Fragmentlängenanalyse - Molekularbiologische Methoden

2.2 Methoden

2.2.2 Molekularbiologische Methoden

2.2.2.8 Fragmentlängenanalyse

Zur Fragmentlängenanalyse wurde das GenePrint 10 System (Promega) nach Her-stellerangaben verwendet. Zuerst wurde die Konzentration des PCR-Produkts mittels NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) bestimmt und auf 10 ng/µl mit bidest. Wasser verdünnt. Anschließend erfolgte eine Präamplifikation nach Herstellerangabe mit Ge-nePrint 10 Master Mix und Primer Mix. Zuletzt wurden die generierten Produkte, eben-falls nach Herstellerangaben, für den Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems) vor-bereitet, indem pro Ansatz und 1 µl Probe 9,5 µl Hi-Di-Formamid und 0,5 µl Internal Lane Standard 600 aus dem GenePrint 10 System (Promega), verwendet wurden. Die Analyse durch den Sequenzierer (Genetic Analyzer 3130, Applied Biosystems) wurde mit der GeneMapper Software, Version 3.7 durchgeführt.

42 2.2.3 Biochemische Methoden

2.2.3.1 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) / Western-Blotting

Für einen Proteinnachweis wurde eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelekt-rophorese (SDS-PAGE) durchgeführt. Dafür wurden Proteinkonzentrate mit 4x La-emmli-Puffer (Bio-Rad) und 1 mM DTT versetzt und für 15 min bei 90°C denaturiert.

Es wurden 4-15% Tris-Glycin-Acrylamid-Gele (Bio-Rad) zur Proteinauftrennung ver-wendet. Nach Beladen des Gels wurde als Laufpuffer der Tris/Glycin/SDS-Puffer (Bio-Rad) in die Gelelektrophoresekammer (Bio-(Bio-Rad) gefüllt und die Proteine bei 120 V für 60 Minuten der Größe nach aufgetrennt. Anschließend wurden Proteine aus dem Gel auf eine Nitrocellulose-Membran mittels iBlot Dry Blotting System (Invitrogen) transfe-riert und dabei die Einstellungen nach Herstellerangaben mit dem Programm 4 durch-geführt. Zum Vergleich wurden die Größenstandards PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher Scientific) und MagicMark XP Western Protein Standard (Thermo Fisher Scientific) verwendet. Zur Reduktion von unspezifischen Bindungen der Antikörper an die Nitrocellulose-Membran wurde die Membran nach einem Trans-fer für eine Stunde in BlockpufTrans-fer (5% BSA in 1x PBS/ 0,05% Tween-20) inkubiert.

Anschließend wurde die Nitrocellulose-Membran über Nacht bei 4°C mit primärem An-tikörper inkubiert. Die verwendeten AnAn-tikörper sind im Abschnitt 2.1.8.1 aufgeführt. Am nächsten Tag wurde die Membran dreimal für fünf Minuten mit Waschpuffer (1x PBS/

0,05% Tween-20) gewaschen und mit einem sekundären Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgte ein weiterer Waschschritt für fünf Mi-nuten mit Waschpuffer (1x PBS/ 0,05% Tween-20). Zum Schluss wurde zur Visuali-sierung der Proteine das Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) verwendet und Bildaufnahmen mit dem Gerät Fusion FX7 (Peqlab) erstellt.

43 2.2.3.2 Native Gelelektrophorese

Die native Gelelektrophorese erfolgte mittels dem NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System (Thermo Fisher Scientific) nach Herstellerangaben, unter Auslass des Katho-denpuffers. Dazu wurden die Novex NativePAGE 3-12% Bis-Tris Protein Gele (Thermo Fisher Scientific) und die XCell SureLock Mini-Cell (Thermo Fisher Scientific) Elektrophoresekammer verwendet. Der Proteintransfer erfolgte auf eine PVDF- (Po-lyvinylidenfluorid) Membran (Roth) mit Hilfe des RunBlue FAST Blotting Buffers (Ex-pedeon) und dem XCell II Blot-Modul (Thermo Fisher Scientific) oder dem Dual Cool Mini-Vertical Electrophoresis/Blotting Sytems (Expedeon) über 3 Tage bei 4°C.

