reifer CD5 B-Zellen aus Nabelschnurblut und adultem peripherem Blut
Inaugural-Dissertation zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
der Fakultät für Biologie
an der
Universität Duisburg-Essen
vorgelegt von Ekaterina Homp
aus Moskau
Februar 2021
1. Gutachter: PD Dr. Marc Seifert 2. Gutachter: Prof. Dr. Stefanie Flohé
Vorsitzender des Prüfungsausschusses: Prof. Dr. Wiebke Hansen Tag der mündlichen Prüfung: 13.07.2021
Diese Dissertation wird via DuEPublico, dem Dokumenten- und Publikationsserver der Universität Duisburg-Essen, zur Verfügung gestellt und liegt auch als Print-Version vor.
DOI:
URN:
10.17185/duepublico/74591
urn:nbn:de:hbz:464-20210729-105729-2
Dieses Werk kann unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz (CC BY 4.0) genutzt werden.
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden auf dem Server für Biologie, bioRxiv veröffentlicht und bei der Fachzeitschrift „The Journal of Immonology“ eingereicht:
Bettina Budeus#, Artur Kibler#, Martina Brauser#, Ekaterina Homp#, Kevin Bronische- wski, J. Alexander Ross, Andre Görgens, Marc A. Weniger, Josefine Dunst, Taras Kreslavsky, Symone Vitoriano da Conceição Castro, Florian Murke, Christopher C. O- akes, Peter Rusch, Dimitrios Andrikos, Peter Kern, Angela Köninger, Monika Linde- mann, Patricia Johansson, Wiebke Hansen, Anna-Carin Lundell, Anna Rudin, Jan Dü- rig, Bernd Giebel, Daniel Hoffmann, Ralf Küppers, Marc Seifert (2020). Human neona- tal B cell immunity differs from the adult version by conserved Ig repertoires and rapid, but transient response dynamics. bioRxiv 2020.08.11.245985; doi:
https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245985, # geteilte Erstautorenschaft
Für meinen Vater
Begrenzt ist das Leben, doch unendlich ist die Erinnerung.
i
Abkürzungsverzeichnis ... i
Abbildungsverzeichnis ... v
Tabellenverzeichnis ... vii
1 Einleitung ... 1
1.1 Das humane Immunsystem ... 1
1.1.1 Das angeborene Immunsystem ... 1
1.1.2 Das adaptive Immunsystem ... 3
1.2 Frühe B-Zell-Entwicklung ... 4
1.3 B-Zell-Aktivierung durch T-Zell-unabhängige Immunantworten ... 8
1.4 Späte B-Zell-Entwicklung und Keimzentrumsreaktion ... 9
1.5 Immunglobuline ... 11
1.5.1 Immunglobulin M ... 13
1.6 Plasmazelldifferenzierung und ihre Transkriptionsfaktoren ... 14
1.7 Das CD5-Molekül und CD5+ B-Zellen ... 16
1.8 Innate response activator (IRA) B-Zellen ... 17
1.9 Ziele der Arbeit ... 21
2 Material und Methoden ... 23
2.1 Materialien ... 23
2.1.1 Chemikalien und Reagenzien ... 23
2.1.2 Verbrauchsmaterialien ... 24
2.1.3 Geräte ... 25
2.1.4 Längenstandard / Marker ... 26
2.1.5 Micro Beads ... 27
2.1.6 Enzyme ... 27
ii
2.1.8 Antikörper ... 27
2.1.8.1 Primäre Antikörper ... 27
2.1.8.2 Sekundäre Antikörper ... 29
2.1.9 Oligonukleotide ... 29
2.1.10 Taqman-Sonden ... 30
2.1.11 Zelllinien ... 30
2.1.12 Kits ... 30
2.1.13 Acrylamid-Gele ... 30
2.1.14 Medien und Puffer ... 31
2.1.15 Software ... 31
2.2 Methoden ... 32
2.2.1 Zytologische Methoden ... 32
2.2.1.1 Isolierung von Zell-Populationen aus humanem Gewebe ... 32
2.2.1.2 Durchflusszytometrische Analysen und Zellsortierung... 33
2.2.1.3 Zellzahlbestimmung ... 33
2.2.1.4 Kultivierung von humanen Zellen ... 33
2.2.1.5 Proliferationsanalyse mit Dye eFluor 670 ... 34
2.2.1.6 Zelldifferenzierungs- und Klassenwechselanalyse ... 35
2.2.1.7 Humanisierung von NSG-Mäusen mit hämatopoetischen Vorläuferzel- len ... 35
2.2.1.8 Zytokinprofilanalyse ... 36
2.2.1.9 Monozytendifferenzierung ... 36
2.2.2 Molekularbiologische Methoden ... 37
2.2.2.1 RNA-Isolierung ... 37
2.2.2.2 Reverse Transkription ... 37
2.2.2.3 DNA- und RNA-Konzentrationsbestimmung ... 38
2.2.2.4 MicroRNA-Analyse ... 38
2.2.2.5 Agarose-Gelelektrophorese ... 38
iii
2.2.2.7 Quantitative Real-Time-PCR ... 40
2.2.2.8 Fragmentlängenanalyse ... 41
2.2.3 Biochemische Methoden ... 42
2.2.3.1 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) / Western-Blotting ... 42
2.2.3.2 Native Gelelektrophorese ... 43
2.2.3.3 Proteinisolierung mittels LigaTrap-Verfahren ... 43
2.2.3.4 Ammoniumsulfatfällung ... 43
2.2.3.5 ELISpot-Assay ... 44
2.2.3.6 Analyse von intrazellulärem IgM ... 44
2.2.4 Statistische Auswertung ... 45
2.2.5 Weitere Methoden ... 45
2.2.5.1 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ... 45
2.2.5.2 Rasterkraftmikroskopie (AFM) ... 46
3 Ergebnisse ... 47
3.1 Bestimmung von humanen reifen CD5+, CD5- und transitionellen B-Zellen in UCB und PB ... 47
3.2 Proliferationseigenschaften von reifen CD5+ und CD5- B-Zellen aus UCB und PB ... 49
3.3 Zelldifferenzierung und Klassenwechsel von reifen CD5+ und CD5- B-Zellen aus UCB und PB ... 51
3.4 IgM-Sezernierung ... 53
3.4.1 „Spontane“ IgM-Sezernierung und Bildung von intrazellulärem IgM bei reifen CD5+ und CD5- B-Zellen aus UCB und PB ... 53
3.4.2 Mechanismen der IgM-Sezernierung bei reifen CD5+ und CD5- B-Zellen aus UCB und PB ... 55
3.4.3 Benötigte Transkriptionsfaktoren zur IgM-Sezernierung ... 58
3.4.3.1 Expression der Transkriptionsfaktoren XBP1, IRF4 und PRDM1 sowie der J-Kette (IgJ) ... 58
iv
3.4.4 IgM-Detektierung ... 66
3.4.4.1 Strukturanalyse von IgM mittels (nativer) Acrylamidgelelektrophorese 66 3.4.4.2 Visualisierung eines IgM-Moleküls ... 69
3.5 Entwicklung reifer CD5+ B-Zellen in humanisierten Mäusen ... 70
3.6 Immunmodulatorische Rolle von CD5+ B-Zellen aus UCB und PB ... 73
3.6.1 Monozytendifferenzierung zu M1- und M2-Makrophagen ... 77
3.6.1.1 Monozytendifferenzierung durch Zytokinzugabe ... 77
3.6.1.2 Monozytendifferenzierung durch B-Zell-Co-Kultur ... 84
4 Diskussion ... 90
4.1 Die Mehrheit von CD5+ B-Zellen aus UCB zeigt einen reifen B-Zell-Charakter und unterscheidet sich in ihrer Kinetik im Vergleich zu CD5+ B-Zellen aus PB ... 90
4.2 B-Zellen aus UCB haben ein Klassenwechselpotential ... 92
4.3 Reife CD5+ B-Zellen sezernieren „spontan“ IgM ... 94
4.4 „Spontane“ IgM-Sezernierung scheint ohne eine gespleißte XBP1-Variante stattzufinden ... 95
4.5 IRF4- und PRDM1-Transkripte werden zur „spontanen“ IgM-Sezernierung nur in geringem Maß produziert, während IgJ-Transkripte vorhanden sind ... 97
4.6 Eine Sezernierung des hexameren IgM durch B-Zellen aus UCB ist nicht ausgeschlossen... 98
4.7 Humane CD34+ hämatopoetische Vorläuferzellen aus UCB und PB unter- scheiden sich in ihrer Kapazität reife B-Zellen in humanisierten Mäusen zu generieren ... 102
4.8 B-Zellen aus UCB und PB weisen immunmodulatorische Eigenschaften auf 103 5 Fazit ... 107
6 Zusammenfassung ... 109
7 Literaturverzeichnis ... 113
8 Anhang ... 137
v
8.2 Publikationen ... 138
8.3 Danksagung ... 139
8.4 Tabellarischer Lebenslauf ... 141
8.5 Eidesstattliche Erklärungen ... 142
i
AFM Rasterkraftmikroskop(ie) (engl.: atomic force microscopy) AID Engl.: activation-induced cytidine deaminase
APC Antigen-präsentierende Zelle (engl.: antigen presenting cell) ASZ Antikörper-sezernierende Zelle
BAFF B-Zell-Aktivierungsfaktor
BCR B-Zell-Rezeptor (engl.: B cell receptor) Bidest. Bidestilliert
BLIMP-1 Engl.: B lymphocyte induced maturation protein 1 BM Knochenmark (engl.: bone marrow)
BSA Rinderserumalbumin (engl.: bovine serum albumin) C Engl.: constant region
CCL2 Engl.: C-C motif chemokine ligand 2 CD Engl.: Cluster of differentiation cDNA Engl.: complementary DNA
CDRs Engl.: complementarity determining regions CLP Engl.: common lymphoid progenitor
CSR Klassenwechselrekombination (engl.: class switch recombination) Ct Engl.: cycle threshold
DH D-Segment der variablen Region der schweren Kette des B-Zell-Re- zeptors (engl.: diversity)
DCs Dendritische Zellen (engl.: dendritic cells) DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure (engl.: deoxyribonucleic acid) dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat
dsDNA Doppelsträngige DNA
