Expression der Transkriptionsfaktoren XBP1, IRF4 und PRDM1 sowie

Nachdem gezeigt werden konnte, dass reife CD5⁺ B-Zellen aus UCB, aber auch aus PB, Plasmablast-Differenzierungseigenschaften aufweisen und IgM sezernieren kön-nen, wurde zur weiteren Untersuchung eines möglichen Sezernierungsmechanismus Analysen auf mRNA-Ebene mittels qPCR durchgeführt. Dabei wurde die jeweilige Zel-lart auf das Referenzgen GAPDH normalisiert. Für jeden untersuchten Ansatz wurde der Ct- (engl.: cycle threshold) Wert des Referenzgens GAPDH vom Ct-Wert des zu untersuchenden Gens subtrahiert und ein ΔCt-Wert ermittelt. Je niedriger ein ΔCt-Wert war, desto mehr Transkripte konnten entsprechend der Expression nachgewiesen werden.

Der Transkriptionsfaktor IRF4 wird zur B-Zelldifferenzierung benötigt und begünstigt die Produktion von ASZ sowie Ig-Sezernierung. Bei der Taqman-Analyse der IRF4-Expression (Abbildung 11A) zeigten B-Zellen aus UCB und PB unstimuliert oder mit simulierter TI-I- (CpG) oder TI-II- (α-Ig) Stimulierung eine vergleichbare Expression mit einem ΔCt-Wert um 2. B-Zellen mit simulierter TD-Stimulierung produzierten doppelt so viele IRF4-Transkripte wie unter anderen Stimulationsbedingungen. Dabei konnte das höchste Transkript-Level (ΔCt-Wert 0) von CD5⁺ B-Zellen aus UCB mit simulierter TD-Aktivierung ermittelt werden. Im Vergleich dazu zeigten CD5^- B-Zellen aus UCB unter simulierter TD-Stimulierung das niedrigste Expressions-Level (ΔCt-Wert 1,5). Mit

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simulierter TI-I (CpG)-Aktivierung bildeten B-Zellen aus UCB mehr Transkripte (ΔCt-Wert 1,7) als B-Zellen aus PB (ΔCt-(ΔCt-Wert 2,1), wobei CD5⁺ B-Zellen die geringste Ex-pression (ΔCt-Wert 2,5) aufzeigten (Abbildung 11A). Daraus kann geschlossen wer-den, dass lediglich mit simulierter TD-Stimulierung, vergleichsweise viele Tran-skripte gebildet wurden und die gezeigte „spontane“ IgM-Sezernierung mit wenig IRF4-Transkripten auskommen muss.

Zusätzlich zur Expression von IRF4-Transkripten wurde die Transkript-Expression von PRDM1 bzw. dessen Transkript BLIMP-1 (Abbildung 11B) ermittelt. Der Transkripti-onsfaktor PRDM1 wird in ASZ exprimiert und ist genauso wie IRF4 für die Ig-Sezer-nierung von Bedeutung. Ohne Stimulierung zeigten B-Zellen aus UCB eine etwas grö-ßere Transkript-Expression als B-Zellen aus PB (Differenz ΔCt-Wert von 1). Dabei ex-primierten CD5^- B-Zellen das höchste mRNA-Level von PRDM1 (ΔCt-Wert 7,5), das mit dem Transkript-Level von CD5^- B-Zellen mit simulierter TD-Stimulierung vergleich-bar war. Mit TI-I- (CpG) simulierter Stimulierung wiesen B-Zellen aus UCB eine höhere Transkript-Menge an PRDM1 auf als B-Zellen aus PB. Erwähnenswert war der Unter-schied der PRDM1-Expression zwischen CD5⁺ B-Zellen aus PB im Vergleich zu CD5⁺ B-Zellen aus UCB mit einer Differenz des ΔCt-Werts von 3. Dabei war das Expressi-ons-Level von CD5⁺ B-Zellen aus UCB mit simulierten CpG-Bedingungen vergleichbar mit dem von CD5⁺ B-Zellen aus UCB mit simulierter TD-Stimulierung. Mit simulierter TI-II- (α-Ig) Aktivierung produzierten CD5⁺ B-Zellen aus UCB das niedrigste Transkript-Level unter allen Stimulationsbedingungen (ΔCt-Wert 9,5). Mit TD-simulierter Stimu-lierung zeigten B-Zellen die höchste Transkript-Expression (Abbildung 11B).

Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass CD5⁺ B-Zellen aus UCB

„spontan“ IgM sezernieren können ohne große Mengen PRDM1-Transkripte auf mRNA-Ebene zu produzieren. Des Weiteren trifft diese Aussage auch auf CD5⁺ B-Zellen mit simulierter α-Ig-Stimulierung zu. Lediglich mit simulierter CpG- oder TD-Sti-mulierung exprimierten CD5⁺ B-Zellen aus UCB mehr PRDM1-Transkripte als unter anderen Bedingungen.

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Abbildung 11: Genexpressionsanalyse der Transkriptionsfaktoren IRF4 und PRDM1 mittels qPCR.

Quantitative Analyse der IRF4- und PRDM1-Expression aus reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB un-stimuliert (us) und nach dreitägiger simulierter Stimulierung mit TI-I- (CpG), TI-II- (α-Ig) und TD-Stimulanzien. Dar-gestellt sind ΔCt-Werte für die Expression des Faktors IRF4 (A) oder PRDM1 (B) für die jeweilige Zellart in Abhän-gigkeit des Referenzgens GAPDH. Die Analyse ist repräsentativ für fünf unabhängige Spender pro Bedingung. Zur statistischen Analyse wurde der Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test verwendet, *p < 0.05. Im Falle von Werten nahe des Signifikanzniveaus wurden Zahlen angegeben.

A

B

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Nach Bestimmung der IRF4- und PRDM1-Transkript-Expression, wurde das mRNA-Level von XBP1 (Abbildung 12A) analysiert. Der Transkriptionsfaktor XBP1 ist in ASZ stark induziert und ebenfalls für Ig-Sezernierung wichtig. Ohne Stimulierung und mit simulierter TI-I- (CpG) oder TI-II- (α-Ig) Aktivierung zeigten B-Zellen aus UCB und PB ein homogenes Expressions-Level von XBP1. Tendenziell zeigten CD5⁺ B-Zellen aus UCB im Vergleich zu CD5^- B-Zellen aus UCB, aber auch zu B-Zellen aus PB, eine etwas höhere Transkriptrate unstimuliert und mit simulierter CpG-Aktivierung (Diffe-renz ΔCt-Wert von 1). Mit TD-simulierter Stimulierung konnten höhere mRNA-Level im Vergleich zu anderen Stimulationsbedingungen verzeichnet werden (Differenz ΔCt-Wert von 2). Dabei zeigten CD5⁺ B-Zellen aus UCB die höchste XBP1-Expression auf (ΔCt-Wert 1, Abbildung 12A). Nach Feststellung einer „spontanen“ IgM-Sezernierung durch CD5⁺ B-Zellen aus UCB konnte mittels Taqman-qPCR ermittelt werden, dass auf mRNA-Level nur eine niedrige Expression des Transkriptionsfaktors XBP1 benö-tigt wird. Ausschließlich mit TD-simulierter Aktivierung produzierten CD5⁺ B-Zellen aus UCB XBP1-Transkripte.

Außer einer Transkriptbestimmung der bisher genannten Transkriptionsfaktoren, wurde ein mRNA-Level der J-Kette (IgJ, Abbildung 12B), die zur IgM-, aber auch zur IgA-Bildung beiträgt, analysiert. Zusätzlich wurden sich durch eine IgJ-Transkriptrate Hinweise erhofft, die Aufschluss zur Bildung von pentamerem oder hexamerem IgM geben könnten. Ohne Stimulierung konnte bei CD5⁺ B-Zellen aus UCB eine vergleich-bare Transkriptrate von IgJ zu B-Zellen aus PB ermittelt werden. Allein CD5^- B-Zellen aus UCB zeigten eine etwas geringere Transkriptionsrate (Differenz ΔCt-Wert von 1,2). Mit TI-I- (CpG) simulierter Aktivierung wurden von B-Zellen aus UCB im Ver-gleich zu B-Zellen aus PB mehr Transkripte produziert (Differenz ΔCt-Wert von 2-3).

Dabei konnte ein höheres mRNA-Level von CD5⁺ B-Zellen sowohl aus UCB als auch aus PB im Vergleich zu CD5^- B-Zellen ermittelt werden. Mit simulierter TI-II- (α-Ig) Sti-mulierung wurden keine Unterschiede in der Expression von IgJ festgestellt. Erwäh-nenswert ist, dass mit TD-simulierter Stimulierung B-Zellen aus UCB und PB einen niedrigeren mRNA-Level für IgJ aufzeigten als unter anderen Stimulationsbedingun-gen. Dabei exprimierten B-Zellen aus UCB mehr IgJ-Transkripte als B-Zellen aus PB (Abbildung 12B). Dieses Ergebnis suggeriert, dass B-Zellen aus UCB möglicherweise

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bevorzugt pentameres IgM als „spontanes“ IgM, aber auch mit simulierter CpG und α-Ig-Aktivierung, sezernieren. Lediglich mit simulierter TD-Stimulierung gibt es einen möglichen Hinweis auf hexameres IgM durch eine niedrigere IgJ-Transkriptrate im Ver-gleich zu anderen Stimulationsbedingungen.