2.2.3.3 Proteinisolierung mittels LigaTrap-Verfahren

Die IgM-Isolierung mittels LigaTrap Human IgM Purification Kit (ImmunoReagents) aus Blutseren oder Zellüberständen erfolgte nach Herstellerangaben. 400 µl Serum oder Zellüberstand wurden mit 100 µl LT Sample Dilutent 2.0 vermischt und bis nach der LigaTrap Säulen-Äquilibration inkubiert. LigaTrap Säulen wurden mit Hilfe des LT Equilibration/Wash Buffer 2.0 äquilibriert und die Probengemische darauf gegeben.

Nach 60-minütiger Inkubation wurden LigaTrap Säulen bei 2000 x g für eine Minute zentrifugiert und dreimal mit 400 µl LT Equilibration/Wash Buffer 2.0 gewaschen. An-schließend erfolgte eine zweimalige Elution mit 400 µl LT Elution Buffer. Erhaltene Lösungen wurden mit 80 µl LT Neutralization Buffer versetzt und LigaTrap Säulen für die nächste Anwendung mit 400 µl LT Regeneration Buffer regeneriert.

2.2.3.4 Ammoniumsulfatfällung

Zellüberstand oder Blutserum wurde in einem 1:1 Verhältnis mit einer zu 50% gesät-tigten Ammoniumsulfatlösung (100% Sättigung entspricht 4,32 mol/l) versetzt und durch mehrmaliges Invertieren vermischt. Anschließend erfolgte eine Inkubation von 30 min bei 4°C. Zur Sedimentierung des Präzipitats erfolgte eine Zentrifugation bei 300 x g für 30 Minuten. Das in 1x PBS resuspendierte Sediment wurde in einer nativen Gelelektrophorese eingesetzt.

44 2.2.3.5 ELISpot-Assay

Das ELISpot-Assay zur Detektion von humanem sezerniertem IgM wurde mit dem ELI-Spot Plus Kit für humanes IgM (MabTech) nach Herstellerangaben durchgeführt. Es wurde eine Positivkontrolle mit IgM⁺IgD⁺CD27⁺ B-Zellen (MBCs) und eine Negativkon-trolle ohne Zellen durchgeführt. Die Aufnahme der Spots erfolgte mit dem ELISpot Reader System (Autoimmun Diagnostika).

2.2.3.6 Analyse von intrazellulärem IgM

Intrazelluläre IgM-Level wurden bei CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB be-stimmt. Dazu wurden Zellen nach Zellsortierung mit je 0,66 µl/ml GolgiStop (BD Biosciences) und je 1 µl/ml GolgiPlug (BD Biosciences) für vier Stunden bei 37°C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Anschließend erfolgte eine Färbung der Zelloberflä-chenmoleküle mit CD5-APC, CD27-PECy7, CD38-PE und IgM-FITC für 15 Minuten bei 4°C im Dunkeln. Nach einem Waschvorgang mit Waschpuffer (PBS/0,5% BSA) und einer Zentrifugation bei 4°C und 400 x g wurden 500 µl Fixations/Permeabilisati-ons-Lösung (BD Biosciences) zu jedem Ansatz gegeben und 7 Minuten bei Raumtem-peratur inkubiert. Nach Inkubation wurden die Zellen mit 4 ml 1x Perm/Wash Puffer (BD Biosciences) gewaschen und nach Entfernen des Puffers intrazellulärer mit IgM-FITC für 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln gefärbt. Bevor die Messung am CytoFlex S (Beckman Coulter) erfolgte, wurden die Zellen erneut mit je 4 ml 1x Perm/Wash Puffer (BD Biosciences) gewaschen und für 5 Minuten bei 400 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Die Ansätze wurden ohne Stimulierung oder mit ver-schiedenen Stimulanzien, wie CpG, α-Ig oder TD (s. Punkt 2.2.1.4) behandelt und für die nächsten ein bis drei Tage bei 37°C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Des Wei-teren wurden Co-Kulturen mit T-Helferzellen (CD4⁺CD25^-), stimuliert durch anti-CD2/anti-CD3/anti-CD28-Beads durchgeführt, die ebenfalls für die nächsten ein bis drei Tage bei 37°C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert wurden.

Nach einem Tag wurde ein Anteil der Zellen durchflusszytometrisch analysiert und ein anderer Anteil, erneut wie zuvor beschrieben, mit GolgiStop (BD Biosciences) und Gol-giPlug (BD Biosciences) behandelt. Nach einer Inkubation von vier Stunden erfolgte

eine wiederholte durchflusszytometrische Analyse der Zellen. An Tag drei wurde die Durchführung wiederholt. Ermittelte Daten wurden auf unstimulierte Konditionen an Tag 0 normalisiert.