E2A Engl.: Immunoglobulin Enhancer Binding Factors E12/E47 EBF Engl.: early B cell factor
ELISA Engl.: Enzyme-linked Immunosorbent Assay ER endoplasmatisches Retikulum
FAM Carboxyfluorescein (engl.:fluorescein amidite) FCS Fötales Kälberserum (engl.: fetal calf serum)
FDC follikuläre dendritischen Zelle (engl.: follicular dendritic cell)
ii FSC-A Engl.: Forward Scatter Area FW Vorwärts (engl.: forward)
GC Keimzentrum (engl.: germinal center) HSC Hämatopoetische Stammzellen IFN-γ Interferon γ
Ig Immunglobulin
IgA Immunglobulin A IgD Immunglobulin D IgE Immunglobulin E IgG Immunglobulin G IgM Immunglobulin M
IL Interleukin
IRAs Engl.: innate response activator B cells IRE1 Engl.: inositol-requiring enzyme 1 IRF4 Engl.: interferon regulatory factor 4
JH J-Segment der variablen Region der schweren Kette des B-Zell-Re- zeptors (engl.: joining)
KCl Kaliumchlorid LPS Lipopolysaccharide
MACS Magnetische Zellseparation (engl.: magnetic cell separation) MBCs IgM-Gedächtnis-B-Zellen (engl.: IgM memory B cells)
MCP-1 Makrophagen-Chemoattraktorprotein-1 M-CSF Engl.: macrophage colony stimulating factor
Mem Membrangebunden
MFI Mittlere Fluoreszenzintensität (engl.: mean fluorescence intensity) MgCl2 Magnesiumchlorid
MHC-I Haupthistokompatibilitätskomplex Typ I MHC-II Haupthistokompatibilitätskomplex Typ II NK Natürliche Killerzellen
NOD-SCID Engl.: non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency NSG NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ
OD Optische Dichte
PAMPs Pathogen-assoziierte Muster (engl.: pathogen associated molecular patterns)
iii PB Peripheres Blut adulter Spender
PBMCs mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (engl.: peripheral blood mononuclear cells)
PCR Polymerase-Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction) PDGF-AA Engl.: Platelet-derived growth factor AA
Pen/Strep 100 U/ml Penicillin mit 100 µg/ml Streptomycin PRDM1 Engl.: PR domain zinc finger protein 1
PRRs Mustererkennungsrezeptoren (engl.: pattern recognition receptors) PVDF Polyvinylidenfluorid
qRT-PCR Quantitative Echtzeit-PCR (engl.: quantitative real-time PCR) rfu Engl.: relative fluorescent units
RV Rückläufig (engl.: reverse)
RNA Ribonukleinsäure (engl.: ribonucleic acid) SARS-CoV-
2
Engl.: severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 SDS Natriumdodecylsulfat (engl.: sodium dodecyl sulfate)
Sec Sezerniert
SSC-A Engl.: Side Scatter Area TAE Tris-Acetat-EDTA
TD T-Zell-abhängig (engl.: T-dependent) TdT Terminale Desoxynukleotidyltransferase TEM Transmissionselektronenmikroskop(ie) TGF-β Engl.: Transforming Growth Factor-β TH T-Helferzellen
TH1 T-Helferzellen Typ 1 TH2 T-Helferzellen Typ 2 TH17 T-Helferzellen Typ 17
TI-I T-Zell-unabhängig Typ I (engl.: T-independent type I) TI-II T-Zell-unabhängig Typ II (engl.: T-independent type II) TLRs Toll-like-Rezeptoren
Tregs Regulatorische T-Zellen
TRIF TIR-Domänen enthaltendes Adapter-induzierendes Interferon-β UCB Nabelschnurblut (engl.: umbilical cord blood)
UK Vereinigtes Königreich (engl.: United Kingdom)
iv UV ultraviolett
V Variable Region des B-Zell-Rezeptors (engl.: variable region)
VH V-Segment der variablen Region der schweren Kette des B-Zell-Re- zeptors (engl.: variability)
VLA Engl.: very late antigen
WB Western Blot
Wdh. Wiederholung
XBP1 Engl.: X-box binding protein 1
v
Abbildung 1: Schematische Darstellung der somatischen Rekombination. ... 5
Abbildung 2: B-Zell-Entwicklung. ... 8
Abbildung 3: Pentamere und hexamere IgM-Struktur. ... 14
Abbildung 4: Transkriptionsfaktoren während der Plasmazelldifferenzierung. ... 15
Abbildung 5: Funktion der IRA B-Zellen. ... 19
Abbildung 6: Phänotypische Analyse humaner reifer CD5+, CD5- und transitioneller B- Zellen. ... 48
Abbildung 7: Proliferationseigenschaften von reifen CD5+ und CD5- B-Zellen aus UCB und PB. ... 50
Abbildung 8: B-Zelldifferenzierung und Klassenwechsel. ... 52
Abbildung 9: IgM-Sezernierung und Bildung von intrazellulärem IgM bei reifen CD5+ und CD5- B-Zellen aus UCB und PB. ... 54
Abbildung 10: Quantifizierung von Transkripten für membranständiges und sezernier- tes IgM von reifen CD5+ und CD5- B-Zellen aus UCB und PB. ... 57
Abbildung 11: Genexpressionsanalyse der Transkriptionsfaktoren IRF4 und PRDM1 mittels qPCR. ... 60
Abbildung 12: Genexpressionsanalyse des Transkriptionsfaktors XBP1 und der J- Kette (IgJ) mittels qPCR. ... 62
Abbildung 13: Gelelektrophorese und Fragmentlängenanalyse des Transkriptions- faktors XBP1. ... 65
Abbildung 14: Detektierung eines IgM-Proteins. ... 68
Abbildung 15: TEM- und AFM-Aufnahmen von IgM aus CD5+ B-Zellüberstand aus UCB mit simulierter CpG-Stimulierung. ... 69
Abbildung 16: Entwicklung reifer CD5+ B-Zellen in humanisierten Mäusen. ... 72
Abbildung 17: Zytokinprofilanalyse von naiven B-Zellen aus PB unter TD-simulierter Stimulationsbedingung. ... 73
vi
CD5- B-Zellen aus UCB und PB mit simulierter TI-II- (α-Ig) Stimulierung. ... 76 Abbildung 19: Monozytendifferenzierung durch Zytokineinfluss zu M1- und M2- Makro- phagen aus UCB. ... 79 Abbildung 20: Monozytendifferenzierung durch Zytokineinfluss zu M1- und M2- Makro- phagen aus PB. ... 81 Abbildung 21: Vergleich der Monozytendifferenzierung zwischen Monozyten aus UCB und PB mit Hilfe von Zytokinen. ... 83 Abbildung 22: Einfluss auf Monozytendifferenzierung zu M1- oder M2-Makrophagen durch Co-Kultur mit reifen CD5+ oder CD5- B-Zellen aus UCB unter unstimulierten und α-Ig Stimulationsbedingungen. ... 85 Abbildung 23: Einfluss auf Monozytendifferenzierung zu M1- oder M2-Makrophagen durch Co-Kultur mit reifen CD5+ oder naiven B-Zellen aus PB unter unstimulierten und α-Ig-simulierten Stimulationsbedingungen. ... 87 Abbildung 24: Vergleich der Monozytendifferenzierung zwischen Monozyten aus UCB und PB mit Hilfe von Co-Kulturen mit reifen CD5+ oder CD5- B-Zellen mit oder ohne α- Ig-Stimulierung. ... 89 Abbildung 25: Isotypkontrollen der Monozytendifferenzierung. ... 137
vii
Tabelle 1: Verwendete primäre Antikörper. ... 28
Tabelle 2: Verwendete sekundäre Antikörper. ... 29
Tabelle 3: Verwendete Oligonukleotide. ... 29
Tabelle 4: Verwendete Taqman-Sonden. ... 30
Tabelle 5: Reagenzien zur Zellstimulierung. ... 34
Tabelle 6: PCR-Reaktionsansatz. ... 39
Tabelle 7: PCR-Konditionen. ... 40
Tabelle 8: qPCR-Reaktionsansatz. ... 41
Tabelle 9: qPCR-Konditionen. ... 41
Tabelle 10: Vorhandensein der XBP1 gespleißten oder ungespleißten Form in reifen CD5+ und CD5- B-Zellen aus UCB und PB. ... 66
Tabelle 11: Ausgewählte Zytokine und ihre Funktionen/Einfluss. ... 74
1
1 Einleitung
1.1 Das humane Immunsystem
Physikalische, chemische und mikrobielle Barrieren schützen den menschlichen Or- ganismus vor körperfremden Krankheitserregern, sogenannten Pathogenen, wie zum Beispiel Bakterien, Pilzen oder Viren. Zur Identifizierung, Eliminierung und zum Schutz vor Pathogenen wirken diverse Abwehrmechanismen des humanen Immunsystems.
Das Immunsystem lässt sich in zwei Bereiche einteilen. Der erste, entwicklungsge- schichtlich ältere Bereich ist die angeborene Immunantwort, die größtenteils unspezi- fisch wirkt. Der zweite Bereich ist die adaptive Immunität, die Pathogene spezifisch abwehrt und nur bei höher entwickelten Organismen, wie z.B. bei Tieren oder Men- schen, vorkommt (Murphy & Weaver, 2018; Parkin & Cohen, 2001). Letztere ermög- licht außerdem ein immunologisches Gedächtnis, welches sich durch wiederholte In- fektion mit gleichem Erreger reaktivieren lässt.
Gemeinsam haben beide Bereiche, dass sie körperfremde Stoffe erkennen, neutrali- sieren und beseitigen können. Beide unterscheiden sich in ihrer Geschwindigkeit und Spezifität. Ein weiterer Unterschied liegt bei den beteiligten Zelltypen des blutbilden- den Systems.