Abbildung 12: Genexpressionsanalyse des Transkriptionsfaktors XBP1 und der J-Kette (IgJ) mittels qPCR.

Analyse der XBP1- und IgJ-Expression auf mRNA-Level aus reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB unstimuliert (us) und nach dreitägiger simulierter Stimulierung mit TI-I- (CpG), TI-II- (α-Ig) und TD-Stimulanzien mittels Taqman-qPCR. Gezeigt werden ΔCt-Werte für die Expression des Faktors XBP1 (A) und der J-Kette (B) für die jeweilige Zellart in Abhängigkeit des Referenzgens GAPDH. Die Analyse ist repräsentativ für fünf unabhängige Spender pro Bedingung. Zur statistischen Analyse wurde der Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test verwendet,

*p < 0.05, **p<0,01. Im Falle von Werten nahe des Signifikanzniveaus wurden Zahlen angegeben.

A

B

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IRF4, PRDM1, XBP1 und die J-Kette sind wichtige Faktoren für ASZ und Ig-Sezernie-rung. Zusammenfassend konnte durch eine Analyse mittels qPCR ermittelt werden, dass reife CD5⁺ B-Zellen aus UCB zur „spontanen“ IgM-Sezernierung, sowohl wenige IRF4- als auch wenige PRDM1- oder XPB1-Transkripte im Vergleich zur Expression mit simulierter TD-Stimulierung aufzeigen und keine signifikanten Unterschiede zu B-Zellen aus PB aufweisen. Die IgJ-Transkriptrate sollte Hinweise zur pentameren oder hexameren IgM-Produktion geben. Es konnte ermittelt werden, dass für „spontan“ se-zerniertes IgM mehr IgJ-Transkripte exprimiert wurden als mit TD-simulierter Stimulie-rung. Außerdem konnte kein signifikanter Unterschied zu B-Zellen aus PB festgestellt werden. Somit konnte für eine „spontane“ Sezernierung, eine Tendenz zu pentamerem IgM und einem IRF4-, PRDM1- und XBP1-unabhängigem Mechanismus gezeigt wer-den.

3.4.3.2 Spleißvariantenanalyse des Transkriptionsfaktors XBP1

Der zuvor erwähnte Transkriptionsfaktor XBP1 kann in einer gespleißten (283 bp) oder ungespleißten (309 bp) Form vorliegen. Zur Ig-Sezernierung wird die gespleißte Form benötigt. In Abbildung 13A ist ein Agarosegel gezeigt, auf dem die Expression der Transkripte für die gespleißte oder ungespleißte Form von XBP1 von CD5⁺ und CD5 -B-Zellen aus UCB (orange) und PB (blau) unstimuliert und unter verschiedenen simu-lierten Stimulationsbedingungen dargestellt ist. Eine Zusammenfassung der Ergeb-nisse zur Analyse von XBP1 mittels Gelelektrophorese und den verschiedenen simu-lierten Stimulationsbedingungen ist in Tabelle 6 gezeigt. Als Positivkontrolle für eine erfolgreiche in vitro Aktivierung wurden leicht erregbare IgM-Gedächtnis-B-Zellen (MBCs) und als Expressionskontrolle für die gespleißte oder ungespleißte Form, Zel-len der Linie KARPAS 299 mit Thapsigargin (+) verwendet (Carnesecchi et al., 2015).

Das Agarosegel ist repräsentativ für jeweils fünf UCB- und fünf PB-Spender. Es ist zu beobachten, dass unter unstimulierten Bedingungen sowohl bei CD5^- als auch bei CD5⁺ B-Zellen aus UCB keine Expression von XBP1 messbar war. B-Zellen aus PB zeigten unter unstimulierten Bedingungen nur die ungespleißte Form von XBP1 auf.

