IgM-Detektierung

Nachdem für B-Zellen aus UCB (vor allem in CD5⁺ B-Zellen) Hinweise auf eine „spon-tane“ IgM-Sezernierung mittels ELISpot gesammelt wurden und auch in unstimulierten Proben mehr Transkripte für sezerniertes als membranständiges IgM gemessen wurde, jedoch aber eine Expression von IgJ in reifen CD5⁺ und CD5^- B-Zellen aus UCB und PB nachgewiesen werden konnte, sollte untersucht werden ob „spontan“

sezerniertes IgM aus UCB bevorzugt als Hexamer (1100 kDa) oder Pentamer (950 kDa) auftritt. Diese Frage sollte mit Hilfe (nativer) Gelelektrophorese und TEM sowie AFM untersucht werden.

3.4.4.1 Strukturanalyse von IgM mittels (nativer) Acrylamidgelelektrophorese Zur Untersuchung der IgM-Struktur wurde eine Acrylamidgelelektrophorese mit Blut-serum aus UCB und PB und eine anschließende Coomassie-Färbung durchgeführt

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(Abbildung 14A). Der Proteinstandard (NativeMark Unstained Protein Standard, Thermo Fisher Scientific, M) enthielt rekombinantes IgM aus Rindern, welches etwas größer ist als humanes IgM und im nativen Gel im Bereich von 1048 kDa (pentameres IgM) und 1236 kDa (hexameres IgM) läuft. Sowohl das Serum aus UCB als auch aus PB zeigte eine Bande in diesem Größenbereich (Abbildung 14A). Die IgM-Bande aus PB-Serum lief tendenziell etwas weniger tief in das Gel ein und zeigte im Vergleich zur Bande aus UCB-Serum eine nicht so breit aufgefächerte Form.

Als nächstes sollte mittels nativer Gelelektrophorese und anschließendem Western Blot (WB), bei dem die native Struktur weitgehend erhalten bleibt, IgM nachgewiesen werden (Abbildung 14B). Das Serum aus UCB zeigte dabei keine sichtbare Bande, während das Serum aus PB eine distinkte Bande etwas unter der 1048 kDa Standard-größe aufzeigte. Etwas darüber zeichnete sich eine sehr schwache zweite Bande ab, die in etwa bei 1236 kDa lief.

Für weitere Anwendungen sollte IgM aus UCB- und PB-Serum isoliert und aufkon-zentriert werden. Dafür wurden LigaTrap-Säulen (ImmunoReagents) verwendet. Nach Durchführung einer nativen Gelelektrophorese mit anschließendem WB mit aufkon-zentriertem IgM aus Blutserum von UCB und PB, wurde eine Bande im Bereich des pentameren IgM für PB, jedoch keine weitere Bande im Bereich von hexamerem IgM und nach wie vor kein Produkt für aufkonzentriertes IgM aus UCB detektiert (Abbil-dung 14C).

Anschließend sollte zur besseren Vergleichbarkeit sichergestellt werden, dass gleiche Proteinmengen bzw. gleiche Konzentrationen für IgM in die native Gelelektrophorese eingesetzt wurden. Dazu wurde eine denaturierende Gelelektrophorese mit anschlie-ßendem WB durchgeführt und die µ-Kette von IgM detektiert. Diese hat eine Masse von 75 kDa und konnte sowohl im Serum des UCB als auch im Serum des PB in gleicher Menge nachgewiesen werden (Abbildung 14D). Parallel dazu wurde ebenfalls mit einer denaturierenden Elektrophorese und WB die J-Kette mit einer Masse von 15 kDa ermittelt. Diese konnte nur im Serum des PB, aber nicht des UCB aufgefunden werden (Abbildung 14E), obwohl µ-Ketten nachgewiesen wurden (Abbildung 14D). Bei

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denaturierenden Gelelektrophoresen und WB wurde der MagicMarc Western Blot Pro-tein Standard (Thermo Fisher Scientific) als Referenz verwendet.

