2.1 Materialien
2.1.13 Acrylamid-Gele
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad, USA
Novex NativePAGE 3-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific, USA
31 2.1.14 Medien und Puffer
DPBS (10x) Pan Biotech, Aidenbach
Laemmli-Puffer (4x) Bio-Rad, München
NativePAGE Running Buffer (20x) Thermo Fisher Scientific, USA NativePAGE Sample Buffer (4x) Thermo Fisher Scientific, USA
RPMI 1640 Pan Biotech, Aidenbach
RunBlue FAST Blotting Buffer Expedeon, UK
Taq-Puffer mit KCl (10x) Thermo Fisher Scientific, USA
TAE-Puffer (50x) Roth, Karlsruhe
Tris/Glycin/SDS-Puffer (10x) Bio-Rad, USA
Waschpuffer Western Blot (WB): Blockpuffer (WB):
DPBS (1x) 99,95% v/v BSA 5%
Tween-20 0,05% v/v DPBS (1x) 99,95% v/v
Tween-20 0,05% v/v
Coomassie-Färbelösung: Entfärbelösung:
Coomassie R250 0,2% w/v Methanol 50% v/v
Methanol 50% v/v Essigsäure 6% v/v
Waschpuffer (Zellisolierung): Zellmedium:
BSA 0,5% RPMI 1640
DPBS (1x) 99,95% v/v + 1% Penicillin/Streptomycin + 20% Fötales Kälberserum (FCS)
2.1.15 Software
AriaMx Agilent Technologie, USA
BD FACSDiva BD Biosciences, Heidelberg
CytExpert Beckman Coulter, Krefeld
FlexControl Bruker Daltonics, Bremen
32
GeneMapper, Version 3.7 Applied Biosystems, USA
Image Lab Bio-Rad, Hercules, USA
KC4 BioTek Instruments, Bad Friedrichshall
R Project www.r-project.org, USA
R Studio www.rstudio.com, USA
2.2 Methoden
2.2.1 Zytologische Methoden
2.2.1.1 Isolierung von Zell-Populationen aus humanem Gewebe
Die Isolierung der humanen Zell-Populationen erfolgte aus UCB und PB. Die Blutab-nahme und Verwendung erfolgten unter schriftlichem Einverständnis der Spender bzw.
eines Erziehungsberechtigten und einem entsprechenden Votum der lokalen Ethik-kommission. Die isolierten humanen CD34+ Stammzellen wurden von dem Institut für Transfusionsmedizin (Prof. Dr. Peter Horn) des Universitätsklinikums Essen zur Ver-fügung gestellt.
2.2.1.1.1 Isolierung von B- und T-Zellen, sowie Monozyten aus humanem Ge-webe
Die Gewinnung von B-, T-Zellen, sowie Monozyten erfolgte aus UCB, PB oder Buffy Coats gesunder adulter Blutspender. Mononukleäre Zellen wurden dabei aus Vollblut oder UCB in Leucosep-Gefäße (Greiner Bio One) und aus Buffy Coats in Falcon-Ge-fäße auf Pancoll (Dichte 1,077 g/ml, Pan-Biotech) überschichtet und die zellulären Be-standteile durch Dichtegradientenzentrifugation bei 400 x g für 40 min bei 18°C sepa-riert. Anschließend wurden mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (PBMCs, engl.:
peripheral blood mononuclear cells) abgenommen. 107 PBMCs wurden mit je 20 µl anti-CD19-, anti-CD3- oder anti-CD14-gekoppelten Microbeads (MACS, Miltenyi Bio-tec) für 20 min bei 4°C inkubiert. Durch Zentrifugation bei 400 x g und 4°C wurden überschüssige Microbeads mit zehnfachem Volumen an Phosphat-gepufferter Salzlö-sung mit Rinderserumalbumin (1x DPBS mit 0,5% BSA) entfernt. Anschließend wurde
33
das Sediment in 4 ml 1x DPBS mit 0,5% BSA auf eine LS-Säule (Miltenyi Biotec) auf-getragen, gewaschen und die bevorzugten Zellen nach Herstellerangaben eluiert.