2.2.4 Statistische Auswertung

Die statistische Analyse der Daten wurde mit einem einseitigen oder zweiseitigen Wil-coxon-Vorzeichen-Rang-Test durchgeführt. Statistisch signifikante Unterschiede zwi-schen den untersuchten Proben sind durch *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 und

****p < 0,0001dargestellt.

2.2.5 Weitere Methoden

Die nachfolgend beschriebenen Methoden fanden in der vorliegenden Dissertation zwar Anwendung wurden jedoch nicht selbstständig, sondern mit Hilfe einer Koopera-tion durchgeführt.

2.2.5.1 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) fand in Kooperation mit dem Institut für experimentelle Immunologie und Bildgebung (Dr. Mike Hasenberg) am Universi-tätsklinikum Essen statt.

Zuerst wurden Formvar-Karbonfilm beschichtete TEM-Netze aus Kupfer (200 mesh, Plano GmbH) unter Glühen ladungsneutralisiert. Danach wurde B-Zellüberstand mit IgM-Molekülen in einem Volumen von 5 µl für zwei Minuten auf dem TEM-Netz inku-biert und dreimal mit bidest. Wasser gewaschen. Die überschüssige Flüssigkeit wurde mittels Filterpapiers vom TEM-Netz entfernt. Anschließend wurde eine 1,5%ige Wolf-ramatophosphorsäure (Roth) auf das TEM-Netz gegeben und nach einer Minute Inku-bation mit Filterpapier entfernt. Zuletzt folgten die Aufnahmen mit einem JEOL JEM 1400Plus Transmissionselektronenmikroskop und einer CMOS Kamera TemCam-F416 (TVIPS GmbH) bei einer Beschleunigungsspannung von 120 kV.

46 2.2.5.2 Rasterkraftmikroskopie (AFM)

Die Rasterkraftmikroskopie (engl.: atomic force microscopy, AFM) fand in Kooperation mit der Arbeitsgruppe für Bionanotechnologie (Prof. Dr. Barbara Saccà) an der Univer-sität Duisburg-Essen statt.

B-Zellüberstand mit IgM-Molekülen wurde auf eine Mica-Oberfläche (Plano GmbH) aufgetragen und bei Raumtemperatur für zwei Minuten inkubiert. Die Aufnahme er-folgte mit einem MultiModeTM 8 Mikroskop (Bruker) ausgestattet mit einem Nano-scope V Controller und einem ScanAsyst PeakForce TappingTM Modus. Erhaltene Aufnahmen wurden mit der NanoScope 6.14 Software (Bruker) analysiert.

3 Ergebnisse

3.1 Bestimmung von humanen reifen CD5

⁺

, CD5

und transitionellen B-Zellen in UCB und PB

Frühere Studien haben gezeigt, dass humane Neugeborene eine hohe Frequenz an CD5⁺CD10⁺CD24⁺CD38^high unreifen transitionellen B-Zellen aufweisen (Sims et al., 2005). Zur Untersuchung der Frage, ob neonatale B-Zell-Antworten durch eine geringe Anzahl verfügbarer reifer B-Zellen (CD5⁺/CD5^-CD10^-CD24^-CD38^low) begrenzt sind, wurden die Frequenzen reifer und transitioneller B-Zellen in einer Kohorte von 43 UCB-Proben untersucht und mit B-Zellen aus PB verglichen.

Zunächst wurden CD20⁺ Lymphozyten in CD27⁺ und CD27^- Fraktionen, zur Separie-rung von Gedächtnis-B-Zellen, aufgeteilt (Abbildung 6A und 6B). Es war zu beobach-ten, dass die Frequenz der Antigen-erfahrenen CD27⁺ B-Zellen aus UCB deutlich ge-ringer war als die aus PB (1:3). Daraufhin wurden CD27^- B-Zellen auf ihre IgM- und IgD-Ausprägung untersucht, da reife, Antigen-unerfahrene B-Zellen IgM^low und IgD^high als Resultat alternativen Spleißens ausprägen. B-Zellen aus UCB zeigten eine größere Fraktion an IgM-exprimierenden, reifen B-Zellen im Vergleich zu B-Zellen aus PB, während die IgD-Frequenz sowohl bei B-Zellen aus UCB als auch PB ähnlich war.

