RNA-Sequenzierung

3.12.1 Sequenzierung von Volllängentranskripten

Für die Sequenzierung von Volllängentranskripten wurden 2µg Gesamt-RNA aus den je-weiligen RNA-Isolaten eingesetzt. Für die Sequenzierung von mRNA wurde die Ribosomale RNA mittels „Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Bacteria)“ (Epicentre) nach Herstellerangaben abgereinigt. Anschließend wurde die mRNA mittels „RNA MinElute“-Säulen (Qiagen) aufge-reinigt und die RNA-Qualität mittels „Agilent RNA Pico 6000 Kit“ und dem „Agilent 2100 Bioanalyzer“ (Agilent Technologies) überprüft. Die mRNA-Fragmentierung, reverse Transkrip-tion zu cDNA, Adenylierung von 3’-Enden, AdapterligaTranskrip-tion und PCR-AmplifikaTranskrip-tion wurden nach Anleitung des „TrueSeq Stranded mRNA library“ Protokolls (Illumina) durchgeführt.

Vor derpaired-endSequenzierung der cDNA auf einer Illumina MiSeq bzw. HiSeq Maschine wurde die cDNA-Qualität mit dem „Agilent High Sensitivity DNA Kit“ und dem „Agilent 2100 Bioanalyzer“ (Agilent Technologies) überprüft.

Prinzip der Illumina RNA-Sequenzierung

Das Prinzip der RNA-Seqzenzierung von Volllängentranskripten nach Illumina basiert auf drei Schritten: RNA-Fragmentierung, reverse Transkription der RNA in eine cDNA-Bibliothek und der cDNA-Sequenzierung durch Synthese (sequencing by synthesis) (Illumina, 2017).

Die aus den Zellen isolierte RNA wird zunächst von stabilen RNAs, wie rRNA, befreit, da diese meist nicht die zu untersuchenden Transkripte darstellen, aber gleichzeitig ca. 95 % der Gesamt-RNA einer Zelle ausmachen (Peanoet al., 2013). Die Abreicherung der rRNA basiert auf der komplementären Bindung von zur rRNA komplementären Sequenzen, die auf magnetischen Kügelchen (beads) immobilisiert sind. Anschließend wird die verbliebene RNA chemisch Fragmentiert, da kürzere Fragmente geringere Sekundärstrukturen aufweisen und so später eine gleichmäßigere Read-Abdeckung in der Sequenzierung gewährleistet wird. Die reverse Transkription zu cDNA erfolgt über degenerierte Hexamer-Primer (random hexamer primers). Bei strangspezifischen cDNA-Bibliotheken wird für die Zweitstrangsynthese dUTP anstelle von dTTP eingesetzt. Das Vorhandensein von dUTP im Gegenstrang dämpft (quenching) die Amplifikation des Gegenstrangs in der späteren PCR, da die Polymerase nicht über dieses Nukleotid hinaus amplifizieren kann. Über das Anbringen eines zusätzlichen Adenosinrests an die 3’-Enden derblunt endund doppelsträngigen cDNA werden Chimären

bei der Adapter-Ligation verhindert, da die Adapter ein überhängenden Thyminrest aufweisen.

Die Adapter enthalten Sequenzen für die spätere Bindung der cDNA an dieflow-cell. Außerdem enthalten die Adapter Index-Sequenzen, sodass verschiedene cDNA-Bibliotheken parallel auf einer Sequenziermaschine sequenziert werden können (multiplexing). Im letzten Schritt der Vorbereitung der cBibliothek wird eine PCR-Amplifikation durchgeführt, die DNA-Fragmente, die die Adaptersequenzen an beiden Enden besitzen, spezifisch vervielfältigt.

Durch die PCR wird auch die für die Sequenzierung nötige Menge an DNA bereitgestellt (Illumina, 2017).

Für die Sequenzierung mittels Synthese (sequencing by synthesis) werden die cDNA-Frag-mente der cDNA-Bibliothek an über die Adaptersequenzen an auf derflow-cellimmobilisierte komplementäre DNA-Sequenzen hybridisiert. Über sogenanntebridge amplificationwerden lokal Gruppen (cluster) aus identischen cDNA-Fragmenten generiert, um das Signal in der anschließenden Polymerase-Reaktion zu verstärken. Die eigentliche Sequenzierung erfolgt durch Inkorporation von Fluoreszenz-markierten Nukleotiden, die bei Inkorporation ein für jede Base spezifisches Farbsignal abgeben. Diese Farbsignale werden über eine Kamera in ein digitales Bild derflow-cellumgewandelt, wobei jede Base (A, C, ToderG) ein spezifisches Farbsignal erzeugt. Über Zyklen aus Zugabe einzelner Nukleotide und anschließendem Spülen kann die Sequenz der cDNA-Fragmente über die zeitliche Aufnahme der Farbsignale ermittelt werden. Die Anzahl der Zyklen entspricht der Read-Länge (Illumina, 2017).