2.2.1.2 Durchflusszytometrische Analysen und Zellsortierung
Für durchflusszytometrische Analysen und Zellsortierung wurden isolierte Zellen mit Fluoreszenz-gekoppelten Antikörpern für spezifische Oberflächenantigene gefärbt.
Dafür wurden isolierte Zellen in 80 µl 1x DPBS mit 0,5% BSA zusammen mit Antikör-pern bei 4°C für 20 min im Dunkeln inkubiert. Überschüssige Antikörper wurden mit 5 ml 1x DPBS mit 0,5% BSA durch Zentrifugation bei 400 x g für fünf Minuten entfernt.
Durchflusszytometrische Bestimmungen zur Ausprägung von Oberflächenmolekülen, Granularität und Größe wurden am CytoFLEX S Durchflusszytometer (Beckman Coul-ter) und Zellsortierungen am BD FACSAria III Zellsortierer (BD Biosciences) oder BD FACSAria Fusion (BD Biosciences) durchgeführt. Es wurde die Software CytExpert (Beckman Coulter) und die Software BD FACSDiva (BD Biosciences) zur Analyse ver-wendet.
2.2.1.3 Zellzahlbestimmung
Die Bestimmung der Zellzahl fand am CytoFLEX S Durchflusszytometer (Beckman Coulter) statt. Dazu wurde eine 1:100 Verdünnung der Zellen in 1x DPBS mit 0,5% BSA hergestellt. Zur Analyse wurde die Software CytExpert (Beckman Coulter) verwendet.
2.2.1.4 Kultivierung von humanen Zellen
Durchflusszytometrisch sortierte Zellen wurden zur Stimulierung für zwei, drei oder vier Tage bei 37°C und 5% CO2-Atmosphäre kultiviert. Humane Zellen wurden in RPMI1640 Medium und 100 U/ml Penicillin sowie 100 µg/ml Streptomycin (Pan Bio-tech, Pen/Strep) mit oder ohne 20% fötalem Kälberserum (engl.: fetal calf serum, FCS)
34
in Kultur gehalten. Die Stimulierung der Zellen erfolgte entweder mit ODN D-SL01 (In-vivoGen, CpG), AffiniPure F(ab)2 Fragment Goat Anti-Human IgA+IgG+ IgM (Jackson ImmunoResearch, α-Ig) oder CD40 Ligand (CD40L, R&D Systems) mit Hämagglu-tinin/HA Peptid Antikörper (α-HA, R&D Systems) und α-Ig. Als Kontrolle wurden Zellen ohne Stimulierung kultiviert. Im Folgenden sind die Reagenzien und ihre verwendeten Konzentrationen aufgeführt.
2.2.1.5 Proliferationsanalyse mit Dye eFluor 670
Mit Hilfe des Dye eFluor 670 (Thermo Fisher Scientific) wurde eine Proliferationsana-lyse von reifen CD5+ und CD5- B-Zellen aus UCB und PB durchgeführt. Dye eFluor 670 ist ein roter Fluoreszenzfarbstoff, der an zelluläre Proteine bindet, die primäre Amine enthalten. Durch Zellteilung wird der Farbstoff gleichmäßig auf die Tochterzellen ver-teilt, wodurch die resultierende Intensität des Farbstoffs halbiert wird. Es wurden pro Ansatz 5x104 bis 3x105 Zellen verwendet und die Stimulationsbedingungen CpG, α-Ig und TD eingesetzt (s. Punkt 2.2.1.4). Des Weiteren wurden Co-Kulturen mit T-Helfer-zellen (CD4+CD25-), stimuliert durch anti-CD2/anti-CD3/anti-CD28-Beads, durchge-führt. Dye eFluor 670 wurde mit einer Konzentration von 5 µM 1:1 mit dem Zellvolumen vermischt und das Gemisch für 10 Minuten bei 37°C im Dunkeln inkubiert. Anschlie-ßend erfolgte zum Abstoppen der Färbung eine Zugabe an fünffachem Volumen RPMI1640 Medium mit Pen/Strep und 20% FCS sowie eine Inkubation auf Eis für fünf Minuten. Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit RPMI 1640 Medium mit Pen/Strep und 20% FCS gewaschen und für zwei oder vier Tage mit Zugabe eines Stimulationsmittels bei 37°C und 5% CO2-Atmosphäre kultiviert. Nach der Kultivierung erfolgte die Erfassung der Dye-Intensität bei Extinktion durch eine Lichtwellenlänge
35
von 633 nm am CytoFlex S (Beckman Coulter) unter Verwendung der CytExpert Soft-ware (Beckman Coulter). Ermittelte Intensitäten unter verschiedenen Stimulationsbe-dingungen wurden auf die Intensität der unstimulierten Kondition normalisiert.