IgD⁺ B-Zellen wurden anschließend nach ihren CD38 und CD5 Oberflächenmolekülen aufgetrennt (Abbildung 6A und 6B). Die Ausprägung von CD38 ist charakteristisch für transitionelle B-Zellen (Sims et al., 2005).

Der Anteil an transitionellen B-Zellen (CD5⁺CD10⁺CD24⁺CD38^high) im UCB (22%) war tatsächlich höher als der Anteil in PB (6%), jedoch wiesen die meisten B-Zellen aus UCB (64%) einen reifen naiven Phänotyp (CD19⁺CD10^-CD24^-CD27^-CD38^lowIgM⁺IgD⁺) auf (Abbildung 6C). Daraus konnte geschlossen werden, dass ein Großteil der huma-nen B-Zellen aus UCB reif ist.

Zudem ließ sich in diesem Ansatz die Frage adressieren, ob es eine unterschiedliche, möglicherweise altersbedingte Verteilung von reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen in UCB und PB gibt. Dieser Vergleich zielte auf die Beurteilung der Ähnlichkeiten zu murinen

B-1a- und B-1b-Zellen ab. Es wurden reife CD5⁺ (CD5⁺CD23⁺CD27^-CD38^lowIgD⁺) und CD5^- (CD5^-CD23⁺CD27^-CD38^lowIgD⁺) B-zellen aus UCB sowie PB analysiert.

Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an reifen B-Zellen im UCB aus gleich gro-ßen Fraktionen von CD5⁺ und CD5^- B-Zellen bestand (Abbildung 6A), wobei die CD5⁺ B-Zell-Fraktion, wie bereits in einer früheren Arbeit (Przekopowitz, 2016) gezeigt wer-den konnte, mit dem Alter im PB abnimmt (Abbildung 6D).

Abbildung 6: Phänotypische Analyse humaner reifer CD5⁺, CD5^- und transitioneller B-Zellen.

Angereicherte B-Zellen aus UCB und PB wurden durchflusszytometrisch auf die Expression von typischen Ober-flächenmolekülen von reifen naiven B-Zellen untersucht. Gezeigt ist die Gatingstrategie für (A) B-Zellen aus UCB und aus (B) PB. Charakterisiert wurden transitionelle (CD5⁺CD10⁺CD24⁺CD38^high), reife CD5⁺ (CD20⁺CD27 -CD5⁺IgM⁺IgD⁺) und CD5^- B-Zellen (CD20⁺CD27^-CD5⁺IgM⁺IgD⁺). Zusätzlich wurde in (C) der prozentuale Anteil reifer und transitioneller B-Zellen aus UCB ermittelt (n = 43). Mit 63,74% sind durchschnittlich mehr reife B-Zellen als transitionelle B-Zellen mit 22,1% im UCB vorhanden. In D) wird die Abnahme reifer CD5⁺ B-Zellen mit dem Alter in PB gezeigt (n = 48).

3.2 Proliferationseigenschaften von reifen CD5

⁺

und CD5

B-Zellen aus UCB und PB

Da humane B-Zellen durch verschiedene Arten von Stimulierung einen aktivierten Phänotyp annehmen können, wurden Analysen zur Kinetik der B-Zellantwort in vitro durchgeführt und qualitative und quantitative Unterschiede zwischen B-Zellen aus UCB und PB beobachtet. Unabhängig der Ausprägung von CD5 proliferierten B-Zellen aus UCB früher als aus PB. Die erste Zellteilung war bereits an Tag 2 nach Simulierung einer TI-I- oder TD-Aktivierung nachweisbar, während B-Zellen aus PB frühestens an Tag 4 proliferierten (Abbildung 7A).

Das Simulieren einer TI- und TD-Aktivierung zeigte bei B-Zellen aus UCB an Tag 4 eine starke Induktion von Proliferation (Abbildung 7B). Im Gegensatz dazu war die Zellteilung von B-Zellen aus PB bei simulierter TI-Aktivierung verzögert und nur in ge-ringem Maß nachweisbar (Abbildung 7A und 7B). In Bezug auf die bekannten Unter-schiede in der Zusammensetzung des T-Zell-Kompartiments zwischen Neugeborenen und Erwachsenen (Kollmann et al., 2017; Levy, 2007) wurden Co-Kultur-Assays von reifen B-Zellen und autologen T-Helferzellen (CD4⁺CD25^-), letztere stimuliert mit anti-CD2-, anti-CD3- und anti-CD28-Beads (Treg Suppression Inspector, human, Miltenyi Biotec), durchgeführt. Die Co-Kultur-Assays bestätigten ein TD-induziertes Proliferati-onspotential sowohl von B-Zellen aus UCB als auch aus PB, wobei die Proliferation von B-Zellen aus PB deutlich stärker ausfiel als bei B-Zellen aus UCB (Abbildung 7B).

