Aus Mausmoldellen ist bekannt, dass murine B-1a-Zellen nach Aktivierung und damit verbundener Relokalisierung in andere Organe, immunmodulatorisch auf andere Im-munzellen wirken können und als IRA-B-Zellen bezeichnet werden (Chousterman &
Swirski, 2015; Rauch et al., 2012; Weber et al., 2014). IRA-B-Zellen sind in der Lage GM-CSF, IgM und IL-3 zu sezernieren und nehmen Einfluss auf z.B. Monozyten, DCs und hämatopoetische Stammzellentwicklung. In dieser Arbeit wurde bereits gezeigt, dass CD5+ B-Zellen aus UCB und PB IgM sezernieren können. Nun sollte in Erfahrung gebracht werden, ob CD5+ B-Zellen aus UCB und PB in der Lage sind Zytokine zu sezernieren, die andere Zellen des Immunsystems beeinflussen. Aus der Literatur ist
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bekannt, dass unstimulierte B-Zellen keine Zytokinsezernierung aufweisen und zur Zy-tokinsezernierung aktiviert werden müssen (Pistoia, 1997). Diese Aussage muss kri-tisch betrachtet werden. Mit Hilfe der Zytokinprofilanalyse wurden sowohl für B-Zellen aus UCB als auch aus PB Intensitäten ohne Stimulierung gemessen (Daten nicht ge-zeigt). Außerdem konnte ein Zytokin ohne Stimulierung mit hoher Intensität für CD5+ B-Zellen sowohl aus UCB als auch aus PB aufgefunden werden (Tabelle 11). Insbe-sondere mit simulierter TI-II- (α-Ig) Stimulierung konnte die stärkste Zytokinsezernie-rung durch CD5+ B-Zellen aus UCB und PB verzeichnet werden. Eine wichtige Rolle für den CD5-Rezeptor der B-Zellen bei der Regulierung von TI-II-Immunantworten wurde in der Literatur bereits beschrieben (Néron & Lemieux, 1997; Sidorova et al., 2003). Auffällig war, dass viele der durch CD5+ B-Zellen aus UCB und PB sezernierten Zytokine bei simulierter TI-II-Aktivierung eine Rolle in der Regulation von Monozyten spielen. Die differentiell exprimierten Zytokine IL-6, MCP-1, IFN-γ und M-CSF wurden ausgewählt und deren Einfluss auf Monozytendifferenzierung in vitro untersucht.
IL-6 ist ein pleiotropes Zytokin, das auf eine Vielzahl von Zelltypen wirkt und an der Regulierung der Differenzierung, Proliferation und des Überlebens von Zielzellen be-teiligt ist (Horn et al., 2000). Bei Kontakt der Monozyten mit IL-6 wird die Expression von funktionellen M-CSF-Rezeptoren hochreguliert. Dies ermöglicht den Monozyten, autokrines M-CSF zu nutzen und die Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen einzuschalten (Chomarat et al., 2000). M-CSF ist ein homöostatischer Wachstumsfak-tor, der in hohen Konzentrationen im normalen Blut zirkuliert und die Monozytendiffe-renzierung sowohl in Richtung M1- als auch in Richtung M2-Makrophagen begünsti-gen kann (Solinas et al., 2009). Monozyten aus UCB differenzieren mit Hilfe von M-CSF zu DCs (Li & Broxmeyer, 2004).
IFN-γ-Stimulierung differenziert Monozyten zu M1-Makrophagen aus (Gordon, 2003;
Gordon & Taylor, 2005; Martinez et al., 2009; Solinas et al., 2009).
MCP-1, das auch als CCL2 (engl.: C-C motif chemokine ligand 2) bezeichnet wird, ist eines der wichtigsten Chemokine, das die Migration und Infiltration von Monozy-ten/Makrophagen reguliert (Deshmane et al., 2009). MCP-1-Expression ist durch das Einwirken von inflammatorischen Faktoren induzierbar und kann unter anderem auch
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durch IL-6, M-CSF und IFN-γ ausgelöst werden (Gschwandtner et al., 2019). MCP-1 kann je nach Umgebung und Situation sowohl die Differenzierung zu M1- als auch zu M2- Makrophagen begünstigen (Gschwandtner et al., 2019).