2.2.1.6 Zelldifferenzierungs- und Klassenwechselanalyse
Für eine durchflusszytometrische Analyse der B-Zelldifferenzierung wurden Zellen nach einer magnetischen Zellseparation mit anti-CD19-Beads (Miltenyi Biotec) für zwei Tage mit CpG und TD (s. Punkt 2.2.1.4) kultiviert. Des Weiteren erfolgte eine Plas-mablastdifferenzierungsanalyse von B-Zellen aus UCB und PB über vier Tage unter TI-I- (CpG) oder Co-Kultur Bedingungen mit T-Helferzellen (CD4+CD25-), stimuliert durch anti-CD2/anti-CD3/anti-CD28-Beads nach Herstellerangabe. Die Differenzie-rung der B-Zellen wurde über vier Tage verteilt mittels CytoFlex S (Beckman Coulter) Durchflusszytometer analysiert.
Für eine durchflusszytometrische Analyse zu IgA- und IgG-Klassenwechsel wurden CD5+ und CD5- B-Zellen aus UCB und PB isoliert und drei Tage mit 1 ng/µl Recombi-nant Human Transforming Growth Factor-beta 1 (TGF-β) und 15 ng/µl α-Ig stimuliert.
Anschließend erfolgte eine Analyse mittels CytoFlex S (Beckman Coulter) unter Ver-wendung der CytExpert Software (Beckman Coulter).
2.2.1.7 Humanisierung von NSG-Mäusen mit hämatopoetischen Vorläuferzellen In Kooperation mit dem Institut für Transfusionsmedizin (Prof. Dr. Horn) wurden hu-mane CD34+ hämatopoetische Vorläuferzellen aus UCB und PB isoliert. Bis zu 2x105 Zellen wurden in 200 µl RPMI1640 Medium ohne weitere Zusätze in die Schwanzvene einer NSG-Maus (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) injiziert. Dieser NSG-Maus-Stamm besitzt einen speziellen Genotyp, dem eine non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency (NODscid) und eine Null-Mutation der Gamma Kette des Interleukin-2-Rezeptors (Il2rg) zu Grunde liegt. Aus diesem Grund werden kaum Zellen des murinen Immunsystems, wie B-, T- Lymphozyten und natürliche
Kil-36
lerzellen produziert, nur wenige DCs generiert und weniger Komplementsystem-Fak-toren sezerniert, wodurch die injizierten humanen CD34+ hämatopoetische Vorläufer-zellen anwachsen, proliferieren und ein humanisiertes Immunsystem in der Maus etab-lieren können. Zusätzlich wurde den NSG-Mäusen, 24 Stunden vor Zellinjektion, 30 mg/kg Busulfan (Busilvex, Pierre Fabre Pharma) intravenös verabreicht. Busulfan dient der Eliminierung von restlichen murinen Immunzellen, die vor der Humanisierung gebildet wurden. Nach 12 Wochen in keimfreier Umgebung wurden den Mäusen Blut-serum, Knochenmark und Milz entnommen, sowie eine Peritoneal-Lavage durchge-führt. Alle Mausarbeiten erfolgten in Kooperation mit der Klinik für Hämatologie und Stammzelltransplantation (Prof. Dr. Reinhardt) an dem Universitätsklinikum Essen.