Diese Daten zeigen, dass B-Zellen aus UCB eine schnelle Reaktion auf TI- und TD- simulierte Aktivierung aufweisen, während B-Zellen aus PB beinahe ausschließlich auf TD-simulierte Aktivierung reagieren.

Abbildung 7: Proliferationseigenschaften von reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB.

In A) ist der Proliferationsverlauf von sortierten CD5⁺ (rot) und CD5^- (orange) B-Zellen aus UCB, sowie CD5⁺ (blau) und naiven (mint) B-Zellen aus PB nach zwei und vier Tagen unter TI-I- (CpG) oder TD-simulierter Aktivierung mit Hilfe des Proliferationsmarkers eFluor 670 exemplarisch dargestellt. In B) erfolgte eine Zusammenfassung der Ex-perimente unter verschiedenen Bedingungen mit TI-I- (CpG), TI-II- (α-Ig), TD-simulierter Aktivierung oder einer Co-Kultur mit T-Helferzellen (CD4⁺CD25^-). Es erfolgte eine Normalisierung der Daten auf Bedingungen ohne Stimulie-rung an Tag 0. Die gezeigten Datenpunkte sind repräsentativ für fünf voneinander unabhängig durchgeführte Ex-perimente. *p < 0,05, **p < 0,01 Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test.

3.3 Zelldifferenzierung und Klassenwechsel von reifen CD5

⁺

und CD5

B-Zellen aus UCB und PB

Neben den Proliferationseigenschaften sollte das Differenzierungs- und Klassenwech-selpotential von reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB untersucht werden.

Aus Mausmodellen ist bekannt, dass murine B-1a-Zellen neben IgM, selten IgG und IgA sezernieren (Fagarasan et al., 2000). Diese Eigenschaft sollte auch in humanen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen untersucht werden.

Durchflusszytometrische Analysen haben gezeigt, dass B-Zellen aus UCB innerhalb von vier Tagen, unabhängig von den Stimulationsbedingungen (TI-I (CpG) oder Co-Kultur mit T-Helferzellen), eine Differenzierung zu ASZ aufweisen. Im Vergleich dazu haben nur ein Drittel der B-Zellen aus PB eine Differenzierung zu Plasmablasten auf-gezeigt (Abbildung 8A und 8B). Experimente mit autologen T-Zell-Co-Kulturen als Sti-mulatoren stellten ein ähnliches Ergebnis dar (Abbildung 8B).

Weder eine in-vitro-Stimulierung noch eine T-Zell-Co-Kultur konnten einen Vorteil be-züglich des Überlebens der B-Zellen aus UCB gegenüber den B-Zellen aus PB indu-zieren, jedoch konnte eine erhöhte Apoptoseneigung nach vier Tagen in vitro aufge-funden werden (Daten nicht gezeigt (Budeus et al., 2020)).

Des Weiteren wurde auf Grund von möglichen Parallelen zu murinen B-1a-Zellen, das Klassenwechselpotential zu IgA bzw. IgG nach drei Tagen untersucht (Abbildung 8C und 8D). Es wurde ein verstärkter IgA-Klassenwechsel bei B-Zellen aus UCB, aber nicht bei B-Zellen aus PB, nach dreitägiger Inkubation mit simulierter α-Ig und TGF-β-Aktivierung im Vergleich zum IgG-Klassenwechsel, beobachtet (Abbildung 8D).

Abbildung 8: B-Zelldifferenzierung und Klassenwechsel.

