Monozytendifferenzierung durch Zytokinzugabe

Durch Zugabe von jeweils IFN-γ, IL-6, M-CSF, MCP-1, einem Gemisch aus allen vier Zytokinen (Mix 1) oder IL-6 zusammen mit M-CSF (Mix 2) wurde der Einfluss der ge-nannten Zytokine auf die Differenzierung von CD14⁺ Monozyten aus UCB und PB zu M1- (CD80⁺CD163^-, magenta) oder M2- (CD80^-CD163⁺, hellgrün) Makrophagen un-tersucht. Neben der Entwicklung zu M1- oder M2-Makrophagen wurden die Phänoty-pen CD80⁺CD163⁺ (orange) und CD80^-CD163^- (hellblau) ebenfalls bestimmt.

Im Folgenden wird auf die Monozytendifferenzierung aus UCB eingegangen (Abbil-dung 19 und 25). An Tag 0 zeigten fast 90% der Monozyten einen undifferenzierten Phänotyp (CD80^-CD163^-, hellblau) und nur etwa 6% waren M1-Makrophagen (ma-genta). Zu diesem Zeitpunkt trat kein CD80⁺CD163⁺ Phänotyp (orange) und nur we-nige (2%) M2-Makrophagen (hellgrün) auf. Nach drei Tagen in vitro ohne Zytokin-Zu-gabe waren die Monozyten größer geworden und hatten sich in ihrer Granularität ver-ändert. Über 70% der Monozyten differenzierten zu einem CD80⁺CD163⁺ Phänotyp.

Etwa 24% der Monozyten waren zu M1-Makrophagen geworden und keine Monozyten hatten sich zu M2-Makrophagen oder dem Phänotyp CD80^-CD163^- entwickelt. Nach drei Tagen unter Einfluss mit IFN-γ waren aus den CD14⁺ Monozyten nahezu 100%

zu M1-Makrophagen ausdifferenziert. Ein ähnliches Ergebnis zeigte die Kultur der CD14⁺ Monozyten mit Mix 1. Dabei waren ebenfalls zu 100% M1-Makrophagen ent-standen. Aus in vitro Kulturen mit den Zytokinen M-CSF oder IL-6 differenzierten je

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80% der Monozyten zu CD80⁺CD163⁺ und etwa 15% der Monozyten zu M1-Makro-phagen. Keine Monozyten hatten M2-Makrophagen oder den Phänotypen CD80 -CD163^- hervorgebracht. Die Kombination aus IL-6 und M-CSF (Mix 2) zeigte eine ver-gleichbare Entwicklung. Wie die Ergebnisse der anderen Kulturen auch, wies die In-kubation der Monozyten mit MCP-1 keine Ausdifferenzierung zu M2-Makrophagen auf.

Monozyten hatten sich in etwa zu gleichen Anteilen von etwa 50% zu M1-Makropha-gen und dem CD80⁺CD163⁺-Phänotyp entwickelt.

Zusammenfassend differenzierten Monozyten aus UCB in Kultur mit IFN-γ, MCP-1 oder einem Gemisch aus allen vier Zytokinen (Mix 1) hauptsächlich zu M1-Makropha-gen, während Monozyten in Kultur mit M-CSF, IL-6 oder einem Gemisch aus IL-6 und M-CSF (Mix 2) sich primär zu CD80⁺CD163⁺ Monozyten entwickelten (Abbildung 19).

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Abbildung 19: Monozytendifferenzierung durch Zytokineinfluss zu M1- und M2- Makrophagen aus UCB.

Monozyten aus UCB wurden nach magnetischer Zellseparation mit anti-CD14 Microbeads (Miltenyi Biotec) und anschließender durchflusszytometrischer Zellsortierung mit jeweils einem Zytokin (IFN-γ, M-CSF, IL-6 oder MCP-1) oder einem Zytokin-Gemisch aus vier (Mix MCP-1) oder zwei (IL-6 und M-CSF, Mix 2) Zytokinen für drei Tage inkubiert.

Gezeigt ist die Verteilung von M1- (CD80⁺CD163^-, magenta) und M2-Makrophagen (CD80^-CD163⁺, hellgrün), sowie von den CD80⁺CD163⁺ (orange) und den CD80^-CD163^- (hellblau) Phänotypen direkt nach der Zellsortierung (d0) und nach drei Tagen Inkubation (d3). Die Analyse ist repräsentativ für drei Spender. Isotypkontrolle s. Abbildung 25.