Das entnommene Gewebe wurde homogenisiert, Erythrozyten aus der Milz lysiert (mit 1 ml bidest. Wasser für 30 Sekunden inkubieren, anschließend mit 40 ml PBS mit 0,5% BSA waschen) und mononukleäre Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation angereichert.
2.2.1.8 Zytokinprofilanalyse
Zur Analyse der Zytokinsezernierung wurden reife CD5+ und CD5- B-Zellen aus UCB und PB durchflusszytometrisch sortiert und für zwei Tage in RPMI1640 Medium mit Pen/Strep und ohne FCS mit verschiedenen Stimulanzien (s. Punkt 2.2.1.4) oder 1 ng/µl Recombinant Human Tumor Necrosis Factor-alpha (ImmunoTools, TNF-α) mit 1 ng/µl Recombinant Interleukin 6 (ImmunoTools, IL-6) kultiviert. Nach zwei Tagen In-kubation wurde der Zellkulturüberstand gesammelt und mit Hilfe des Human XL Cyto-kine Array Kits (R&D Systems) eine Zytokinprofilanalyse nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der Programme ImageJ und R.
2.2.1.9 Monozytendifferenzierung
Zur in vitro Untersuchung der Ausdifferenzierung von Monozyten entweder zu M1- (CD80+CD163-) oder zu M2- (CD80-CD163+) Makrophagen aus UCB oder PB, wurde nach Durchführung einer magnetischen Zellseparation mit anti-CD14 Microbeads (Mil-tenyi Biotec) eine durchflusszytometrische Zellsortierung zum Ausschluss von B- und
37
T-Lymphozyten durchgeführt. Anschließend wurden 3x104 Monozyten in 150 µl RPMI1640 Medium zusammen mit Pen/Strep und 20% FCS pro Ansatz in eine 96-Well Mikroplatte (Greiner Bio-One) aufgetragen. Pro Ansatz wurden zwei technische Replikate durchgeführt. Es erfolgte entweder eine Co-Inkubation der Monozyten mit CD5+ oder CD5- B-Zellen, oder mit Zytokinen allein. Es wurden folgende Zytokine in einer Konzentration von 1 ng/150 µl Medium verwendet: IL-6, IFN-γ, MCP-1 und M-CSF. Zusätzlich erfolgte eine Inkubation mit einem Gemisch aus allen vier Stimulan-zien (Mix 1) oder aus IL-6 und M-CSF (Mix 2). Bei einer Co-Inkubation mit B-Lympho-zyten wurden die Zellen, wie in Punkt 2.2.1.1.1 beschrieben, aufbereitet und je 60x103 B-Zellen pro Ansatz zu den Monozyten zugegeben. Außerdem erfolgte eine Co-Inkubation der Zellen zusammen mit dem Stimulationsmittel α-Ig. Als Kontrolle wur-den Monozyten allein oder mit α-Ig inkubiert. Die Auswertung der Analyse erfolgte mit dem Programm CytExpert (Beckman Coulter).
2.2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.2.1 RNA-Isolierung
Zur Extraktion von RNA aus Zellen (≤ 7x105 Zellen) wurde das RNeasy Micro Kit (Qi-agen) nach Herstellerangaben verwendet.
2.2.2.2 Reverse Transkription
RNA wurde mit Hilfe des High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Bio-systems) mit zufälligen Hexamer-Oligonukleotiden nach Herstellerangaben zu cDNA (engl.: complementary DNA) synthetisiert. Es wurde das Gerät Biometra UNO II (Bio-metra) verwendet.
38
2.2.2.3 DNA- und RNA-Konzentrationsbestimmung
Zur Bestimmung der DNA- und RNA-Konzentration wurde eine mikrovolumenspektro-metrische Messung am NanoDrop ND-1000 Spektrophotometer (Thermo Fisher Sci-entific) durchgeführt. Dabei wurde die optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Zusätzlich wurde zur Bestimmung der RNA-Qualität die OD bei 280 nm bestimmt. Dadurch konnten durch Ermittlung des Quotienten aus OD bei 260 nm und OD bei 280 nm Verunreinigungen durch zum Beispiel aromatische Sub-stanzen, Proteine oder genomische DNA weitgehend ausgeschlossen werden.