1.1.1 Das angeborene Immunsystem
Das angeborene Immunsystem bietet die erste Abwehr gegen eingedrungene, körper- fremde Stoffe. Es reagiert zeitnah innerhalb von Minuten bis Stunden, kontrolliert und beseitigt Pathogene bevor die spezifische, adaptive Immunantwort greift.
Fremdstoffe, die bestimmte Pathogen-assoziierte Muster (engl.: pathogen associated molecular patterns, PAMPs) aufweisen, werden über sogenannte Mustererkennungs- rezeptoren (engl.: pattern recognition receptors, PRRs) auf einigen Immunzellen, wie zum Beispiel den Makrophagen, erkannt. Zu den PRRs zählen beispielsweise Toll- like-Rezeptoren (TLRs), die nach Bindung eines Pathogens Signalkaskaden auslösen können. PAMPs werden unter anderem auf Mikroorganismen exprimiert und können
2
z.B. bakterielle Zellwandbestandteile, Lipopolysaccharide, bakterielle oder virale Des- oxyribonukleinsäure (engl.: deoxyribonucleic acid, DNA) und virale Ribonukleinsäure (engl.: ribonucleid acid, RNA) sein. PAMPs sind nicht einzigartig für bestimmte Patho- gene, daher ist eine Immunabwehr, die auf ihrer Erkennung beruht, relativ unspezifisch (Murphy & Weaver, 2018).
Die angeborene Immunität besteht aus zellulären und humoralen Komponenten. Zu den humoralen Bestandteilen des angeborenen Immunsystems gehört das Komple- mentsystem. Etwa 30 Plasmaproteine werden vor allem in der Leber gebildet und sind an diesem System beteiligt. Es gibt drei verschiedene Aktivierungswege der Komple- mentkaskade, die sich je nach Auslöser unterscheiden. Dazu zählen der klassische Aktivierungsweg, ausgelöst durch einen Antigen-Antikörper-Komplex, der Lektin-Weg, initiiert durch Mannose-bindendes Lektin und der alternative Aktivierungsweg, ausge- löst durch Oberflächenstrukturen von Pathogenen. Das Komplementsystem erfüllt ver- schiedene Aufgaben. Bei der Opsonisierung werden PAMPs auf der Oberfläche von Pathogenen markiert und somit für Makrophagen erkennbar gemacht, die das Patho- gen anschließend aufnehmen und zersetzen. Bei der Lyse werden Poren in der Zell- membran von Pathogenen und Immunglobulin-markierten Zellen generiert, sodass Zy- tolyse eingeleitet wird. Tritt eine Entzündungsreaktion auf, werden mit einem Lockstoff- Gradienten Immunzellen rekrutiert (Murphy & Weaver, 2018).
Zu den zellulären Bestandteilen des angeborenen Immunsystems gehören dendriti- sche Zellen (DCs), Makrophagen, neutrophile Granulozyten, natürliche Killerzellen (NK) und Mastzellen. Mastzellen kommen wie Makrophagen und neutrophile Gra- nulozyten im Bindegewebe vor. Mastzellen besitzen verschiedene PRRs und einen Rezeptor für den Fc-Teil (engl.: fragment crystallizable) von Immunglobulin E (IgE).
Binden Mastzellen IgE-Antigen-Komplexe, so wird Histamin freigesetzt. Neben ihrer Rolle in der Abwehr von Parasiten sind Mastzellen an allergischen Reaktionen betei- ligt. Neutrophile Granulozyten werden über Pathogene und Zytokine aktiviert und kön- nen durch Phagozytose oder durch Exozytose bakterizide Stoffe aus ihren Granula ausschütten. Natürliche Killerzellen haben eine zytotoxische Aktivität. Zellen, denen der Haupthistokompatibilitätskomplex Typ I (engl.: major histocompatibility complex class I, MHC-I) fehlt oder die mit Viren infiziert sind, werden erkannt und in ihnen
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Apoptose ausgelöst. Makrophagen sind gewebsständige Zellen, die eine hohe Pha- gozytoseaktivität aufweisen. Makrophagen sind in allen Geweben vorhanden und ent- stehen durch Aktivierung von Monozyten. Makrophagen lassen sich in zwei Hauptklas- sen einteilen. M1-Makrophagen verteidigen den Wirt vor viralen und mikrobiellen In- fektionen, bekämpfen Tumore, produzieren hohe Mengen an entzündlichen Zytokinen und aktivieren die Immunantwort (Mantovani et al., 2007). M2-Makrophagen fördern die Beseitigung von Zelltrümmern, die Angiogenese, den Umbau und die Reparatur von verletztem/geschädigtem Gewebe. Außerdem kontrollieren M2-Makrophagen die Entzündungsreaktion, indem sie M1-vermittelte Funktionen herunterregulieren (Condeelis & Pollard, 2006; Mantovani et al., 2004; J. W. Pollard, 2009).
Makrophagen und DCs sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen (engl.: anti- gen presenting cells, APCs). Diese Zellen erkennen Pathogene über PRRs und expri- mieren Haupthistokompatibilitätskomplex Typ II (engl.: major histocompatibility com- plex class II, MHC-II) Moleküle sowie costimulatorische Moleküle auf ihrer Zelloberflä- che. Durch ihre Zytokin- und Chemokin-Sezernierung können Makrophagen und DCs außerdem immunmodulatorisch auf weitere Immunzellen wirken (Murphy & Weaver, 2018).
1.1.2 Das adaptive Immunsystem
Im Vergleich zur angeborenen Immunität benötigt das adaptive Immunsystem mehr Zeit, kann aber spezifisch auf Erreger reagieren, diese eliminieren und ein immunolo- gisches Gedächtnis ausbilden. Das immunologische Gedächtnis bewahrt den Orga- nismus vor einem erneuten Infektionsausbruch mit dem gleichen Erreger. Adaptive Immunantworten werden durch B- und T-Lymphozyten vermittelt. Die hohe Spezifität des adaptiven Immunsystems basiert auf einzigartigen B-Zell- (engl.: B cell receptor, BCR) und T-Zell- (engl.: T cell receptor, TCR) Rezeptoren, die für jede neu generierte Zelle individuell sind. Die adaptive Immunantwort bedingt eine Interaktion von Antigen- präsentierenden Zellen sowie B- und T-Zellen. Der Mechanismus ist in Abschnitt 1.4 erklärt. Im Folgenden wird auf die B-Zelle und ihre Entwicklung eingegangen.
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1.2 Frühe B-Zell-Entwicklung
Die frühe B-Zell-Entwicklung findet in der fötalen Leber statt und wird später im adulten Menschen im Knochenmark übernommen. Die Entwicklung ist ein Prozess aus meh- reren aufeinander folgenden Differenzierungsschritten, der zur Entstehung von reifen B-Zellen führt. Ein essenzieller Schritt ist die Ausbildung eines BCR. Erst eine B-Zelle mit funktionalem und nicht autoreaktivem BCR darf das Knochenmark als unreife, tran- sitionelle B-Zelle verlassen und wird in die Peripherie freigegeben, wo die restliche Ausreifung stattfindet. Der BCR besteht aus mehreren Gensegmenten, die durch so- matische Rekombination umgelagert werden. Die lösliche Form des BCRs ist ein An- tikörper, der auch als Immunglobulin (Ig) bezeichnet wird. Die Funktion eines BCRs bzw. eines Antikörpers ist es, ein spezifisches Antigen zu binden. Antikörper bestehen aus zwei leichten und zwei schweren Ketten. Es gibt eine variable, Antigen-erken- nende Region (engl.: variable region, V) auf der aminoterminalen-Seite und eine kon- stante Region (engl.: constant region, C) auf der carboxyterminalen-Seite. Es gibt mehrere Immunglobulin-Isotypen, die durch den C-Bereich der schweren Kette kodiert werden. Dazu gehören im Menschen Cµ für IgM, Cδ für IgD, eines von vier Cγ für IgG, eines von zwei Cα für IgA und Cε für IgE (Takahashi et al., 1982). Die V-Region lässt sich in zwei Bereiche einteilen. Der erste Bereich besteht aus konservierten, struktur- gebenden Regionen (engl.: frame work regions, FRs) und der zweite Bereich aus hy- pervariablen Regionen (engl.: complementarity determining regions, CDRs), welche die Bindungsfähigkeiten des Rezeptors bestimmen. Die V-Region der leichten Kette besteht aus einem V- (engl.: variability) und einem J- (engl.: joining) Segment. Beide können entweder durch Igκ- (40 Vκ und 5 Jκ) oder Igλ- (30 Vκ und 4 Jκ) Segmente kodiert sein (Murphy & Weaver, 2018). Die V-Region der schweren Kette besteht ne- ben dem V- und J-Segment, wie bei der leichten Kette, noch aus dem D- (engl.: diver- sity) Segment (Abbildung 1). Insgesamt können für die schwere Kette aus 40 V-, 27 D- und 6 J-Segmenten, eine Vielzahl an Rekombinationen gebildet werden (Corbett et al., 1997). Weitere Details zu Immunglobulinen sind in Kapitel 1.5 aufgeführt.
5
Abbildung 1: Schematische Darstellung der somatischen Rekombination.
Bei der Gensegmentumlagerung der schweren Kette findet zunächst eine Verknüpfung eines D- mit einem J-Seg- ment und dann eine V-zu-DJ-Verknüpfung statt. Bei der leichten Kette werden V- mit J-Segmenten verknüpft, da die D-Segmente fehlen. Danach folgt die Verknüpfung an den konstanten Terminus. Zwei schwere und zwei leichte Ketten werden kovalent miteinander verbunden und bilden den B-Zell-Rezeptor, der in seiner löslichen Form ein Antikörper ist (modifiziert nach (Dübel et al., 2019)).
Es gibt sechs Stadien der B-Zell-Entwicklung (Abbildung 2). Für die B-Zell-Entwicklung werden verschiedene Transkriptionsfaktoren benötigt. E2A (engl.: immunoglobulin en- hancer binding factors E12/E47) und EBF (engl.: early B cell factor) aktivieren die Ex- pression verschiedener Proteine, wie zum Beispiel die Komponenten RAG-1 und RAG-2, die für die Genumlagerung des BCRs zuständig sind (McBlane et al., 1995;
Oettinger et al., 1990). Die Gensegment-Umlagerung findet auf Chromosom 14 statt und beginnt in der Pro-B-Zelle mit der variablen Region der schweren Kette (VH).