Bei simulierter Stimulierung mit TI-I (CpG) konnte eine Bande für die ungespleißte Form von XBP1 bei CD5^- B-Zellen aus UCB nachgewiesen werden. Außerdem traten

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beide Spleißvarianten bei MBCs auf. Mit TI-II- (α-Ig) simulierter Stimulierung zeigten CD5^- B-Zellen aus UCB sowohl eine gespleißte als auch eine ungespleißte XBP1-Form auf. CD5⁺ B-Zellen aus UCB zeigten keine Expression für XBP1 und B-Zellen aus PB wiesen eine ungespleißte Form von XBP1 auf. Unter TD-simulierter Stimulie-rung zeigten B-Zellen aus UCB und PB Expressionen für beide Spleißvarianten von XBP1 auf. Zur Überprüfung der Ergebnisse wurde eine Fragmentlängenanalyse von der gespleißten oder ungespleißten XBP1 Form von B-Zellen aus UCB und PB unsti-muliert und mit siunsti-mulierter TI-I- (CpG), TI-II- (α-Ig) oder TD-Stimulierung durchgeführt.

In Abbildung 13B sind für die Fragmentlängenanalyse exemplarisch Peaks für die Po-sitivkontrolle (KARPAS 299 mit Thapsigargin) und CD5⁺ B-Zellen aus UCB und PB ohne Stimulierung dargestellt. Die jeweils höchsten Intensitäten (Peaks) sind rot ein-gekreist. Der Peak für die Fragmentlänge der ungespleißten Form von XBP1 bei CD5⁺ B-Zellen aus UCB lag bei 1300 rfu (engl.: relative fluorescent units) und damit so nied-rig, dass eine entsprechende Bande auf einem Agarosegel mit dem Auge nicht er-kennbar war (Abbildung 13A).

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die gespleißte XBP1-Form, die von ausdifferenzierten B-Zellen zur Ig-Sezernierung benötig wird, bei einer „sponta-nen“ IgM-Sezernierung von CD5⁺ B-Zellen aus UCB, aber auch aus PB nicht nachge-wiesen werden konnte (Tabelle 10). Mit simulierter CpG-Stimulierung konnte ebenfalls keine gespleißte XBP1-Form von B-Zellen aus UCB und PB aufgefunden werden (Ta-belle 10).

Zuvor konnte gezeigt werden, dass B-Zellen aus UCB ein erhöhtes intrazelluläres IgM-Level aufweisen und sowohl ohne Stimulierung als auch mit simulierter CpG-Stimulie-rung IgM sezernieren. Fraglich war, ob dabei eine gespleißte XBP1-Form benötigt wird. Das Ausbleiben einer gespleißten XBP1-Variante zeigt, dass die nachgewiesene IgM-Sezernierung mittels ELISpot-Analyse auf einem neuen, XBP1-unabhängigen Mechanismus basiert.

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Abbildung 13: Gelelektrophorese und Fragmentlängenanalyse des Transkriptionsfaktors XBP1.

Analyse von XBP1-Transkripten in gespleißter (283 bp) und ungespleißter (309 bp) Form. Als Positivkontrolle (+) für eine gespleißte Variante von XBP1 wurden mit Thapsigargin behandelte KARPAS 299 Zellen verwendet. Als Positivkontrolle für die in vitro Aktivierung wurden MBCs verwendet. Die Analyse erfolgte mit reifen CD5⁺ und CD5 -(N) B-Zellen aus UCB und PB unstimuliert und nach dreitägiger simulierter Stimulierung mit TI-I (CpG), TI-II (α-Ig) und TD. In A) ist repräsentativ eine Agarose-Gelelektrophorese dargestellt, die für fünf unabhängige Spender wie-derholt wurde. In B) ist eine Fragmentlängenanalyse zur gespleißten und ungespleißten Form von XBP1 von B-Zellen aus UCB und PB mittels GenePrint 10 System gezeigt. Analysen der Positivkontrolle sowie der CD5⁺ unsti-mulierten B-Zellen aus UCB und PB sind beispielhaft dargestellt (n = 3). Gemessene Peakintensitäten wurden in relativen Fluoreszenzeinheiten (engl.: relative fluorescent units, rfu) ermittelt. Maximal gemessene Intensitäten sind rot markiert. Die jeweilige Spleißvariante wurde entsprechend ihrer Fragmentgröße in Basenpaaren (bp) zugeord-net. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der GeneMapper Software.

A

B

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Tabelle 10: Vorhandensein der XBP1 gespleißten oder ungespleißten Form in reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB.

Zusammenfassung der Ergebnisse zur Analyse von XBP1 aufgeteilt nach Zellart, Stimulierung und gespleißter oder ungespleißter Form aus UCB (orange) und aus PB (blau). Neben reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen wurden aus PB auch MBCs analysiert. + Form vorhanden, - Form nicht vorhanden.