2.2.2.4 MicroRNA-Analyse
Die microRNA-Analyse von LET-7b in humanen B-Zellen aus UCB und PB wurde mit Hilfe des Taqman microRNA Assays von Applied Biosystems durchgeführt. Die Ana-lyse, ohne Präamplifikation, erfolgte nach Herstellerangaben.
2.2.2.5 Agarose-Gelelektrophorese
Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Größe wurde eine Agarose-Gel-elektrophorese durchgeführt. Dafür wurden 2 % w/v Agarose in 1x Tris-Acetat-EDTA (TAE) durch Erhitzen aufgelöst. Nach Abkühlen, wurde GelRed (Biotium) hinzugege-ben und das Gemisch in einen Gelschlitten (Thermo Fisher Scientific) gegossen. Gel-Red interkaliert mit der DNA und kann durch ultraviolettes (UV) Licht angeregt werden.
Durch UV-Licht Anregung kann DNA quantitativ visualisiert werden. Verwendete Pro-ben wurden mit 6x Orange Loading Dye (Fermentas) versetzt und in Geltaschen ge-geben. Anschließend wurde die FastLoad 50 bp DNA Ladder (Serva) auf das Gel zum Vergleich der Molekülgrößen aufgetragen und die Gelelektrophorese in der Elektro-phoresekammer (Thermo Fisher Scientific) für eine Stunde bei 140 V gestartet. Zur Visualisierung der DNA-Fragmente wurde die Produktintensität photometrisch mit dem Gelbelichter Gel Doc XR+ Molecular Imager (Bio-Rad) analysiert.
39 2.2.2.6 Polymerase-Kettenreaktion
Bei einer Polymerasen-Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction, PCR) erfolgt eine in vitro DNA-Vervielfältigung. Dies geschieht indem eine thermostabile DNA-ab-hängige Taq-Polymerase spezifisch neue längendefinierte DNA-Fragmente, abhängig von einer DNA-Matrize, synthetisiert. Eine PCR basiert auf drei Schritten: Im ersten Schritt erfolgt die Denaturierung der DNA-Doppelstränge, im zweiten Schritt, der Hyb-ridisierung (engl.: annealing), lagern sich spezifisch gewählte Oligonukleotide bekann-ter Sequenz (Primer) revers komplementär an jeweils einen DNA-Einzelstrang an und im dritten Schritt erfolgt die Elongation, bei der die Taq-DNA-Polymerase mit freien Nukleotidtriphosphaten den komplementären DNA-Strang neu synthetisiert. Dieses Verfahren wurde für zwei Fragestellungen in dieser Arbeit verwendet. Erstens zum Vergleich der Transkriptbildung von membranständigem und für die Sezernierung vor-gesehenem (sezerniertem) IgM und zweitens zur Kontrolle der Expression der beiden Spleißvarianten des Transkriptionsfaktors XBP1 bei CD5+ und CD5- B-Zellen aus UCB und PB. 3,5 µg RNA wurden für die cDNA-Synthese verwendet und jeweils 500 ng cDNA in einer PCR eingesetzt. Als Referenz bzw. als Positivkontrolle wurde bei der PCR zur Expression von membranständigem und sezerniertem IgM Aktin und bei der PCR zur Expression von XBP1, die Zelllinie KARPAS 299, die mit dem Reagenz Thap-sigargin (2 nM) (Carnesecchi et al., 2015) versetzt war, verwendet. Zusätzlich erfolgte als Negativkontrolle der Einsatz von Wasser anstatt cDNA als Matrize. Im Folgenden sind ein Versuchsansatz (Gesamtvolumen 20 µl) und die Programmschritte des T pro-fessional Thermocycler (Biometra) aufgeführt.
Tabelle 6: PCR-Reaktionsansatz.
