aus UCB.
Zuletzt sollte IgM mittels Ammoniumsulfatfällung aus Serum isoliert und auf einer na-tiven Gelelektrophorese mit Hilfe einer Silbernitratfärbung visualisiert werden. Es konn-ten schwache Banden für pentameres IgM sowohl für Ammoniumsulfat-gefälltes IgM aus PB als auch aus UCB aufgezeigt werden. Zusätzlich wurde ein dunkel gefärbter Bereich auf Höhe des hexameren IgMs detektiert.
Zusammenfassend scheint es Unterschiede zwischen IgM aus UCB und PB zu geben.
Die gewonnenen Erkenntnisse deuten entgegen den qPCR-Ergebnissen für die J-Kette, darauf hin, dass im Serum aus UCB mehr hexameres als pentameres IgM vor-handen sein müsste.
In Zukunft könnte über eine Analyse der IgM-Glykosylierung zur Aufklärung der Kon-formation nachgedacht werden.
Zur weiteren Visualisierung des IgM-Moleküls wurden EM- und AFM-Aufnahmen durch Kooperationspartner durchgeführt. Einzelne IgM-Moleküle aus UCB-Serum konnten detektiert und aufgenommen werden, jedoch ist das IgM-Molekül nicht planar und kann in unterschiedlichen Konformationen vorliegen (Feinstein & Munn, 1969), wodurch die Aufnahmen und das Beurteilen davon, ob es ein pentameres oder hexameres IgM-Molekül ist, erschwert war. Mit Hilfe von EM und AFM kann außerdem auch nicht auf
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das Verhältnis von hexamerem und pentamerem IgM im Serum von UCB oder PB geschlossen werden.