Zu Beginn der Analyse hatten die meisten Monozyten aus UCB einen unreifen CD80 -CD163- Phänotyp, während die meisten Monozyten aus PB einen M2-Phänotyp auf-wiesen. Bei der Untersuchung der Monozytendifferenzierung mit Hilfe von Zytokinen konnte sowohl bei Monozyten aus UCB als auch aus PB keine Differenzierung zu M2-Makrophagen und dem CD80-CD163- Phänotyp festgestellt werden. Unter Einfluss von IFN-γ zeigten Monozyten aus UCB und PB, wie in der Literatur beschrieben, eine 100%ige Differenzierung zu M1-Makrophagen. Dieser Effekt war auch mit einem Ge-misch aus allen vier Zytokinen (Mix 1) ersichtbar. Mit M-CSF- oder IL-6-Aktivierung konnte bei Monozyten aus UCB und PB vermehrt eine Differenzierung zum CD80+CD163+ Phänotyp beobachtet werden, wobei der Effekt bei Monozyten aus UCB stärker ausgeprägt war als bei Monozyten aus PB. Möglicherweise bildet der CD80+CD163+ Phänotyp in Monozyten aus UCB eine Vorstufe zu DCs (Li &
Broxmeyer, 2004). Neben IL-6, M-CSF und IFN-γ wurde auch der Einfluss des Che-mokines MCP-1 auf Monozyten in vitro untersucht. Dabei zeigten Monozyten aus UCB und PB eine Tendenz in Richtung M1-Makrophagen, die bei Monozyten aus PB stärker ausfiel. Eine Aktivierung mit M-CSF und IL-6 (Mix 2) zeigte den größten Differenzie-rungsunterschied zwischen Monozyten aus UCB und PB. Monozyten aus UCB präfe-rierten den CD80+CD163+ Phänotyp und Monozyten aus PB differenzierten zu M1-Makrophagen.
Eine Aktivierung der Monozyten konnte zusätzlich durch Antikörper aus der Zellsortie-rung stattgefunden haben. Zum Ausschluss verbliebener B- und T-Zellen nach anti-CD14-MACS erfolgte eine Eliminierung dieser Zellen mittels durchflusszytometrischer Analyse und anschließender Zellsortierung. Die Aktivierung müsste jedoch, wenn messbar, für Monozyten aus UCB vergleichbar mit den Monozyten aus PB sein. Zu-dem muss beachtet werden, dass Monozyten selbst auch Zytokine und Chemokine sezernieren können, die ihre Differenzierung mitbeeinflussen können. So können z.B.
M1-Makrophagen IL-6 sezernieren und eine Differenzierung zu M2-Makrophagen be-günstigen (Solinas et al., 2009).
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Neben einer Analyse der Monozytendifferenzierung mittels Zytokinzugabe erfolgte eine Analyse der Monozytendifferenzierung durch Co-Inkubation mit B-Zellen. Diese Analyse erfolgte unstimuliert und mit simulierter α-Ig-Stimulierung auf Grund der voran gegangenen Ergebnisse.
Als Ausgangssituation nach Zellsortierung und nach drei Tagen in vitro ohne Stimu-lanzien, wurden die gleichen Daten für Monozyten aus UCB und PB verwendet, wie bei der Inkubation mit Zytokinen. Hinzu kamen Monozyten, die drei Tage in vitro mit simulierter α-Ig-Stimulierung inkubiert wurden. Allein durch die simulierte Stimulierung der B-Zellen differenzierten Monozyten aus UCB und PB bevorzugt zu M1-Makropha-gen, wobei dieser Effekt bei UCB stärker ausfiel. Aus der Literatur ist bekannt, dass Immunglobuline alleine keine Monozytendifferenzierung auslösen können, jedoch be-fanden sich Monozyten zusammen mit der simulierten α-Ig-Stimulierung in Zellnähr-medium, welches 20% FCS enthielt, in dem Albumine, Vitamine und Wachstumsfak-toren waren, die eine Monozytendifferenzierung begünstigen (Kreutz et al., 1992).
Eine Zugabe von CD5- B-Zellen aus UCB oder PB zu Monozyten zeigte eine Differen-zierung zu M1-Makrophagen und dem CD80+CD163+ Phänotyp zu gleichen Anteilen.