Zuerst differenzieren hämatopoetische Stammzellen zu lymphoiden Vorläuferzellen (engl.: common lymphoid progenitor, CLP) mit Hilfe der Transkriptionsfaktoren Ikaros und Pu.1 (Yoshida et al., 2006; Yoshida et al., 2010). In den lymphoiden Vorläuferzel- len, aber vor allem in den frühen Pro-B-Zellen beginnt die Gensegment-Umlagerung.
Als erstes wird ein DH- (D-Segment der schweren Kette) mit einem JH- (J-Segment der schweren Kette) Segment zusammengelagert, wodurch sich die frühe Pro-B-Zelle zu einer späten Pro-B-Zelle entwickelt. Anschließend wird an die DHJH-Verknüpfung ein VH-Segment hinzugefügt. Kann eine Pro-B-Zelle keine Cµ-Kette produzieren, ist sie
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nicht in der Lage ein notwendiges Überlebenssignal über den Rezeptor zu erhalten und unterläuft Apoptose.
Die Einzigartigkeit der Antigenrezeptoren einer B-Zelle wird zusätzlich durch das En- zym Terminale Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) verstärkt. Die TdT tritt im Sta- dium der Pro-B-Zelle auf und fügt N-Nukleotide (engl.: nontemplated nucleotides) in die Verbindungsstellen zwischen den umgelagerten Gensegmenten ein (Alt, 1984;
Gilfillan et al., 1993).
Ein weiterer Prozess der B-Zell-Entwicklung ist der Allelausschluss, durch den sicher- gestellt wird, dass von einem Gen nur eines der beiden Allele exprimiert wird. Dadurch soll verhindert werden, dass eine B-Zelle zwei Rezeptoren mit unterschiedlichen Anti- genspezifitäten ausbilden kann. Der Allelausschluss betrifft sowohl das Gen für die schwere, als auch das für die leichte Kette (Löffert et al., 1996). Kann keine funktions- fähige leichte Kette gebildet werden, kann es am selben Allel zu wiederholten Umla- gerungen von bis dahin nicht verwendeten V- und J-Segmenten kommen, bevor wei- tere Umlagerungen am anderen Chromosom stattfinden müssen (Hesslein & Schatz, 2001). Neben dem Allelausschluss gibt es bei der leichten Kette noch einen Isotypaus- schluss. Beim Isotypausschluss ist eine B-Zelle nur in der Lage entweder κ oder λ zu exprimieren (Takeda et al., 1996).
Im Stadium der Pro-B-Zelle spielt insbesondere der Transkriptionsfaktor Pax5 (engl.:
paired box 5) eine besondere Rolle. Pax5 ist ein essenzielles Protein, das von E2A und EBF induziert wird. Pax5 ist zuständig für die Hemmung, aber auch für die Akti- vierung der Expression von Signalmolekülen (Cobaleda et al., 2007; S. L. Nutt et al., 1999). Unter anderem wirkt Pax5 auf das Gen für Igα. Igα ist eine signalgebende Kom- ponente des Prä-BCRs, der aus der Ig-schweren Kette, den Ersatz-leichten Ketten VpreB und λ5 sowie Igα und Igβ gebildet wird. Für den BCR ist Igα ebenfalls eine signalleitende Untereinheit. Fehlt Pax5, kann sich die Pro-B-Zelle nicht weiterentwi- ckeln und es findet keine weitere B-Zell-Entwicklung statt (S. L. Nutt et al., 1997).
Bei einer erfolgreichen VH-DH-JH-Umlagerung wird die vollständige schwere Kette des Igs als Teil des Prä-BCRs mit einer Hilfsleichtkette exprimiert und es können Igα- und Igβ-Signale ausgesendet werden. Anschließend erfolgt die Entwicklung der Zelle von
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der großen Prä-B-Zelle zur kleinen Prä-B-Zelle. In diesem Stadium wird die Expression der leichten Ersatzketten (VpreB und λ5) beendet und nur noch die schwere µ-Kette exprimiert. Durch eine erneute Expression der RAG-Proteine beginnen die kleinen Prä-B-Zellen mit der Umlagerung der Gensegmente für die leichte Kette. Im Erfolgsfall wird die Genumlagerung der leichten Kette des Igκ-Lokus auf Chromosom 2 durchge- führt, bevor bei Scheitern die Segmente des Igλ-Lokus auf Chromosom 22 benutzt werden. Es erfolgt eine Rekombination von Vκ zu Jκ, da die leichte Kette kein D-Seg- ment aufweist. Nach einer erfolgreichen Zusammenlagerung der leichten Kette, wird diese mit der schweren Kette gepaart und es entsteht eine unreife B-Zelle, die ein vollständiges IgM-Molekül auf der Zelloberfläche exprimiert. Das IgM-Molekül sendet wie zuvor beschrieben auch Signale über Igα und Igβ aus.
Ab dem Stadium der unreifen B-Zelle kann eine Wechselwirkung mit einem Antigen erfolgen. Unreife B-Zellen werden in diesem Stadium erneut auf Funktionalität, aber auch Autoreaktivität getestet. Zellen mit einem autoreaktiven BCR werden durch Apoptose eliminiert (negative Selektion), oder erneut bei einer Rekombination mit ver- bliebenen nicht-rearrangierten V-Gensegmenten der leichten Kette verwendet (Rezep- tor-Editing). B-Zellen mit funktionalem, nicht autoreaktiven BCR werden positiv selek- tiert, produzieren über alternatives Spleißen zusätzlich zur µ-Kette eine δ-Kette und verlassen das Knochenmark. In diesem Stadium weisen die Zellen einen reifen, Anti- gen-unerfahrenen IgDlow und IgMhigh Phänotypen auf (Murphy & Weaver, 2018). In Ab- bildung 2 ist eine graphische Darstellung der B-Zell-Entwicklung aufgeführt.
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Abbildung 2: B-Zell-Entwicklung.
Aufgezeigt sind Entwicklungsstadien der B-Zelle mit ihren BCR-Konfigurationen. Verschiedene Entwicklungspro- zesse wie die V-D-J-Genumlagerung und Proliferation sind mit Pfeilen über den jeweiligen B-Zell-Stadien darge- stellt. Der Transkriptionsfaktor E2A ist mit einem roten Pfeil angezeigt. CLP engl.: common lymphoid precursor, BCR engl.: B cell receptor, Imm. B engl.: immature B cell (modifiziert nach (Engel & Murre, 2001)).
1.3 B-Zell-Aktivierung durch T-Zell-unabhängige Immunantworten
B-Zellen können neben der T-Zell-abhängigen (engl.: T dependent, TD) Aktivierung auch T-Zell-unabhängig (engl.: T independent, TI) aktiviert werden. TI-Immunantwor- ten können durch zwei verschiedene Antigentypen ausgelöst werden. TI-Antigene des Typs 1 (TI-I, Mitogene) führen zur Stimulierung und polyklonalen Expansion der B- Zellen durch Kontakt über PRRs. Zu den TI-I-Antigenen gehören unter anderem bak- terielle Zellwandbestandteile wie Lipopolysaccharide (LPS) oder Bestandteile der bak- teriellen DNA wie CpG-Polymere (Murphy & Weaver, 2018). TI-Antigene des Typs 2 (TI-II) binden polyvalent durch ihre repetitiven Strukturen an die BCRs, dadurch wer- den mehrere BCRs aktiviert. Zu den TI-II-Antigenen werden z. B. Oberflächenstruktu- ren von Bakterienkapseln gezählt. TI-Immunantworten fördern meist die Generierung kurzlebiger Plasmazellen, die vorübergehend eine große Menge Antikörper sezernie- ren können. Die Bildung von langlebigen Plasmazellen oder Gedächtnis-B-Zellen fin- det bei TI-Immunantworten nicht statt (Defrance et al., 2011).
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1.4 Späte B-Zell-Entwicklung und Keimzentrumsreaktion
Die TD-Immunantwort beinhaltet eine Interaktion mit T-Zellen und geht mit einer Affi- nitätssteigerung des BCR und Differenzierung der B-Zellen einher. Ziel ist die Gene- rierung von B-Zellen mit spezifischer Selektivität für das entsprechende Pathogen und äquivalente Plasmazellen zur Sezernierung der ebenfalls hochspezifischen und affi- nen Antikörper, welche gezielt Pathogene binden.
Bei einer Infektion mit Pathogenen findet in Lymphfollikeln eine Keimzentrums- (engl.:
germinal center, GC) Reaktion statt. Während der GC-Reaktion spielt sich die Affini- tätsreifung des BCR ab, wodurch es zu einer höheren Vielfalt und Affinität der Antikör- per kommt und eine langlebige und effiziente Immunreaktion gebildet wird (I. C.
MacLennan, 1994).
Die Antigenbindung an den BCR aktiviert reife B-Lymphozyten und verändert die Kon- formation des BCR, wodurch ein intrazelluläres Signal ausgelöst wird. Reife B-Lym- phozyten wandern in sekundäre lymphatische Organe ein und treffen in der T-Zell- reichen Zone auf T-Helferzellen (TH-Zellen) und Antigen-präsentierende Zellen (APCs). Durch den Kontakt und die Interaktion der B-Zellen mit TH-Zellen werden Proliferationssignale in den B-Zellen ausgelöst und Keimzentren ausgebildet. Ein GC ist eine histologisch definierte Struktur, die unterschiedliche Bereiche mit den aktivier- ten B-Zellen (helle und dunkle Zone) und eine Mantelzone aus ruhenden B-Zellen auf- weist. In der dunklen Zone findet eine massive Proliferation und in der hellen Zone finden Selektionsprozesse statt. Mit Fortschreiten der Immunantwort nimmt das GC an Größe zu und bleibt für drei bis vier Wochen bestehen.