Reagenz Volumen [µl]
dNTP (10 mM) 1
Taq-Puffer mit KCl (10x) 2
MgCl2 (25 mM) 2
Taq-DNA-Polymerase (1 U/µl) 0,2
cDNA (500 ng) 0,5
Forward (FW) Primer (100 pmol/µl) 0,2 Reverse (RV) Primer (100 pmol/µl) 0,2
RNAse-freies Wasser 13,9
40
Tabelle 7: PCR-Konditionen.
Membranständi-ges/sezerniertes IgM
XBP1
Programmschritt Zeit [sek] Temperatur [°C] Zeit [sek] Temperatur [°C]
1 180 98 180 98
Die quantitative real-time PCR (qPCR) kombiniert die Eigenschaften einer normalen PCR mit einer quantitativen Fluoreszenzmessung, die durch ein interkalierendes Flu-orophor oder eine Sonde ausgelöst wird, die proportional zum Anteil an dsDNA (dop-pelsträngige DNA) in der Probe enthalten ist. Der Taqman-PCR-Assay besteht aus einem Oligonukleotid, welches am 5`-Ende mit einem fluoreszierenden Reporter-Farb-stoff und am 3`-Ende mit einem Quencher-FarbReporter-Farb-stoff versetzt ist. Sobald die Taqman-Sonde an eine spezifische DNA-Sequenz gebunden hat, wird der Quencher durch die Nukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase abgespalten und die Emission des Repor-ter-Moleküls steigt quantitativ mit der Akkumulation des Reporters mit jedem PCR-Zyklus an. Zur Erfassung der Fluoreszenz wurde der Farbstoff FAM (Carboxyflu-orescein) verwendet. Die qPCR erfolgte mit dem AriaMx Real-Time PCR System (Agilent Technologie) unter der Verwendung des TaqMan Universal PCR 2x Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Für die cDNA-Synthese wurden 3,5 µg RNA eingesetzt und jeweils 500 ng cDNA in einem qPCR-Reaktionsansatz benutzt. Als Referenz für die Menge an eingesetzter cDNA wurden Ansätze mit der Sonde für GAPDH erstellt.
Zusätzlich erfolgte als Negativkontrolle der Einsatz von Wasser anstatt der cDNA. Die Ansätze wurden jeweils als Triplett auf eine 96-Well-PCR Platte (Biozym Scientific) aufgetragen. Im Folgenden ist ein Versuchsansatz (Gesamtvolumen 10 µl) und die Programmschritte aufgeführt. Die Auswertung der erhaltenen Daten erfolgte mit dem Programm AriaMx (Agilent Technologie).
41
Tabelle 8: qPCR-Reaktionsansatz.
Reagenz Volumen [µl]
TaqMan Universal PCR Master Mix (2x) 5
cDNA (500 ng) 0,5
Taqman-Sonde 0,5
RNAse-freies Wasser 4
Tabelle 9: qPCR-Konditionen.
Programmschritt Zeit [sek] Temperatur [°C]
1 120 50
2 600 95
3 15 95
4 60 60
Wdh. Schritt 3-4 für 45-mal
2.2.2.8 Fragmentlängenanalyse
Zur Fragmentlängenanalyse wurde das GenePrint 10 System (Promega) nach Her-stellerangaben verwendet. Zuerst wurde die Konzentration des PCR-Produkts mittels NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) bestimmt und auf 10 ng/µl mit bidest. Wasser verdünnt. Anschließend erfolgte eine Präamplifikation nach Herstellerangabe mit Ge-nePrint 10 Master Mix und Primer Mix. Zuletzt wurden die generierten Produkte, eben-falls nach Herstellerangaben, für den Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems) vor-bereitet, indem pro Ansatz und 1 µl Probe 9,5 µl Hi-Di-Formamid und 0,5 µl Internal Lane Standard 600 aus dem GenePrint 10 System (Promega), verwendet wurden. Die Analyse durch den Sequenzierer (Genetic Analyzer 3130, Applied Biosystems) wurde mit der GeneMapper Software, Version 3.7 durchgeführt.