In Abbildung 20 ist die Monozytendifferenzierung zu M1- (magenta) oder M2- (hell-grün) Makrophagen aus PB dargestellt (für Isotypkontrollen s. Abbildung 25). Neben der Entwicklung zu M1- oder M2-Makrophagen wurden die Phänotypen CD80⁺CD163⁺ (orange) und CD80^-CD163^- (hellblau) ebenfalls bestimmt. Zu Beginn der Analyse (d0) prägten 80% der Monozyten einen M2-Makrophagen-Phänotyp aus, 10% einen M1-Makrophagen-Phänotyp und etwa 8% zeigten den CD80^-CD163^- Phänotyp. An Tag

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drei ohne Zytokin-Zugabe hatten die Monozyten in ihrer Größe und Granularität zuge-nommen und ihren Phänotyp zu M1-Makrophagen (54%) und CD80⁺CD163⁺ Monozy-ten (42%) verändert. In diesem Stadium ließen sich keine M2-Makrophagen oder CD80^-CD163^- Monozyten mehr nachweisen. An Tag drei (d3) der Inkubation mit dem Zytokin IFN-γ, einem Gemisch aus allen vier Zytokinen (Mix 1) oder aus IL-6 und M-CSF (Mix 2), konnte eine Ausdifferenzierung der Monozyten zu fast 100% zu M1-Mak-rophagen beobachtet werden. Monozyten, die mit M-CSF oder IL-6 inkubiert wurden, zeigten mit 60% eine Tendenz in Richtung CD80⁺CD163⁺ Monozyten auf. Die restli-chen 40% waren M1-Makrophagen. Mit MCP-1 inkubierte Monozyten hatten zu 60%

einen M1-Makrophagen-Phänotyp entwickelt. Die übrigen 40% wiesen einen CD80⁺CD163⁺ Phänotyp auf.

Zusammenfassend entwickelten sich Monozyten aus PB unter Einfluss von IFN-γ, Mix 1 oder Mix 2 zu 100% zu M1-Makrophagen. Der Einfluss von MCP-1 zeigte eine Entwicklungs-Tendenz in Richtung M1-Makrophagen und unter M-CSF- oder IL-6-Sti-mulierung entwickelten sich 40% der Monozyten zu M1-Makrophagen. Keins der Zy-tokine dirigierte aktiv eine Monozyten-Entwicklung in Richtung M2-Makrophagen (Ab-bildung 20).

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Abbildung 20: Monozytendifferenzierung durch Zytokineinfluss zu M1- und M2- Makrophagen aus PB.

Monozyten aus PB wurden nach magnetischer Zellseparation mit anti-CD14 Microbeads (Miltenyi Biotec) und an-schließender durchflusszytometrischer Zellsortierung mit jeweils einem Zytokin (IFN-γ, M-CSF, IL-6 oder MCP-1) oder einem Zytokin-Gemisch aus vier (Mix 1) oder zwei (IL-6 und M-CSF, Mix 2) Zytokinen für drei Tage inkubiert.

Gezeigt ist die Verteilung für M1- (CD80⁺CD163^-, magenta) und M2-Makrophagen (CD80^-CD163⁺, hellgrün), sowie die CD80⁺CD163⁺ (orange) und CD80^-CD163^- (hellblau) Phänotypen direkt nach Zellsortierung (d0) und nach drei Tagen Inkubation (d3). Die Analyse ist repräsentativ für drei Spender. Isotypkontrolle s. Abbildung 25.