Schließlich wurde eine Ammoniumsulfatfällung mit Serum aus UCB und aus PB mit anschließender Silbernitratfärbung des nativen Bis-Tris-Gels durchgeführt. Für PB-Se-rum war eine gut definierte Bande unterhalb der 1048 kDa Markierung sichtbar, jedoch kaum für UCB-Serum detektierbar. Im Größenbereich von hexamerem IgM war dage-gen beim PB-Serum ein undefinierter dunkel-gefärbter Bereich sichtbar, während beim UCB-Serum, die Produkte eher auf ein größeres oder komplexer gefaltetes IgM hin-deuteten (Abbildung 14F).

IgM konnte mit denaturierter Gelelektrophorese und anschließendem WB nachgewie-sen und quantifiziert werden, jedoch ist bei gleicher Proteinkonzentration ein Nachweis von IgM aus UCB mittels nativer Gelelektrophorese nicht möglich. Weiterhin ist eine definierte Unterteilung in pentameres versus hexameres IgM mit dieser Methode nicht durchführbar.

Abbildung 14: Detektierung von IgM-Proteinen.

Serum wurde aus UCB und PB isoliert und IgM mittels Acrylamidgelelektrophorese und WB detektiert. Bei nativer Gelelektrophorese wurde der NativeMark Proteinstandard (Thermo Fisher Scientific, M) mit bovinem IgM mit einer Masse von 1048 kDa für pentameres und 1236 kDa für hexameres IgM verwendet. Bei denaturierender Gelelekt-rophorese wurde der MagicMark Western Blot Proteinstandard (Thermo Fisher Scientific, M) eingesetzt. In A) ist ein natives Bis-Tris-Gel nach Elektrophorese und anschließender Coomassie-Färbung dargestellt (n = 8). In B) ist eine native Gelelektrophorese mit anschließendem WB gezeigt (n =4). In C) ist eine native Gelelektrophorese mit anschließendem WB nach Isolierung und Aufkonzentrierung von IgM durch LigaTrap-Säulen dargestellt (n = 4). In D) ist eine denaturierende Gelelektrophorese mit WB zur Ermittlung gleicher IgM-Konzentrationen bzw. -Mengen dargestellt (n = 3). In E) ist eine denaturierende Gelelektrophorese mit WB zur Bestimmung der J-Kette gezeigt (n = 3). In F) ist eine native Gelelektrophorese mit Seren aus UCB und PB nach Ammoniumsulfatfällung mit an-schließender Silbernitratfärbung dargestellt (n = 2).

69 3.4.4.2 Visualisierung eines IgM-Moleküls

Nach dem Versuch eine pentamere oder hexamere IgM-Struktur mittels nativer Gel-elektrophorese und WB zu detektieren, wurden IgM-Moleküle aus Zellüberständen von reifen CD5⁺ B-Zellen aus UCB und PB (in vitro unstimuliert bzw. stimuliert) mit Hilfe eines TEMs und AFMs, zur weiteren Strukturaufklärung, visualisiert. Dazu wurden Zell-überstände an Kooperationspartner übergeben. In Abbildung 15 werden exemplarisch Aufnahmen präsentiert. In Abbildung 15A und 15B sind IgM-Moleküle aus einem CD5⁺ B-Zellüberstand aus UCB nach dreitägiger simulierter CpG-Stimulierung mit Hilfe ei-nes TEMs und in Abbildung 15C mit Hilfe eiei-nes AFMs dargestellt. IgM-Moleküle lassen sich sowohl mit TEM als auch mit AFM detektieren und darstellen, jedoch ist eine Be-urteilung der pentameren oder hexameren Struktur auf Grund der vorliegenden Mole-kül-Konformation schwer möglich.

Abbildung 15: TEM- und AFM-Aufnahmen von IgM aus CD5⁺ B-Zellüberstand aus UCB mit simulierter CpG-Stimulierung.

CD5⁺ B-Zellen wurden aus UCB isoliert und für drei Tage mit simulierter CpG-Stimulierung in Kultur genommen.

Anschließend erfolgte eine Visualisierung von IgM-Molekülen aus Zellüberstand mit einem A) / B) TEM und C) AFM.

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