In der dunklen Zone des GCs reifen B-Zellen zu Zentroblasten, durchlaufen eine mas- sive Expansion und erfahren den Prozess der somatischen Hypermutation. Bei der somatischen Hypermutation werden V-Regionen der Ig-Gene modifiziert (Berek et al., 1991; Jacob et al., 1991; Küppers et al., 1993; I. C. MacLennan, 1994). Es können einzelne Nukleotide ausgetauscht, aber auch Insertionen und Deletionen verursacht werden. Der Prozess der somatischen Hypermutation konnte auch in einigen Nicht-Ig- Genen von Post-GC- und GC-B-Zellen nachgewiesen werden (Pasqualucci et al.,
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1998). Während der somatischen Hypermutation werden aus Zentroblasten Zentrozy- ten, die in die helle Zone des GCs einwandern. In der hellen Zone erfahren Zentrozyten in einer Interaktion mit follikulären dendritischen Zellen (FDCs) und follikulären TH-Zel- len einen Selektionsprozess. Unprozessierte Antigene auf den FDCs werden von den Zentrozyten erkannt und über ihren MHC-II- (Haupthistokompatibilitätskomplex Typ II) Komplex als prozessiertes Antigen präsentiert. Mittels CD40/CD40-Ligand-Interaktio- nen erhalten Zentrozyten mit hochaffinen BCRs Überlebenssignale und werden positiv selektiert (Silva & Klein, 2015). Nach einer positiven Selektion wandert die B-Zelle meist erneut in die dunkle Zone ein und durchläuft weitere Runden der Proliferation und der somatischen Hypermutation. Dadurch kann die Affinität des BCRs gesteigert werden (Kocks & Rajewsky, 1988; Victora et al., 2010).
In der hellen Zone des GCs findet der Prozess der Klassenwechselrekombination (engl.: class switch recombination, CSR) statt. Bei der CSR erfolgt ein Isotypwechsel.
Sowohl der Prozess der somatischen Hypermutation als auch der CSR wird von dem Enzym AID (engl.: activation-induced cytidine deaminase) initiiert (Nagaoka et al., 2002). Bei der somatischen Hypermutation desaminiert AID Cytidin zu Uracil und ak- tiviert somit verschiedene Reparaturmechanismen, wodurch ein Nukelotidaustausch verursacht werden kann. Bei der CSR werden durch die AID Doppelstrangbrüche ver- ursacht, die zum Austausch der konstanten Region führen. Dadurch werden Cµ und Cδ durch eine der vier Cγ, eine der zwei Cα oder Cε ersetzt. B-Zellen, die eine CSR durchlaufen sind und positiv selektioniert wurden, verlassen das GC und differenzieren entweder zu Plasmazellen und sezernieren Immunglobuline mit einem geänderten Iso- typ und höherer Affinität, oder werden zu Gedächtnis-B-Zellen (Gitlin et al., 2014;
Jacob et al., 1991). Gedächtnis-B-Zellen werden bei einem erneuten Kontakt mit dem- selben Antigen aktiviert und können innerhalb einiger Stunden eine Immunreaktion auslösen, damit ein erneutes Ausbrechen einer Infektion verhindert wird.
Durch die vielen Prozesse der B-Zell-Entwicklung und die GC-Reaktion werden Spe- zifität und ein langfristiges immunologisches Gedächtnis aufgebaut, jedoch können außerdem genetische Veränderungen auftreten, die nicht gewollt waren. Durch solche
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Komplikationen können Neoplasien, wie Leukämien und Lymphome, entstehen (Küppers & Dalla-Favera, 2001; Tsujimoto et al., 1985).
1.5 Immunglobuline
Es gibt fünf Ig-Klassen (IgA, IgD, IgE, IgM, IgG), wobei im Menschen IgG in vier und IgA in zwei Subklassen unterteilt werden. Ig bestehen aus je zwei leichten (κ und λ; je 25 kDa) und zwei schweren Ketten (µ, δ, γ, α und ε; je 50-77 kDa), die eine variable und eine konstante Region haben. Regionen sind in Domänen eingeteilt. Während die leichten Ketten je eine Domäne pro Region aufweisen, haben die schweren Ketten eine Domäne in der variablen Region und zwischen drei und vier Domänen (CH1, CH2, CH3 und CH4) in der konstanten Region. Die leichten Ketten sind über ihre Domäne in der konstanten Region über Disulfidbrücken kovalent mit der CH1-Domäne der schweren Kette verbunden. Weitere Disulfidbrücken verbinden die schweren Ketten untereinander. Jedes Ig besitzt zwei identische Antigen-bindende Bereiche, die als Fab-Fragmente (engl.: fragment antigen binding) bezeichnet werden und sich aus je- weils einer variablen und konstanten Domäne der leichten Kette und einer variablen und CH1-Domäne der schweren Kette zusammensetzen (Faber et al., 1998). Im Be- reich der CH2- und CH3- (evtl. CH4-) Domänen befindet sich das konstante Fc-Frag- ment, welches keine Antigen-bindende Aktivität aufweist. Das Fc-Fragment interagiert mit Effektormolekülen und Effektorzellen und ist für die unterschiedlichen Ig-Isotypen verantwortlich (Edelman, 1991).
Unterschiedliche Ig-Isotypen haben verschiedene Effektorfunktionen und erfüllen ihre Funktion in diversen Bereichen des menschlichen Organismus. Bei Antigenkontakt wird eine naive B-Zelle aktiviert und ist in der Lage multimeres, meist pentameres, selten aber auch hexameres IgM zu sezernieren. Der Wechsel von membranständi- gem zu sezerniertem Ig wird durch den Prozess des alternativen Spleißens ermöglicht.
Eine pre-mRNA kann zwei verschiedene mRNAs produzieren, die für den membran- ständigen oder sezernierten Antikörper verantwortlich sind. Durch das alternative Spleißen besitzt die mRNA des sezernierten Antikörpers im 3`-Bereich zwei Exons weniger als die membranständige mRNA (Peterson, 2007).
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IgM wird zeitlich früh in einer Infektion von kurzlebigen Plasmazellen sezerniert. IgM ist im Vergleich zu anderen Antikörpern verhältnismäßig groß. Auf Grund der Größe liegt IgM vor allem im Blut, aber auch in der Lymphflüssigkeit vor und aktiviert das Komplementsystem (Janeway CA Jr, Travers P, Walport M, et al., 2001). IgA, IgE und IgG sind kleiner als IgM und diffundieren leichter vom Blut ins Gewebe. IgE und IgG liegen immer als Monomer vor, während IgA Dimere bilden kann. B-Zellen, die diese Isotypen sezernieren, haben meist eine Keimzentrumsreaktion durchlaufen und wei- sen eine erhöhte Affinität gegenüber ihrem Antigen auf.
IgG ist der häufigste Antikörper im Blut und den extrazellulären Flüssigkeiten. IgG ak- tiviert das Komplementsystem und opsonisiert Pathogene für die Aufnahme durch Phagozyten (Diebolder et al., 2014). Außerdem kann IgG die Plazenta durchdringen und in das Blut des Fötus gelangen. Neugeborene weisen aus diesem Grund einen genauso hohen IgG-Level mit der gleichen Antigenspezifität, wie ihre Mutter, auf (Pitcher-Wilmott et al., 1980). Eine weitere Funktion des IgG-Antikörpers ist seine neut- ralisierende Wirkung. IgG kann nach der Affinitätsreifung eine hohe Affinität aufweisen und schnell ins Gewebe diffundieren. Aus diesem Grund eignet sich IgG vor allem zur Neutralisierung von Bakterientoxinen in Geweben, aber auch als virusneutralisieren- der Antikörper (Ourth & MacDonald, 1977; Palladino et al., 1995).
IgA ist der häufigste Antikörper in Sekreten. Insbesondere tritt IgA in Darm- und Lun- genepithelien auf und schützt die epithelialen Oberflächen vor Krankheitserregern. IgA wirkt vor allem an Körperoberflächen, ist aber auch im Blut auffindbar, wo es als IgA1- Monomer vorliegt und hauptsächlich als ein neutralisierender Antikörper fungiert. Im Darm vorliegende IgA-Antikörper regulieren die Mikroflora, sind meist vom Subtyp IgA2 und kommen als Dimer vor (Suzuki et al., 2004). Das IgA-Dimer wird über eine J-Kette (engl: joining chain) verbunden. Die J-Kette erleichtert die Sezernierung an Schleimhautoberflächen bzw. die Transzytose des Antikörpers durch Epithelzellen der Schleimhäute. Außerdem wird der IgA-Antikörper in die Muttermilch sezerniert und kann so im Darm des Neugeborenen vor Bakterien schützen (Rogier et al., 2014).
IgE-Antikörper sind vor allem an den Rezeptoren von Mastzellen aufzufinden und lö- sen lokale Abwehrmechanismen aus. Bei Antigenbindung an IgE werden von den
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Mastzellen chemische Mediatoren freigesetzt und körperliche Symptome, wie z.B.
Husten oder Niesen ausgelöst (Amin, 2012; Theoharides et al., 2012).
Antikörper weisen viele verschiedene Funktionen auf, jedoch haben sie gemeinsam, dass sie Antigene spezifisch binden können (Litman et al., 1999).
1.5.1 Immunglobulin M
Naive B-Zellen exprimieren membranständiges monomeres IgM als BCR. Monomeres IgM weist in der Regel eine geringere Affinität als klassengewechselte, affinitätsge- reifte Antikörper auf, jedoch wird nach Sezernierung durch die multimere (Pentamer, Hexamer) Strukturbildung (Abbildung 3) eine hohe Avidität zwischen dem IgM-Molekül und dem Antigen erreicht. Dies geschieht insbesondere, wenn das Antigen mehrere sich wiederholende Epitope aufweist.
Erfolgt eine IgM-Sezernierung, so werden monomere IgM-Moleküle durch Disulfidbrü- cken zwischen den CH4-Domänen miteinander verbunden und im Fall eines Penta- mers ein Ringschluss durch eine J-Kette erzeugt.