Durch Zugabe von CD5+ B-Zellen aus UCB entwickelten sich Monozyten bevorzugt zu M1-Makrophagen, während bei Zugabe von CD5+ B-Zellen aus PB der Effekt ausblieb.
Co-Kulturen mit simulierter α-Ig-Stimulierung entwickelten unabhängig von den B-Zel-len aus UCB und PB eine Tendenz zu M1-Makrophagen. Dabei fiel dieser Effekt bei Monozyten aus UCB höher mit CD5- B-Zellen und bei Monozyten aus PB mit CD5+ B-Zellen aus.
Es muss bedacht werden, dass Monozyten adhärente Zellen sind und Funktionen durch Zelladhärenz moduliert werden können. So konnte zum Beispiel die Induktion von mRNA für M-CSF nach Adhärenz an Plastik beobachtet werden (Haskill et al., 1988). Monozytendifferenzierung kann auch durch gegenseitige Aktivierung über se-zernierte Zytokine beeinflusst werden (Solinas et al., 2009).
Zusammenfassend zeigen Inkubationen von Monozyten mit Zytokinen, aber auch Co-Kulturen aus Monozyten und B-Zellen, Unterschiede zwischen UCB und PB bei der
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Monozytendifferenzierung auf. Zudem scheinen Monozyten unabhängig von der simu-lierten Stimulierung oder den hinzugegebenen Zytokinen oder B-Zellen in eine Zwi-schenphase (CD80+CD163+) zu kommen, aus der sie möglicherweise weiter differen-zieren könnten, wenn sie länger in Co-Kultur bleiben würden. Eine Inkubation von drei Tagen scheint nicht auszureichen. Co-Kulturen von 7 oder 8 Tagen zeigen eine gute Monozytenausbeute (Kreutz et al., 1992; Lopez et al., 1993). Vielleicht würde nach einer längeren Inkubationszeit eine gezieltere M1- oder M2-Makrophagen-Differenzie-rung stattfinden.
Aus der Literatur gibt es Beispiele bei denen ein Zusammenwirken von CD5+ B-Zellen und Monozyten bei Erkrankungen auftritt. Zum Beispiel sind CD5+ B-Zellen und Mo-nozyten bei einer retikulären Dysgenesie im Vergleich zu anderen B-Zellen, T-Zellen und Granulozyten in ihrer Entwicklung nicht betroffen (La Calle-Martín et al., 1997).
Ein weiteres Beispiel ist der Anstieg von CD5+ B-Zellen und Monozyten während einer sekundären Phase des posttraumatischen Verlaufs bei IgA Nephropathie (Yuling et al., 2008). Es scheint, als ob CD5+ B-Zellen und Monozyten sich gegenseitig zum Überleben brauchen.
5 Fazit
In dieser Arbeit sollten humane reife CD5+ B-Zellen aus UCB molekular, phänotypisch und funktionell mit reifen CD5+ B-Zellen aus PB verglichen werden und parallele Ei-genschaften zu murinen B-1a-Zellen herausgestellt werden.
Reife CD5+ B-Zellen aus UCB und PB sind sich phänotypisch ähnlich, weisen jedoch funktionelle Unterschiede auf. CD5+ B-Zellen aus UCB lassen sich schneller aktivieren und zeigen zügiger eine Proliferation als reife CD5+ B-Zellen aus PB. Außerdem kön-nen reife CD5+ B-Zellen aus UCB T-Zell-unabhängig mehr IgM sezernieren als reife CD5+ B-Zellen aus PB. Diese Ergebnisse weisen Parallelen zu murinen B-1a-Zellen auf.
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Der bekannte Sezernierungsmechanismus von Plasmazellen mit Hilfe von XBP1-Spleißvarianten scheint an „spontaner“ IgM-Sezernierung nicht beteiligt zu sein, so-dass ein anderer, noch ungeklärter Mechanismus dafür zuständig sein muss.
Die Frage welches IgM bevorzugt durch reife CD5+ B-Zellen aus UCB sezerniert wird, konnte nicht endgültig geklärt werden, jedoch deuten einige Hinweise auf eine hexa-mere Form hin.