In A) ist eine Darstellung der durchflusszytometrischen Analyse (FSC-A/SSC-A) der B-Zelldifferenzierung nach zwei Tagen in Kultur mit simulierter TI-I (CpG) und TD Stimulierung gezeigt. In B) wurde eine Analyse der Plas-mablastdifferenzierung von B-Zellen aus UCB (orange) und aus PB (blau) über vier Tage mit simulierter TI-I (CpG) Stimulierung oder mit Co-Kultur Bedingungen mit T-Helferzellen durchgeführt. Gezeigt ist eine Zusammenfassung von fünf UCB- und fünf PB-Proben. In C) ist eine durchflusszytometrische Analyse zu IgA- und IgG-Klassenwechsel mit B-Zellen aus UCB und PB nach drei Tagen mit TGF-β- und α-Ig-simulierter Stimulierung präsentiert. In D) ist eine Grafik repräsentativ für drei unabhängige Experimente zum IgA-Klassenwechsel von B-Zellen aus UCB (aus Gründen der Zellzahlen im UCB wurden, CD5⁺ und CD5^- nicht unterschieden), sowie von CD5⁺ und naiven B-Zellen aus PB gezeigt. Die Versuchsdurchführung erfolgte wie in C). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test.

3.4 IgM-Sezernierung

3.4.1 „Spontane“ IgM-Sezernierung und Bildung von intrazellulärem IgM bei reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB

Da in Mausmodellen eine „spontane“ IgM-Sezernierung von B-1a-Zellen nachgewie-sen werden konnte, wurde in dieser Arbeit untersucht, ob humane CD5⁺ B-Zellen dazu auch in der Lage sind.

Zur Untersuchung der „spontanen“ IgM-Sezernierung durch CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB wurde ein ELISpot-Assay (ELISpot Plus Kit für humanes IgM, Mab-Tech) durchgeführt (Abbildung 9A). Die Auswertung des Assays hat gezeigt, dass mehr CD5⁺und CD5^- B-Zellen aus UCB IgM sezerniert haben als B-Zellen aus PB.

Dieses Ergebnis traf sowohl auf unstimulierte als auch auf mit CpG-simulierter Stimu-lierung inkubierte B-Zellen zu. Außerdem wurde eine Positivkontrolle mit humanen Ge-dächtnis-B-Zellen (+) und eine Negativkontrolle ohne Zellen (-) durchgeführt (Abbil-dung 9A).

Zur Überprüfung einer möglichen Korrelation zwischen „spontaner“ Ig-Sezernierung und einer erhöhten IgM-Produktionsrate wurde eine durchflusszytometrische Bestim-mung des intrazellulären IgM-Levels mit GolgiPlug (BD Bioscience) und GolgiStop (BD Bioscience, Heidelberg) durchgeführt. Beide Substanzen blockieren den intrazellulä-ren trans-Proteintransport und fühintrazellulä-ren zur Akkumulation von Proteinen im Golgi-Apparat. Mit diesem Verfahren konnte ein erhöhtes intrazelluläres IgM-Level bei B-Zellen aus UCB im Vergleich zu B-B-Zellen aus PB sowohl nach einem als auch nach drei Tagen in Kultur, unabhängig von den simulierten Stimulationsbedingungen, nach-gewiesen werden (Abbildung 9B).

Damit stimmte eine effizientere Ig-Sezernierung durch B-Zellen aus UCB mit einer er-höhten IgM-Produktionsrate überein (Abbildung 9B).

Abbildung 9: IgM-Sezernierung und Bildung von intrazellulärem IgM bei reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB.

In A) ist ein IgM-ELISpot-Assay mit reifen sortierten CD5⁺ und CD5^- B-Zellen unstimuliert und nach TI-I (CpG) simulierter Aktivierung gezeigt (n = 3). Plus weist eine Positivkontrolle mit Gedächtnis-B-Zellen und Minus eine Negativkontrolle ohne B-Zellen auf. In B) ist die durchflusszytometrisch ermittelte intrazelluläre IgM-Produktionsrate nach vier Stunden mit GolgiStop und GolgiPlug (BD Bioscience) von reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB dargestellt (n = 21). Sortierte CD5⁺ (rot) und CD5^- (orange) B-Zellen aus UCB, sowie CD5⁺ (blau) und CD5 -(naive, mint) B-Zellen aus PB wurden nach einem und drei Tagen unter verschiedenen simulierten Stimulationsbe-dingungen mit TI-I- (CpG), TI-II- (α-Ig), TD-Aktivierung und einer Co-Kultur mit T-Helferzellen (CD4⁺CD25^-) auf ihre intrazellulären IgM-Level untersucht. Es erfolgte eine Normalisierung der Daten auf Bedingungen ohne Stimulierung an Tag 0. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test.