Nach der erfolgten Sequenzierung liegen die Sequenzen der cDNA-Fragmente in Form von Reads vor. Allerdings umfassen die Sequenzen der Reads nur die äußeren Enden der cDNA-Fragmente, da die Polymerase-Reaktion nicht über die volle Zahl an nötigen Zyklen qualitativ konstant bleibt. Aktuell sind Readlängen von 75 nt bei cDNA möglich. Je nach Sequenzierungsmethode werdensingle-endoderpaired-endReads erzeugt.Single-endReads stammen nur von einem Ende des cDNA-Fragments, währendpaired-endReads von beiden Enden des cDNA-Fragments stammen (Illumina, 2017). Über die Kenntnis beider Enden der cDNA-Fragmente, können die weitergehende Analysen durchgeführt werden, da sie mehr Informationen enthalten, alssingle-endReads. Von dieser Eigenschaft vonpaired-endReads wurde in dieser Arbeit mehrfach Gebrauch gemacht.

Die erhaltenen Reads werden gewöhnlich im Anschluss gegen eine genomische Referenzse-quenz gemappt bzw. aligniert, um darauf aufbauende Analysen durchzuführen.

3.12.2 Sequenzierung von ribosomaler RNA

Die Sequenzierung von ribosomaler RNA wurde analog zur oben beschriebenen Sequenzierung von Volllängentranskripten durchgeführt. Allerdings wurde auf eine vorherige Abreicherung

der rRNA mittels „Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Bacteria)“ (Epicentre) verzichtet. Aufgrund der hohen Abundanz von rRNA in bakteriellen Zellen, wurde wesentlich weniger RNA für die Erstellung der cDNA-Bibliotheken eingesetzt. Eine Menge von 300 ng RNA war ausreichend.

3.12.3 Sequenzierung der 5’-Enden von Primärtranskripten

Für die Sequenzierung der 5’-Enden von Primärtranskripten nach Pfeifer-Sancaret al.(2013) wurden 2x 5µg Gesamt-RNA aus den jeweiligen RNA-Isolation eingesetzt.

Wie bei der Sequenzierung von Volllängentranskripten wird die rRNA mittels „Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Bacteria)“ (Epicentre) aus der Gesamt-RNA abgereinigt. Anschließend wird die mRNA über Nacht mit Ethanol, Glycogen und Natriumacetat bei -80 °C präzi-pitiert. Am Folgetag wird die RNA auf erfolgreiche Abreicherung der rRNA mit „Agilent RNA Pico 6000 Kit“ und dem „Agilent 2100 Bioanalyzer“ (Agilent Technologies) kontrol-liert, anschließend chemisch fragmentiert, über „RNA MinElute“-Säulen (Qiagen) gerei-nigt und nicht-primäre Transkripte (Transkripte mit 5’-Monophosphat oder 5’-Diphosphat) über die Terminator-Exonuklease (TEN) (Epicentre) abgebaut. Anschließend wird die TEN duch Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-(PCI)-Extraktion entfernt und die RNA mit „RNA MinElute“-Säulen (Qiagen) aufgereinigt. Die Triphosphate an den 5’-Enden von Primärtran-skripten werden mittels RNA Pyrophosphohydrolase (RPP) (Epicentre) zu Monophosphaten umgewandelt. Es erfolgt erneut eine Ethanol-Präzipitation der RNA und im Anschluss die RNA-Adapter-Ligation mittels T4 Ligase (NEB). Überschüssiger Adapter wird durch Aufreini-gung mit „RNA MinElute“-Säulen (Qiagen) entfernt. Für die reverse Transkription durch den Schlaufen-Adapter (loop adapter) muss dieser zunächst die korrekte Struktur annehmen. Dazu wird der Schlaufen-Adapter in einem Thermocycler zunächst aufgekocht und anschließend mit einer Geschwindigkeit von 1 °C pro 10 s auf 25 °C abgekühlt. Die reverse Transkription über den Schlaufen-Adapter wird von der Superscript II RT (Thermo Fischer) katalysiert und die RNA danach aus dem RNA-DNA-Hybrid über Verdau mit RNase H (Thermo Fischer) entfernt. Anschließend erfolgt die Zweitstrangsynthese und Amplifikation mittels PCR. Dazu werden Primer eingesetzt, die für die Illumina Sequenzierung kompatible Enden aufweisen und auf den ligierten RNA- und Schlaufen-Adapter binden. Die in dieser Arbeit verwendeten Primer sind in Tabelle 3.21 aufgeführt. Die PCR erfolgt über die Phusion Polymerase (Thermo Fischer). Nach der PCR werden die PCR-Produkte mit „Agencourt AMPure XP Beads“ aus dem „SMARTer Stranded RNA Kit“ (Beckman Coulter) aufgereinigt. Anschließend wird die Qualität der erstellten cDNA-Bibliothek mit dem „Agilent High Sensitivity DNA Kit“ und dem

„Agilent 2100 Bioanalyzer“ (Agilent Technologies) überprüft. Um verbliebene Primer oder Adapter zu entfernen werden die PCR-Produkte mit Größen zwischen 150 – 1.000 bp nach

der Aufreinigung präparativ aus einem Agarosegel mit „Ultra Low Range Agarose“ (Bio-Rad) ausgeschnitten und die cDNA-Bibliothek anschließend mit dem Illumina MiSeq oder HiSeq 1500 sequenziert.