Durch seine multimere Struktur besitzt IgM eine vergleichsweise große Molekülmasse (950 kDa bzw. 1150 kDa) und kommt vorwiegend im Blutkreislauf vor (Fridman, 1997).
IgM ist das erste Immunglobulin, das in Neugeborenen gebildet wird und im Serum aufzufinden ist. In Neugeborenen liegt die Serumkonzentration von IgM bei etwa 0,1 g/l bis 0,7 g/l. Erwachsene weisen im Serum eine IgM-Konzentration von 0,4 g/l bis 2,3 g/l auf. IgM hat eine Halbwertszeit von fünf Tagen (Gressner & Arndt, 2013).
Außerdem kann IgM, sowie die meisten IgG-Isotypen, mit dem Komplementfaktor C1 interagieren und den klassischen Komplementweg aktivieren (Murphy & Weaver, 2018). Dabei aktiviert das hexamere IgM das Komplementsystem 20-fach effizienter als das pentamere IgM (Randall et al., 1990; Wiersma et al., 1998).
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Abbildung 3: Pentamere und hexamere IgM-Struktur.
Pentameres IgM (links) und hexameres IgM (rechts) besteht aus je fünf oder sechs aneinander, über Disulfidbrü- cken der CH4-Domäne gebundene IgM-Moleküle. Die variablen Regionen der leichten und der schweren Ketten sind in Rot dargestellt. Das pentamere IgM weist eine J-Kette auf (modifiziert nach (Mader et al., 2013)).
1.6 Plasmazelldifferenzierung und ihre Transkriptionsfaktoren
Reife naive B-Zellen können nach Aktivierung zu Plasmazellen differenzieren. Die Dif- ferenzierung erfolgt entweder durch Keimzentrumsreaktionen in sekundären Lymphfollikeln oder extrafollikulär (I. C. M. MacLennan et al., 2003). Plasmazelldiffe- renzierung wird durch bestimmte Transkriptionsfaktoren reguliert. Dazu gehören Fak- toren, die das reife B-Zellstadium und die dafür notwendige Genexpression kontrollie- ren, z.B. Pax5. Zusätzlich sind Faktoren beteiligt, die zu Masterregulatoren der Plas- mazelldifferenzierung zählen, wie z.B. PRDM1 (engl.: PR domain zinc finger protein 1), welches die Expression von BLIMP-1 (engl.: B lymphocyte induced maturation pro- tein1) reguliert (Tunyaplin et al., 2004) (Abbildung 4).
Der Transkriptionsfaktor Pax5 wird auf den Zellen vom frühen Pro-B-Zellstadium bis hin zur Plasmazelldifferenzierung exprimiert und reprimiert Gene wie z.B. PRDM1, XBP1 (engl.: X-Box-binding protein 1) und IgJ (Immunglobulin J) (Delogu et al., 2006;
Nera et al., 2006; Reimold et al., 1996; Rinkenberger et al., 1996). Außerdem wird zur Differenzierung und Ig-Sezernierung der Transkriptionsfaktor IRF4 (engl.: interferon regulatory factor 4) benötigt. IRF4 ist in geringer Menge zur Klassenwechselfunktion vorhanden. Zur Differenzierung nimmt die IRF4-Expression deutlich zu und begünstigt
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die Produktion Antikörper-sezernierender Zellen (ASZ) sowie die Ig-Sezernierung (Klein et al., 2006). Der Transkriptionsfaktor XBP1 ist ein Leucin-Zipper Protein, wel- ches in adulten Menschen ubiquitär, aber insbesondere in fetalen exokrinen Drüsen, Osteoblasten, Chondroblasten und der Leber aufzufinden ist. Es ist stark induziert in ASZ in Kombination mit Verlust der Pax5-vermittelten Genregulation und posttran- skriptionaler Kontrolle durch die ungefaltete Proteinantwort (engl.: unfolded protein response, UPR) im endoplasmatischen Retikulum (Reimold et al., 2001). Der Tran- skriptionsfaktor BLIMP-1 wird erst in ASZ exprimiert (Kallies et al., 2004). Wie die Fak- toren XBP1 und IRF4 ist auch BLIMP-1 für die Ig-Sezernierung und ASZ von Bedeu- tung.
Zusammenfassend wird in einer naiven B-Zelle Pax5 exprimiert, wird die Expression von Transkriptionsfaktoren wie XBP1 und PRDM1 verhindert und die Expression von IgJ unterbunden. Nach Aktivierung der B-Zelle durch ein Pathogen wird die Expression von Pax5 verringert und die Expression von BLIMP-1 durch IRF4 eingeleitet. Dies mündet schließlich in der Expression von XBP1 und IgJ, einer Differenzierung zu ASZ und Ig-Sezernierung (Abbildung 4).
Abbildung 4: Transkriptionsfaktoren während der Plasmazelldifferenzierung.
Bei einer reifen, ruhenden, naiven B-Zelle (engl.: resting B cell) wird Pax5 exprimiert und die Expression der Fak- toren BLIMP-1, XBP1 und J-Kette (engl.: J-Chain) inhibiert. Bei Aktivierung einer B-Zelle (engl.: activated B cell) und Differenzierung zum Prä-Plasmablast (engl.: preplasmablast) wird der Transkriptionsfaktor Pax5 reduziert und die Inhibierung von XBP1 und J-Kette aufgehoben. Bei der Ausdifferenzierung zum Plasmablast wird die Expres- sion von XBP1 und IRF-4 sowie von der J-Kette durch BLIMP-1 induziert, während die Pax5-Expression inhibiert wird (modifiziert nach (Kallies et al., 2007)).
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1.7 Das CD5-Molekül und CD5
+B-Zellen
Das humane CD5- (engl.: cluster of differentiation 5) Molekül ist ein Transmembran- Glykoprotein und gehört zur Familie der Rezeptoren, die extrazelluläre Domänen ent- halten und homolog zur Typ I-Makrophagen-Scavenger-Rezeptor-Cysteinreichen-Do- mäne sind (Padilla et al., 2000). Es wird auf Chromosom 11 kodiert und hat eine Mo- lekülmasse von 67 kDa (Huang et al., 1987). CD5 wird auf der Oberfläche von fast allen T-Lymphozyten und nur bei einer Gruppe von ca. 5-30% reifer B-Lymphozyten im Menschen exprimiert (Caligaris Cappio et al., 1981; Padilla et al., 2000; Youinou et al., 1999). CD5 rekrutiert intrazellulär die Tyrosinphosphatase SHP-1 (engl.: Src ho- mology 2 domain-containing phosphatase 1) und reduziert die Zellaktivierung durch Attenuierung der BCR- bzw. TCR-Signaltransduktion (Bikah et al., 1996; Sen et al., 1999). Die phosphorylierte und aktivierte Tyrosinphosphatase SHP-1 unterdrückt die intrazelluläre Rezeptorsignalweiterleitung und führt so vermutlich zur Vermeidung von Autoreaktivität (Bikah et al., 1996). Als Ligand für CD5 werden Interleukin-6 (IL-6), CD72 und CD5 selbst diskutiert (Brown & Lacey, 2010; van de Velde et al., 1991). Das CD5-Molekül ist konserviert und lässt sich in Hasen (Raman & Knight, 1992), Hühnern (Koskinen et al., 1998), Meerschweinchen (Appleyard & Wilkie, 1998), Rindern (Yang et al., 1995), Schafen (Chevallier et al., 1998) und Mäusen (Förster & Rajewsky, 1987) nachweisen.
In Mausmodellen lässt sich durch die Ausprägung von CD5 auf der Zelloberfläche eine distinkte B-Zelllinie beschreiben (Kantor & Herzenberg, 1993). B-1a-Zellen, die im Ge- gensatz zu B-1b-Zellen CD5 exprimieren, sind in der Maus vor allem im Peritoneum und im Pleuraraum, aber auch im peripheren Blut aufzufinden und benötigen keine T- Zell-Hilfe bei den Immunantworten. Es ist bekannt, dass CD5+ B-Zellen „spontan“ IgM sezernieren können. Dieses „natürliche“ IgM ist polyspezifisch und besitzt gleichzeitig verschiedene Antigen- und Autoantigenspezifitäten. Dadurch erfolgt eine unspezifi- sche, schnelle und vielseitige Immunreaktion gegen diverse Pathogene (Hardy &
Hayakawa, 1994). Außerdem soll dieser Mechanismus nicht durch Aktivierung durch Pathogene hervorgerufen werden, sondern spontan stattfinden und einen natürlichen IgM-Titer aufbauen (Förster & Rajewsky, 1987; Sidman, Shultz, Hardy, Hayakawa, &
Herzenberg, 1986). Zudem weisen B-1a-Zellen ein Selbsterneuerungspotential auf
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(Förster & Rajewsky, 1987). Wie bei humanen Neugeborenen haben Jungtiere ein un- ausgereiftes Immunsystem und sind durch Infektionen stärker gefährdet als adulte Tiere mit ausgereiftem Immunsystem. B-1a-Zellen bilden durch die Sezernierung von polyreaktiven Antikörpern und der Bildung eines konstanten IgM-Titers eine erste Ver- teidigungsinstanz gegen Infektionen zum Schutz der Jungtiere.
Im Menschen sind insbesondere im Nabelschnurblut (UCB) und in der fötalen Leber CD5+ B-Zellen aufzufinden. Zudem lassen sich CD5+ B-Zellen im Knochenmark und im peripheren Blut von Erwachsenen (PB) nachweisen (Youinou et al., 1999). Unter allen B-Zellen beträgt der Anteil an CD5+ B-Zellen in PB ca. 20% (Youinou et al., 1999).
Sowohl transitionelle als auch reife B-Zellen können CD5 exprimieren (Sims et al., 2005). Die Funktion humaner reifer CD5 exprimierender Zellen ist bis heute nicht voll- ständig geklärt. Bisher sind unterschiedliche Funktionen benannt worden. Zum Bei- spiel beschreiben Werner-Favre et al., dass CD5 ein Marker für aktivierte B-Zellen ist.