Mit Hilfe von humanisierten Mäusen konnte gezeigt werden, dass sich B-Zell-Entwick-lung von Vorläuferzellen aus UCB unter ähnlichem Mikromilieu qualitativ von Vorläu-fern aus PB unterscheidet. Zusätzlich konnte im Einklang mit muriner B-1-Zellentwick-lung, keine LIN28b-Expression von humanen Vorläuferzellen aus UCB aufgefunden werden, sodass eine separate B-Zell-Linien-Entwicklung vermutet werden kann.
Murine B-1a-Zellen haben eine immunmodulatorische Wirkung in Form von IRA-B-Zellen. Aus diesem Grund sollte eine mögliche immunmodulatorische Wirkung bei hu-manen reifen CD5+ B-Zellen aufgeklärt werden. Reife CD5+ B-Zellen aus UCB sezer-nierten mit simulierter TI-Stimulierung effektiver Zytokine als reife CD5+ B-Zellen aus PB. Reife CD5+ B-Zellen aus UCB, aber auch aus PB weisen eine immunmodulatori-sche Wirkung auf Monozyten auf. Somit konnte eine weitere parallele Eigenschaft zu murinen B-1a-Zellen aufgefunden werden.
Zusammengefasst weisen CD5+ B-Zellen aus UCB und PB viele Ähnlichkeiten auf, jedoch zeigen sie eindeutige funktionelle Unterschiede, die darauf hindeuten, dass hu-mane CD5+ B-Zellen aus UCB mehr Übereinstimmung mit murinen B-1a-Zellen auf-weisen, als CD5+ B-Zellen aus PB.
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6 Zusammenfassung
Die immunologische Funktion reifer CD5+ B-Zellen in gesunden Menschen wird immer noch stark diskutiert. Eine erhöhte Anzahl von CD5+ B-Zellen wurde in Autoimmuner-krankungen beschrieben. Darüber hinaus stellen CD5+ B-Zellen den zellulären Ur-sprung der chronisch lymphatischen Leukämie (CLL) dar, einer malignen Neoplasie von B-Zellen. Durch die Expression des CD5-Oberflächenmoleküls auf B-Zellen wird vermutet, dass CD5+ B-Zellen funktionelle Ähnlichkeiten zu murinen B-1a-Zellen auf-weisen können.
Murine B-1a-Zellen sind Antigen-unerfahrene, ontogenetisch frühe B-Zellen, die ohne T-Zell-Hilfe IgM sezernieren können. Dieses „natürliche“ IgM ist polyspezifisch und be-sitzt gleichzeitig verschiedene Antigenspezifitäten. Dadurch wird eine unspezifische, schnelle und vielseitige Immunreaktion gegen diverse Pathogene ermöglicht bevor das adaptive Immunsystem spezifische Antworten generieren kann. In dieser Arbeit wur-den ontogenetisch früh generierte reife CD5+ B-Zellen aus Nabelschnurblut (UCB) iso-liert und funktionell mit reifen CD5+ B-Zellen aus adultem peripherem Blut (PB) vergli-chen.
Einige genannte Eigenschaften für murine B-1a-Zellen konnten für humane reife CD5+ B-Zellen, insbesondere aus UCB, bestätigt werden. Reife CD5+ B-Zellen aus UCB wie-sen eine starke „spontane“ IgM-Sezernierung ohne T-Zell-Hilfe auf, wobei eine Korre-lation mit einer erhöhten IgM-Produktionsrate ermittelt werden konnte. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass reife CD5+ B-Zellen aus UCB unter unstimulierten Konditionen mehr Transkripte für sezernierfähiges als für membranständiges IgM ex-primierten als mit simulierter Aktivierung. Aus der Literatur ist bekannt, dass Plasma-zellen eine gespleißte Form des Transkriptionsfaktors XBP1 aufweisen müssen, um Immunglobuline sezernieren zu können. Zur Überprüfung des zugrunde liegenden Me-chanismus der „spontanen“ Sezernierung durch reife CD5+ B-Zellen aus UCB und PB wurde die Expression von gespleißtem und ungespleißtem XBP1 analysiert. Es konnte weder die gespleißte noch die ungespleißte XBP1-Form für eine „spontane“ IgM-Se-zernierung ohne T-Zell-Hilfe von reifen CD5+ B-Zellen aus UCB, festgestellt werden.