Im Vergleich der Ergebnisse zur Monozytendifferenzierung aus UCB und PB ließ sich feststellen, dass ein Unterschied bereits an Tag 0 bestand. Der größte Anteil an initia-len Monozyten aus UCB zeigte einen CD80^-CD163^- Phänotyp, während der größte initiale Anteil an Monozyten aus PB einen M2-Makrophagen-Phänotyp aufzeigte. Nach drei Tagen in vitro entwickelte sich eine Mehrzahl der Monozyten aus UCB zum CD80⁺CD163⁺ Phänotyp und aus PB zum M1-Makrophagen-Phänotyp. Sowohl Mo-nozyten aus UCB als auch aus PB zeigten unter IFN-γ- und Mix 1-Einfluss bis nahezu 100% einen M1-Makrophagen-Phänotyp auf. Monozyten aus UCB als auch aus PB

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zeigten unter M-CSF- oder IL-6-Einfluss eine Entwicklung zu CD80⁺CD163⁺ Monozy-ten auf, wobei die Neigung bei MonozyMonozy-ten aus UCB stärker ausgeprägt war als bei Monozyten aus PB. Bei Inkubation mit einem Gemisch aus M-CSF und IL-6 (Mix 2) entwickelten Monozyten aus UCB und PB verschiedene Differenzierungsrichtungen.

Monozyten aus UCB zeigten unter Mix 2-Einfluss 89% CD80⁺CD163⁺ Monozyten auf, während Monozyten aus PB unter Mix 2-Einfluss zu 98% einen M1-Makrophagen-Phänotyp aufwiesen. Lediglich der Einfluss von MCP-1 zeigte bei Monozyten sowohl aus UCB als auch aus PB eher eine Entwicklung in Richtung M1-Makrophagen auf.

Monozyten aus UCB genauso wie Monozyten aus PB differenzierten mit keinem der hier verwendeten Zytokin oder Zytokin-Gemisch vermehrt zu M2-Makrophagen.

Außerdem wurde ein Vergleich der Monozytendifferenzierung zwischen Monozyten aus UCB (orange) und aus PB (blau) normalisiert auf die Kontrolle (Monozytendiffe-renzierung an Tag 3 ohne Zytokin-Zugabe) mit anschließender Veränderung bzw. Ver-hältnis zu Tag 0 zur besseren Visualisierung durchgeführt (Abbildung 21). Unter Zu-gabe von IFN-γ konnte bei Monozyten aus UCB eine Zunahme von M1-Makrophagen beobachtet werden, während eine Abnahme des CD80⁺CD163⁺ Phänotyps im Ver-gleich zu Tag 0 stattfand. Ein ähnliches Ergebnis erzielte auch die in vitro Kultur mit Mix 1. Eine Inkubation der Monozyten aus UCB und PB mit IL-6 bewirkte eine leichte Abnahme der M1-Makrophagen und eine Zunahme des CD80⁺CD163⁺ Phänotyps, wobei die Ab- und die Zunahme der Monozyten aus UCB stärker ausfiel als bei Mo-nozyten aus PB. Ein ähnliches Ergebnis wie bei der Inkubation mit IL-6 konnte auch bei der Kultur mit M-CSF vermerkt werden. MCP-1 bewirkte bei Monozyten aus UCB eine Zunahme der M1-Makrophagen und gleichzeitig eine Abnahme des CD80⁺CD163⁺ Phänotyps. Die in vitro Kultur mit Mix 2 zeigte bei Monozyten aus UCB eine Abnahme der M1-Makrophagen und eine starke Zunahme des CD80⁺CD163⁺ Phänotyps. Für Monozyten aus PB bewirkte Mix 2 hingegen eine Abnahme des CD80⁺CD163⁺ Phänotyps. Alle vier Zytokine und auch die Zytokin-Gemische zeigten auf die Entwicklung von M2-Makrophagen und auf den CD80^-CD163^- Phänotyp kaum Einfluss (Abbildung 21).

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Abbildung 21: Vergleich der Monozytendifferenzierung zwischen Monozyten aus UCB und PB mit Hilfe von Zytokinen.

Monozyten aus UCB (n = 3) und aus PB (n = 3) wurden nach magnetischer Zellseparation mit anti-CD14 Microbe-ads (Miltenyi Biotec) und anschließender durchflusszytometrischer Zellsortierung mit jeweils einem Zytokin (IFN-γ, M-CSF, IL-6 oder MCP-1) oder einem Zytokin-Gemisch aus vier (Mix 1) oder zwei (IL-6 und M-CSF, Mix 2) Zytoki-nen für drei Tage inkubiert. Dargestellt ist ein Vergleich der Monozytendifferenzierung zwischen Monozyten aus UCB (orange) und PB (blau) normalisiert auf die Phänotypen an Tag 3 ohne Zytokin-Zugabe, mit anschließender Veränderung zu Tag 0.

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