42 2.2.3 Biochemische Methoden
2.2.3.1 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) / Western-Blotting
Für einen Proteinnachweis wurde eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelekt-rophorese (SDS-PAGE) durchgeführt. Dafür wurden Proteinkonzentrate mit 4x La-emmli-Puffer (Bio-Rad) und 1 mM DTT versetzt und für 15 min bei 90°C denaturiert.
Es wurden 4-15% Tris-Glycin-Acrylamid-Gele (Bio-Rad) zur Proteinauftrennung ver-wendet. Nach Beladen des Gels wurde als Laufpuffer der Tris/Glycin/SDS-Puffer (Bio-Rad) in die Gelelektrophoresekammer (Bio-(Bio-Rad) gefüllt und die Proteine bei 120 V für 60 Minuten der Größe nach aufgetrennt. Anschließend wurden Proteine aus dem Gel auf eine Nitrocellulose-Membran mittels iBlot Dry Blotting System (Invitrogen) transfe-riert und dabei die Einstellungen nach Herstellerangaben mit dem Programm 4 durch-geführt. Zum Vergleich wurden die Größenstandards PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher Scientific) und MagicMark XP Western Protein Standard (Thermo Fisher Scientific) verwendet. Zur Reduktion von unspezifischen Bindungen der Antikörper an die Nitrocellulose-Membran wurde die Membran nach einem Trans-fer für eine Stunde in BlockpufTrans-fer (5% BSA in 1x PBS/ 0,05% Tween-20) inkubiert.
Anschließend wurde die Nitrocellulose-Membran über Nacht bei 4°C mit primärem An-tikörper inkubiert. Die verwendeten AnAn-tikörper sind im Abschnitt 2.1.8.1 aufgeführt. Am nächsten Tag wurde die Membran dreimal für fünf Minuten mit Waschpuffer (1x PBS/
0,05% Tween-20) gewaschen und mit einem sekundären Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgte ein weiterer Waschschritt für fünf Mi-nuten mit Waschpuffer (1x PBS/ 0,05% Tween-20). Zum Schluss wurde zur Visuali-sierung der Proteine das Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) verwendet und Bildaufnahmen mit dem Gerät Fusion FX7 (Peqlab) erstellt.
43 2.2.3.2 Native Gelelektrophorese
Die native Gelelektrophorese erfolgte mittels dem NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System (Thermo Fisher Scientific) nach Herstellerangaben, unter Auslass des Katho-denpuffers. Dazu wurden die Novex NativePAGE 3-12% Bis-Tris Protein Gele (Thermo Fisher Scientific) und die XCell SureLock Mini-Cell (Thermo Fisher Scientific) Elektrophoresekammer verwendet. Der Proteintransfer erfolgte auf eine PVDF- (Po-lyvinylidenfluorid) Membran (Roth) mit Hilfe des RunBlue FAST Blotting Buffers (Ex-pedeon) und dem XCell II Blot-Modul (Thermo Fisher Scientific) oder dem Dual Cool Mini-Vertical Electrophoresis/Blotting Sytems (Expedeon) über 3 Tage bei 4°C.
2.2.3.3 Proteinisolierung mittels LigaTrap-Verfahren
Die IgM-Isolierung mittels LigaTrap Human IgM Purification Kit (ImmunoReagents) aus Blutseren oder Zellüberständen erfolgte nach Herstellerangaben. 400 µl Serum oder Zellüberstand wurden mit 100 µl LT Sample Dilutent 2.0 vermischt und bis nach der LigaTrap Säulen-Äquilibration inkubiert. LigaTrap Säulen wurden mit Hilfe des LT Equilibration/Wash Buffer 2.0 äquilibriert und die Probengemische darauf gegeben.
Nach 60-minütiger Inkubation wurden LigaTrap Säulen bei 2000 x g für eine Minute zentrifugiert und dreimal mit 400 µl LT Equilibration/Wash Buffer 2.0 gewaschen. An-schließend erfolgte eine zweimalige Elution mit 400 µl LT Elution Buffer. Erhaltene Lösungen wurden mit 80 µl LT Neutralization Buffer versetzt und LigaTrap Säulen für die nächste Anwendung mit 400 µl LT Regeneration Buffer regeneriert.