Dies deutet auf einen neuen noch unentdeckten XBP1-unabhängigen Mechanismus
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hin. Außerdem wurde versucht ein IgM-Molekül zu visualisieren und aufzuklären, ob das „natürliche“ IgM bevorzugt als Pentamer oder als Hexamer vorliegt. Diese Frage konnte auf Grund von Durchführungslimitierungen nicht geklärt werden, jedoch bieten die durchgeführten Versuche Hinweise darauf, dass im Serum aus UCB bevorzugt Hexamere aufzufinden sind.
Zuletzt wurde die immunmodulatorische Rolle von reifen CD5+ B-Zellen aus UCB und PB untersucht. Aus Mausmodellen ist die immunmodulatorische Wirkung von B-1a-Zellen in Form von IRA B-B-1a-Zellen bekannt. Aus diesem Grund sollte untersucht werden, ob es auch in diesem Punkt Parallelen von murinen B-1a-Zellen zu humanen reifen CD5+ B-Zellen gibt. Humane reife CD5+ B-Zellen weisen eine immunmodulatorische Wirkung auf Monozyten auf. Reife CD5+ B-Zellen aus UCB sezernierten auffällige Mengen M-CSF und andere Zytokine, wie IL-6, MCP-1 oder IFN-γ und unterstützten die Differenzierung von Monozyten hauptsächlich zu M1-Makrophagen.
Zusammenfassend wird durch die erzielten Ergebnisse, die Vermutung, dass humane reife CD5+ B-Zellen, vor allem aus UCB murinen B-1a-Zellen ähneln, unterstützt.
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Summary
The immunological function of CD5+ B cells in healthy humans has been debated. An increased level of CD5 expressing cells has been associated with autoimmune dis-eases. In addition, CD5+ B cells represent the cellular origin of chronic lymphocytic leukaemia (CLL), a malignant neoplasia of B cells. CD5 expression on mature B cells in mice is exclusive to B-1a B cells, a murine B cells population with distinct immuno-logical characteristics. Shared CD5 expression suggests potential similarities in immu-nological functions.
Murine B-1a cells are derived ontogenetically early, antigen-naïve and are capable of secreting IgM independent of B cell activation. Natural IgM is polyspecific for various antigens and contributes to a rather unspecific but fast and flexible immune response against a broad range of pathogens.
In this thesis, human ontogenetically early B cells were isolated from umbilical cord blood (UCB) and compared to mature B cells from peripheral blood of adults (PB).
Certain key characteristics of B-1a B cells could be confirmed for human CD5+ B cells, especially from UCB. In line with a correlation of the IgM section rates, mature CD5+ B cells of UCB produced and spontaneously (without T cell help) secreted IgM. In mature CD5+ B cells from UCB mainly transcript variants of IgM dedicated for secretion could be detected without stimulation which under stimulating conditions more membrane resident IgM was produced. According to literature, plasma cells are depended on the expression of a spliced XBP1-variant in order to secrete immunoglobulins. Neither the spliced nor the full length XBP1 transcript could be detected without T-dependent stim-ulation. Despite the lack of this signal B cells from UCB were able to secrete IgM. This finding suggests a XBP1-independet mechanism for spontaneous secretion.
Additionally, the IgM molecule was to be visualized to determine whether natural IgM is mainly present as pentameric or hexametric conformation. This question could not be resolved due to technical limitations, but the experimental results suggest a proba-bility to find preferentially hexameric IgM in sera of UCB.
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Finally, the immunomodulatory role of mature CD5+ B cells from UCB and PB was elucidated. So called IRA B cells, a population derived from murine B-1a B cells, has a known immunomodulatory effect in mice. Therefore, these functions should be ana-lysed for human mature CD5+ B cells. Here, we show that human mature CD5+ B cells indeed have a modulatory influence on monocyte differentiation. Mature CD5+ B cells from UCB secreted increased levels of M-CSF, IL-6, MCP-1 and IFN-γ and thereby supported differentiation of monocytes mainly into M1 macrophages.
Summing up this work, the findings support the hypothesis that human mature CD5+ B cells, especially from UCB resemble murine B-1a cells.
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