3.4.2 Mechanismen der IgM-Sezernierung bei reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zel-len aus UCB und PB

Es sollte überprüft werden, ob IgM „spontan“ sezerniert werden kann und nicht not-wendigerweise durch vorherige Aktivierung mit körperfremden Stoffen hervorgerufen werden muss.

Es erfolgte eine Quantifizierung von Transkripten für membranständiges und für die Sezernierung vorgesehenes (sezerniertes) IgM aus reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB mittels semi-quantitativer PCR. Aliquots von jeweils 3x10⁵B-Zellen wurden unstimuliert und nach Simulierung einer Aktivierung mit TI-I (CpG), TI-II (α-Ig) oder TD in vitro eingesetzt. Als Positivkontrolle für eine effiziente IgM-Sezernierung wurden IgM-Gedächtnis-B-Zellen (MBCs) aus PB verwendet. Repräsentativ für alle Versuche ist eine Abbildung einer Agarosegelelektrophorese für B-Zellen aus UCB und PB mit CpG- und TD-simulierter Stimulierung in Abbildung 10A gezeigt. Bei Be-trachtung der Agarosegelelektrophorese-Abbildung wird ersichtlich, dass sowohl B-Zellen aus UCB als auch aus PB nach dreitägiger Simulierung einer CpG- oder TD-Aktivierung, Transkripte für membranständiges und sezerniertes IgM produziert haben (Abbildung 10A).

Von den erhaltenen Agarosegelelektrophorese-Banden für die Spleißvarianten von IgM-Transkripten für membranständiges (382 bp) und sezerniertes (156 bp) IgM sowie Aktin (131 bp) wurde eine Analyse der relativen Intensitäten mit Hilfe der ImageJ-Soft-ware durchgeführt.

Das logarithmierte Verhältnis der Analyse ist in Abbildung 10B dargestellt. Im unstimu-lierten Zustand zeigten sowohl CD5⁺ als auch CD5^- B-Zellen aus UCB einen signifikant höheren Anteil an Transkripten für sezernierfähiges IgM im Vergleich zum Transkrip-tanteil von naiven B-Zellen aus PB. Eine vergleichbare Tendenz wurde auch mit simu-lierter CpG-Stimulierung aufgezeigt. Des Weiteren wiesen CD5^- B-Zellen aus UCB un-ter α-Ig-simulierter Stimulierung mehr Transkripte für membrangebundenes IgM auf als unter anderen simulierten Stimulationsbedingungen. Durch simulierte TD-Aktivie-rung produzierten CD5^- B-Zellen aus UCB einen höheren Anteil an Transkripten für sezernierfähiges IgM im Vergleich zu CD5⁺ B-Zellen aus UCB und zu B-Zellen aus PB.

Zusammenfassend wurden ohne Stimulierung von B-Zellen aus UCB die meisten und von B-Zellen aus PB die wenigsten Transkripte für sezerniertes IgM produziert. Die TI-I-simulierte Stimulierung mittels des TLR-Agonisten CpG zeigte ein ähnliches Ergebnis zu unstimulierten B-Zellen auf. Mit TI-II- (α-Ig) und TD-simulierten Stimulierungen wur-den keine nennenswerten Unterschiede in der Transkriptmenge produziert. Lediglich die Transkriptmenge für sezerniertes IgM von CD5^- B-Zellen aus UCB war bei TD-simulierter Stimulierung höher als unter TI-II- (α-Ig) TD-simulierter Stimulierung.

Dieses Ergebnis zeigt, dass B-Zellen aus UCB ohne Stimulierung mehr Transkripte für sezerniertes IgM produzieren als andere unstimulierte oder mit simulierter Stimulie-rung aktivierte B-Zellen.

Abbildung 10: Quantifizierung von Transkripten für membranständiges und sezerniertes IgM von reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB.

Quantifizierung von Transkripten für membranständiges (382 bp) und sezerniertes (156 bp) IgM aus unstimulierten und drei Tage stimulierten reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB, sowie MBCs aus PB mit TI-I- (CpG), TI-II- (α-Ig) oder TD-simulierter Aktivierung. In A) ist exemplarisch eine Abbildung einer Agarosegelelektrophorese mit Spleißvarianten von IgM-Transkripten für membranständiges und sezerniertes IgM, sowie Aktin als Referenz

Im Dokument Funktionelle Analyse humaner reifer CD5 + B-Zellen aus Nabelschnurblut und adultem peripherem Blut (Seite 57-0)