2.2.3.4 Ammoniumsulfatfällung
Zellüberstand oder Blutserum wurde in einem 1:1 Verhältnis mit einer zu 50% gesät-tigten Ammoniumsulfatlösung (100% Sättigung entspricht 4,32 mol/l) versetzt und durch mehrmaliges Invertieren vermischt. Anschließend erfolgte eine Inkubation von 30 min bei 4°C. Zur Sedimentierung des Präzipitats erfolgte eine Zentrifugation bei 300 x g für 30 Minuten. Das in 1x PBS resuspendierte Sediment wurde in einer nativen Gelelektrophorese eingesetzt.
44 2.2.3.5 ELISpot-Assay
Das ELISpot-Assay zur Detektion von humanem sezerniertem IgM wurde mit dem ELI-Spot Plus Kit für humanes IgM (MabTech) nach Herstellerangaben durchgeführt. Es wurde eine Positivkontrolle mit IgM+IgD+CD27+ B-Zellen (MBCs) und eine Negativkon-trolle ohne Zellen durchgeführt. Die Aufnahme der Spots erfolgte mit dem ELISpot Reader System (Autoimmun Diagnostika).
2.2.3.6 Analyse von intrazellulärem IgM
Intrazelluläre IgM-Level wurden bei CD5+ und CD5- B-Zellen aus UCB und PB be-stimmt. Dazu wurden Zellen nach Zellsortierung mit je 0,66 µl/ml GolgiStop (BD Biosciences) und je 1 µl/ml GolgiPlug (BD Biosciences) für vier Stunden bei 37°C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Anschließend erfolgte eine Färbung der Zelloberflä-chenmoleküle mit CD5-APC, CD27-PECy7, CD38-PE und IgM-FITC für 15 Minuten bei 4°C im Dunkeln. Nach einem Waschvorgang mit Waschpuffer (PBS/0,5% BSA) und einer Zentrifugation bei 4°C und 400 x g wurden 500 µl Fixations/Permeabilisati-ons-Lösung (BD Biosciences) zu jedem Ansatz gegeben und 7 Minuten bei Raumtem-peratur inkubiert. Nach Inkubation wurden die Zellen mit 4 ml 1x Perm/Wash Puffer (BD Biosciences) gewaschen und nach Entfernen des Puffers intrazellulärer mit IgM-FITC für 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln gefärbt. Bevor die Messung am CytoFlex S (Beckman Coulter) erfolgte, wurden die Zellen erneut mit je 4 ml 1x Perm/Wash Puffer (BD Biosciences) gewaschen und für 5 Minuten bei 400 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Die Ansätze wurden ohne Stimulierung oder mit ver-schiedenen Stimulanzien, wie CpG, α-Ig oder TD (s. Punkt 2.2.1.4) behandelt und für die nächsten ein bis drei Tage bei 37°C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Des Wei-teren wurden Co-Kulturen mit T-Helferzellen (CD4+CD25-), stimuliert durch anti-CD2/anti-CD3/anti-CD28-Beads durchgeführt, die ebenfalls für die nächsten ein bis drei Tage bei 37°C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert wurden.
Nach einem Tag wurde ein Anteil der Zellen durchflusszytometrisch analysiert und ein anderer Anteil, erneut wie zuvor beschrieben, mit GolgiStop (BD Biosciences) und Gol-giPlug (BD Biosciences) behandelt. Nach einer Inkubation von vier Stunden erfolgte
45
eine wiederholte durchflusszytometrische Analyse der Zellen. An Tag drei wurde die Durchführung wiederholt. Ermittelte Daten wurden auf unstimulierte Konditionen an Tag 0 normalisiert.
eine wiederholte durchflusszytometrische Analyse der Zellen. An Tag drei wurde die Durchführung wiederholt. Ermittelte Daten wurden auf unstimulierte Konditionen an Tag 0 normalisiert.