Dabei soll CD5 nach Aktivierung einer konventionellen B-Zelle, die vorher kein CD5 aufgezeigt hat, ausgeprägt sein (Werner-Favre et al., 1989). Diese Aussage eröffnet die Frage, ob CD5 auf humanen B-Zellen z.B. als Aktivierungsmarker transient auftritt, oder ob CD5 als festes und konstantes Oberflächenmolekül auf bestimmten B-Zellen, unabhängig von der Aktivierung vorkommt und einen Marker für eine distinkte Popu- lation reifer B-Zellen darstellt. Im Fall einer distinkten Population durch reife CD5+ B- Zellen, bleibt die Frage nach deren immunologischen Funktion.
CD5 wird zudem mit diversen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Zum Beispiel sind CD5+ B-Zellen in SLE (Systemischer Lupus erythematodes) (Youinou &
Renaudineau, 2011), rheumatoider Arthritis (Verwilghen et al., 1993) und schließlich der malignen Erkrankung CLL (chronische lymphatische Leukämie) (Seifert et al., 2012) deutlich vermehrt.
1.8 Innate response activator (IRA) B-Zellen
Im Jahr 2012 wurde bei einem Forschungsvorhaben zum besseren Verständnis der Sepsis-Infektion in einem Mausmodell eine neue Untergruppe von B-Zellen identifi-
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ziert. Diese wird als Innate response activator (IRA) B-Zellen bezeichnet und tritt wäh- rend einer LPS-induzierten Entzündung durch B-1a-Zellen und einer starken Zellakti- vierung durch TLRs auf (Rauch et al., 2012).
Rauch et al. machten es sich zur Aufgabe die Quelle des Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktors (engl.: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) in der Milz ausfindig zu machen. Die Forscher injizierten Knockout- Mäusen, denen unter anderem B-Zellen, TLR4, Myd88, TIR-Domänen enthaltendes Adapter-induzierendes Interferon-β (TRIF) oder BAFF- (B-Zell-Aktivierungsfaktor) Re- zeptor fehlten und in denen VLA4 (engl.: very late antigen 4) blockiert war, LPS und stellten vier Tage danach, unter Verwendung von intrazellulären Antikörperfärbungen und durchflusszytometrischer Analyse, eine für GM-CSF positive B-Zellpopulation in der roten Pulpa der Milz fest. Außerdem produzierten diese Zellen große Mengen IgM.
IRA B-Zellen waren in der Mausmilz nur auffindbar, wenn in den Mäusen B-Zellen oder BAFF-Rezeptor vorhanden war und VLA4 nicht blockiert wurde. Zusätzlich exprimier- ten diese Zellen Marker, die normalerweise für B-1-Zellen charakteristisch sind. Auf dieser Grundlage kamen die Forscher zu dem Schluss, dass IRA B-Zellen von peri- tonealen B-1a-Zellen abstammen müssen, die nach Erkennung von LPS durch TLR4 in die Milz relokalisieren, GM-CSF, IL-3 und IgM produzieren, und somit weitere Zellen wie z.B. DCs anlocken und stimulieren können (Chousterman & Swirski, 2015) (Abbil- dung 5).
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Abbildung 5: Funktion der IRA B-Zellen.
B-1a-Zellen werden durch LPS bzw. durch ein Pathogen über TLR4 stimuliert und relokalisieren dadurch aus dem Peritoneum oder dem Pleuraraum in die Milz oder Lunge, wo sie zu IRA B-Zellen ausdifferenzieren. IRA B-Zellen sezernieren GM-CSF wodurch die IgM-Sezernierung bekräftigt wird und aktivieren DCs, sowie die Proliferation von hämatopoetischen Stammzellen (HSPCs). Zusätzlich wird IL-3 produziert und die Produktion von Monozyten und neutrophilen Granulozyten gefördert. Rolle und Ursprung der IRA B-Zellen im Thymus sind noch ungeklärt (Chousterman & Swirski, 2015).
Nach der Identifizierung GM-CSF produzierender B-Zellen wurde eine chimäre Maus generiert, deren B-Zellen nicht in der Lage sind GM-CSF zu produzieren. Diese Mäuse wurden einem polymikrobiellem Sepsis-Modell ausgesetzt, indem ihr Dickdarm ligiert und punktiert wurde. Die Sepsis ist ein lebensbedrohlicher Prozess, dem eine fehlge- steuerte Immunreaktion zugrunde liegt. Der Auslöser ist meist eine bakterielle Infek- tion, aber auch Infektionen durch Viren, Pilze oder Parasiten können eine Sepsis aus- lösen (Werdan et al., 2016). In Deutschland erkranken täglich mehr als 400 Menschen an Sepsis, wobei jeder Dritte daran verstirbt (Sademon, 2019).
Die Eliminierung der IRA B-Zellen verursachte in den Mäusen eine stark ausgeprägte Entzündungsreaktion, löste einen Zytokinsturm und eine schwere Bakteriämie aus und führte schließlich zu einem septischen Schock, Multiorganversagen und zum Tod. Auf
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Grund dessen, dass GM-CSF-defiziente Mäuse früher und in größerer Anzahl starben als die Kontrollmäuse, wurde davon ausgegangen, dass IRA B-Zellen protektiv bei Sepsis wirken (Rauch et al., 2012).
Weber et al. knüpften an diesem Punkt an und überprüften die protektive Rolle des GM-CSF in einem Modell der Atemwegsinfektion bei Mäusen. Sie spekulierten auf Grund der Annahme, dass IRA B-Zellen IgM produzieren und exprimieren, dass GM- CSF die IgM-Sezernierung durch eine autokrine loop durchführt. Mit Hilfe von in vitro Experimenten mit GM-CSF-defizienten B-1a-Zellen wurde nach LPS Zugabe die IgM- und GM-CSF-Produktion beobachtet. Außerdem konnte durch Zugabe von GM-CSF zu GM-CSF-defizienten Zellen eine IgM-Produktion wiederhergestellt werden. Somit konnte festgestellt werden, dass B-1a-Zellen im Mausmodell aus dem Pleuraraum in die Lunge relokalisierten, wo sie durch GM-CSF-Produktion über eine autokrine loop IgM sezernierten. Resultierend deuteten Weber et al., dass es eine protektive B-Zell- population außerhalb der Lunge geben muss, die nach einer Lungeninfektion schnell mobilisiert wird, die GM-CSF produziert und die IgM-Sezernierung begünstigt, wodurch der Wirt geschützt wird, indem IgM Bakterien erkennt und sie durch Phagozy- tose eliminiert (Weber et al., 2014).
Zusätzlich zum Sepsis- und Atemwegsinfektionsmodell wurden IRA B-Zellen bei Mäu- sen mit Atherosklerose detektiert. Atherosklerose ist eine degenerative Erkrankung der arteriellen Gefäßwände, die für eine Vielzahl von kardiovaskulären Erkrankungen die Ursache bildet (Swirski & Nahrendorf, 2013). Im Modell wurde den Mäusen eine fett- reiche Nahrung verabreicht und eine Ansammlung von IRA B-Zellen in sekundären Lymphorganen nachgewiesen. IRA B-Zellen aktivieren bei Atherosklerose in der Milz myeloide Zellen, zum Beispiel DCs, die IL-12 sezernieren. Auf diese Weise wird eine IFN-γ- (Interferon-γ) dominante TH1-Umgebung generiert, die Atherosklerose begüns- tigt. Werden GM-CSF-produzierende IRA B-Zellen eliminiert, wird die TH1-Immunant- wort verringert und atherosklerotische Läsionen bilden sich weniger stark aus (Hilgendorf et al., 2014).
Neben der Produktion von GM-CSF und IgM wurde die Ausschüttung von IL-3 unter- sucht, da es ein wichtiges Zytokin für die Leukozyten-Produktion, Proliferation und das
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Zellüberleben darstellt (Williams et al., 1990). Weber et al. führten dazu Experimente mit IL-3 defizienten Mäusen im Sepsismodell durch. Im Vergleich zu Wildtyp Mäusen, waren IL-3-defiziente Mäuse besser gegen Sepsis geschützt. Durch die IL-3 Sezernie- rung wurde die Produktion von Monozyten und neutrophilen Granulozyten angeregt.
Diese Zellen sezernieren viele Zytokine, wodurch ein Zytokinsturm hervorgerufen wurde, der mit schwer einhergehender Sepsis, einem septischen Schock, sowie Org- anschäden bis hin zum Tod, verbunden war (Weber et al., 2015).
Zusammenfassend gibt es positive und negative Einflüsse der IRA B-Zellen auf ver- schiedene Krankheitsmechanismen. Einerseits wirken die Zellen protektiv durch Pro- duktion von GM-CSF bei Sepsis und Atemwegsinfektionen, indem sie neutralisierende Antikörper in Form von IgM sezernieren. Andererseits wird durch die GM-CSF-Produk- tion eine dominante TH1-Immunantwort generiert, die Atherosklerose begünstigt, und durch IL-3 Sezernierung werden weitere Immunzellen akquiriert, wodurch es bei einer septischen Infektion zu einem unvorteilhaften Verlauf kommen kann.
In den beschriebenen Mausmodellen wird davon ausgegangen, dass IRA B-Zellen B- 1-Zellen sind. B-1-Zellen lassen sich durch eine Ausprägung von CD5 auf der Zell- oberfläche beschreiben und sind in Mausmodellen eine distinkte B-Zelllinie. Die Funk- tion humaner reifer CD5 exprimierender Zellen, bzw. ihre Verwandtschaft mit murinen B-1-Zellen, ist bis heute nicht vollständig geklärt. Es stellt sich die Frage, ob CD5 im Menschen als konstantes Oberflächenmolekül auf bestimmten B-Zellen, unabhängig von der Aktivierung, vorkommt und einen Marker für eine distinkte Population reifer B- Zellen darstellt. Im Fall einer distinkten Population durch reife CD5+ B-Zellen, bleibt die Frage, ob CD5+ B-Zellen im Menschen, ähnlich wie in den Mausmodellen eine immun- modulatorische Funktion aufweisen können.
1.9 Ziele der Arbeit
Die Rolle humaner, reifer CD5+ B-Zellen in gesunden Menschen wird in der Literatur bis heute diskutiert, jedoch werden CD5+ B-Zellen mit diversen Erkrankungen in Ver-
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bindung gebracht. Dazu zählen beispielsweise SLE, rheumatoide Arthritis und die ma- ligne Erkrankung CLL. Unter allen B-Zellen in gesunden Menschen beträgt der Anteil an CD5+ B-Zellen in PB unter 20%.
Im Rahmen dieser Arbeit sollen humane reife CD5+ B-Zellen molekular und funktionell charakterisiert und parallele Eigenschaften zu B-1a-Zellen aus Mausmodellen heraus- gestellt werden. B-1a-Zellen in Mäusen werden als Antigen-unerfahrene, ontogene- tisch frühe B-Zellen beschrieben. Aus diesem Grund werden in dieser Arbeit reife CD5+ B-Zellen aus Nabelschnurblut (engl.: umbilical cord blood, UCB) isoliert und phänoty- pisch und funktionell mit reifen CD5+ B-Zellen aus peripherem Blut von Erwachsenen (PB) verglichen. Außerdem sollen weitere typische B-1a-Zell-Eigenschaften wie die Fähigkeit unabhängig von T-Zell-Hilfe reagieren und „spontan“ IgM sezernieren zu können, untersucht werden. Kann eine „spontane“ IgM-Sezernierung festgestellt wer- den, so soll untersucht werden welcher Mechanismus dafür verantwortlich ist und ob humane reife CD5+ B-Zellen bevorzugt pentamere oder hexamere IgM-Moleküle se- zernieren.
Des Weiteren ist aus Mausmodellen bekannt, dass B-1a-Zellen in Form von IRA B- Zellen immunmodulatorische Wirkung zeigen können. Im Fokus dieser Arbeit soll da- her das Aufklären möglicher immunmodulatorischer Fähigkeiten von humanen reifen CD5+ B-Zellen stehen. Dabei soll untersucht werden, welche Zytokine durch humane reife CD5+ B-Zellen produziert werden können und auf welche Zellen des Immunsys- tems diese Zytokine Auswirkungen zeigen.
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2 Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Chemikalien und Reagenzien
Acetonitril Roth, Karlsruhe
Albumin Fraktion V (BSA) Roth, Karlsruhe
Agarose Wide Range Serva, Heidelberg
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent
GE Healthcare, UK
Ammoniumcitrat Sigma Aldrich, Darmstadt
Ammoniumhydrogencarbonat Roth, Karlsruhe
Ammoniumsulfat Roth, Karlsruhe
6-Aza-2-thiothymin Sigma Aldrich, Darmstadt
BD GolgiPlug BD Biosciences, Heidelberg
BD GolgiStop BD Biosciences, Heidelberg
Bidest. Wasser Roth, Karlsruhe
Busulfan (Busilvex) Pierre Fabre Pharma, Sankt Georgen CD40 Ligand, recombinant, human
(CD40L)
R&D Systems, USA
Cell Proliferation Dye eFluor 670 Thermo Fisher Scientific, USA
Chloroform Roth, Karlsruhe
Coomassie Brilliant Blue G250 Puder Serva, Heidelberg Coomassie Brilliant Blue R250 Serva, Heidelberg
2,4-Dihydroxybenzoesäure Bruker Daltonics, Bremen
Dimethylsulfoxid Roth, Karlsruhe
DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich, Darmstadt
dNTPs Thermo Fisher Scientific, USA
Dye eFluor 670 Thermo Fisher Scientific, USA
Essigsäure Acros Organics, USA
Fötales Kälberserum (FCS) Pan-Biotech, Aidenbach
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GelRed Nucleic Acid Gel Stain Biotium, Fremont, USA
GolgiPlug BD Biosciences, Heidelberg
GolgiStop BD Biosciences, Heidelberg
Iodacetamid Sigma Aldrich, Darmstadt
Iodmethan Merck, Darmstadt
Methanol Roth, Karlsruhe
MgCl2 (25 mM) Thermo Fisher Scientific, USA
Natriumhydroxid Riedel-de Haën, Seelze
ODN D-SL01 (CpG) InvivoGen, USA
Orange Loading Dye, (6x) Thermo Fisher Scientific, USA
Pancoll Pan-Biotech, Aidenbach
Penicillin (10000 U/ml) -Streptomycin (10mg/ml)
Pan-Biotech, Aidenbach
RNAse-freies Wasser Qiagen, Hilden
TaqMan Universal PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific, USA Thapsigargin (2 nM) Sigma-Aldrich Chemie, Schnelldorf Trifluoressigsäure Thermo Fisher Scientific, USA
Tween-20 Roth, Karlsruhe
Ultrareines Wasser Roth, Karlsruhe
2.1.2 Verbrauchsmaterialien
Becherglas 200 ml Thermo Fisher Scientific, USA
Falcon-Gefäße 15 ml, 50 ml Sarstedt, Nümbrecht
Leucosep-Gefäße Greiner Bio One, Frickenhausen
Low-Binding-Reaktionsgefäße 0,2 ml, 1,5 ml, 2 ml Sarstedt, Nümbrecht
LS-Säule Miltenyi Biotec, Bergisch Glad-
bach
Pipettenspitzen 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1000 µl Sarstedt, Nümbrecht
PP-Schraubgewindekappen, 9 mm Thermo Fisher Scientific, USA
Reagenzglas 15 ml Kobe, Marburg
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Reaktionsgefäße 0,2 ml, 1,5 ml, 2 ml Eppendorf, Hamburg
Roti-PVDF Transfermembran Roth, Karlsruhe
Serologische Pipetten 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml Sarstedt, Nümbrecht
96-Well Mikroplatte Greiner Bio-One, Frickenhausen
96-Well-PCR Platte Biozym Scientific, Hessisch
Oldendorf
2.1.3 Geräte
AriaMx Real-Time PCR System Agilent Technologie, USA
Biometra UNO II Biometra, Göttingen
BioTek Synergy HAT Microplate reader BioTek Instruments, Bad Friedrichshall Dual Cool Mini-Vertical Electrophore-
sis/Blotting Sytem
Expedeon, UK
Durchflusszytometer CytoFLEX S Beckman Coulter, Krefeld
Elektrophoresis Power Supply EPS200 Amersham Pharmacia Biotech, UK ELISpot Reader System Autoimmun Diagnostika, Strassberg
Fusion FX7 Peqlab, Erlangen
Gel Doc XR+ Molecular Imager Bio-Rad, USA Gefrierschränke (-20 °C, -80 °C) Bosch, Gerlingen
Liebherr, Bulle
Gefriertrockner Alpha 1-4 Martin Christ, Osterode am Harz Genetic Analyzer 3130 Applied Biosystems, USA
iBlot Dry Blotting System Invitrogen, USA
Kühlschrank Liebherr, Bulle
Megafuge 1.0R Thermo Fisher Scientific, Darmstadt
Mini-Protean Elektrophoresekammer Bio-Rad, München
Mini-Zentrifuge Color Sprout Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf Multifuge 3S Heraeus Thermo Fisher Scientific, USA
Mikrowellen Herd GT 8804 General Technic, Howald, Luxemburg MTP Anchor Chip Platte Bruker Daltonics, Bremen
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NanoDrop ND-1000 Spektrophotometer Thermo Fisher Scientific, USA Owl Easy-Cast Electrophoresis System,
Model 82
Thermo Fisher Scientific, USA
Pipetten Eppendorf Research 2,5 µl, 20 µl, 100 µl, 200µl, 1000 µl
Eppendorf, Hamburg
Pipettierhilfe Pipetus Hirschmann, Eberstadt Thermoschüttler MKR-13 HLC Biotech, Bovenden T professional Thermocycler Biometra, Göttingen
Tube Roller Thermo Fisher Scientific, USA
Ultraflex II TOF/TOF Bruker Daltonics, Bremen Ultraschallbad Sonorex Bandelin Electronic, Berlin Vakuumpumpe ME 4C NT Vacuubrand, Wertheim
Vakuumzentrifuge Jouan RC1010 Thermo Fisher Scientific, USA
Vortex Genie Scientific Industries, USA
Waage AE240 DR Mettler Toledo, Gießen
XCell II Blot Module Thermo Fisher Scientific, USA Xcell SureLock Mini-Cell Thermo Fisher Scientific, USA Zellsortierer BD FACSAria III BD Biosciences, Heidelberg Zellsortierer BD FACSAria Fusion BD Biosciences, Heidelberg Zentrifuge Heraeus Pico Thermo Fisher Scientific, USA Zentrifuge Hettich EBA 12 Andreas Hettich, Tuttlingen Zentrifuge Himac CT 15E Hitachi Koki, Japan
2.1.4 Längenstandard / Marker
FastLoad 50 bp DNA Ladder Serva, Heidelberg MagicMark XP Western Protein Stan-
dard
Thermo Fisher Scientific, USA
NativeMark Unstained Protein Standard Invitrogen, USA
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, USA
Peptidstandard Bruker Daltonics, Bremen
27 2.1.5 Micro Beads
CD14 MicroBeads, human Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach CD19 MicroBeads, human Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Treg Suppression Inspector, human Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
2.1.6 Enzyme
Taq-DNA-Polymerase, recombinant (5 U/µl) Thermo Fisher Scientific, USA
2.1.7 Zytokine
Recombinant Human Interferon Gamma (IFN-γ)
ImmunoTools, Friesoythe
Recombinant Human Macrophage Col- ony Stimulating Factor (M-CSF)
ImmunoTools, Friesoythe
Recombinant Human Monocyte Chemo- tactic Protein-1 (MCP-1)
ImmunoTools, Friesoythe
Recombinant Human Transforming Growth Factor-beta 1 (TGF-β)
ImmunoTools, Friesoythe
Recombinant Human Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α)
ImmunoTools, Friesoythe
Recombinant Interleukin 6 (IL-6) ImmunoTools, Friesoythe
2.1.8 Antikörper
2.1.8.1 Primäre Antikörper
Alle verwendeten Antikörper erkennen humane Proteine.