Das vollständige Protokoll ist in Pfeifer-Sancaret al. (2013) detailliert beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden kleine Anpassungen am Protokoll vorgenommen: Nicht-primäre Transkripte wurden mittels Terminator-Exonuklease (Epicentre) bei 30 °C für 60 min und anschließend 42 °C für 30 min verdaut. Die Adapterligation am 5’-Ende wurde für 60 min bei 30 °C mit 1µL 60µM Adapter durchgeführt. Nach der Amplifikation der cDNA wur-den die beiwur-den cDNA-Bibliotheken mittels Gelelektrophorese aufgereinigt und nach Größe selektioniert. Es wurden nur Fragmente mit einer Größe zwischen 100 und 1.000 bp aus dem Gel ausgeschnitten. Die untere Grenze von 100 bp wurde gewählt, um Adapterdimere abzureinigen. Da zwei Adapter, mit einer Gesamtlänge von 66 nt, für die Erstellung der cDNA-Bibliotheken benutzt wurden, wurden nur Transkripte mit einer Länge kleiner als 44 nt nicht sequenziert. Die Sequenzierung der 5’-Enden von Primärtranskripten erfolgt imsingle readModus mit einer Readlänge von 75 nt. Die verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 3.21 aufgeführt.

Tabelle 3.21:Oligonukleotide für die RNA-Sequenzierung. Das Zeichen←-zeigt einen Zeilenumbruch an.

Oligonukleotid Sequenz (5‘ - 3‘)

RNA-Adapter (aus RNA) CCCUACACGACGCUCUUCCGAUCGAG

Schlaufen-Adapter AGATCGGAAGAGAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNN

Amplifikations-Primer 1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC_← -GCTCTTCCGATCGAG

Amplifikations-Primer 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAG_← -ACGTGTGCTCTTCCGATCT

3.12.4 Sequenzierung von RNase-Schnittstellen mittels

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode zur Identifizierung von RNase-Schnittstellen mittels RNA-Sequenzierung entwickelt. Die Methode wurde mitRNase-Assaybenannt und wird inin vivoundin vitro RNase-Assayunterschieden. Beide Typen derRNase-Assaysbasieren auf der Markierung von RNase-Schnittstellen durch Ligation eines RNA-Adapters. Für die Identifizierung der Schnittstellen wird eine behandelte und eine unbehandelte Probe (Kontrol-le) benötigt. Beiin vivo RNase-Assayist die behandelte Probe die RNA des Wildtyps, da dieser alle RNasen besitzt und entsprechend geschnittene Transkripte aufweist. Die Kontrolle ist die RNA einer RNase-defizienten Mutante (Deletions- oderknock down-Mutante), da dieser RNA

die Schnittstellen der zu untersuchenden RNase fehlen. Beiin vitro RNase-Assaywird nur die RNA einer RNase-Mutante eingesetzt, diese aber einmal mit und einmal ohne (Kontrolle) der zu untersuchenden RNasein vitrobehandelt. Dazu muss zum einen die zu untersuchende RNase in dem Organismus deletierbar sein als auch aufgereinigt werden können. Über den Vergleich der behandelten Probe mit der Kontrolle werden die RNase-Schnittstellen ermit-telt. Die dazu nötigen bioinformatischen Prozesse werden weiter unten in einem separaten Abschnitt aufgeführt.

Im Folgenden wird der Ablauf derRNase-Assaysbeschrieben. Auf der dieser Arbeit beilie-genden Daten-CD befinden sich die Protokolle mit detaillierten Angaben zur Durchführung.

Hintergründe zur Entwicklung, ein grafisches Ablaufschema, den erzielten Ergebnissen und der Ergebnisdiskussion werden in den nachfolgenden Kapiteln beschrieben.

Der in vivo RNase-Assay

Für denin vivo RNase-Assaywird die RNA des Wildtyps (als Kontrolle), sowie die RNA einer RNase-defizienten Mutante benötigt. Beide RNA-Proben sind separat zu behandeln und dürfen nicht vermischt werden. Derin vivo RNase-Assaybeginnt mit der Abreicherung der rRNA aus der isolierten Gesamt-RNA mittels „Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Bacteria)“ (Epicentre). Falls Schnittstellen innerhalb der rRNA untersucht werden sollen, wird die rRNA-Abreicherung übersprungen. Nach erfolgter rRNA-Abreicherung wird die verbliebene RNA über Nacht mit Ethanol präzipitiert, am nächsten Tag gereinigt und die rRNA-Abreicherung mit „Agilent RNA Pico 6000 Kit“ und dem „Agilent 2100 Bioanalyzer“ (Agilent Technologies) überprüft.

Anschließend erfolgt der wichtigste Schritt: das Markieren der RNase-Schnittstellen durch Ligation eines RNA-Adapters. Dazu werden etwaige Sekundärstrukturen zunächst über Hitze denaturiert und die Probe direkt auf Eis gestellt. Anschließend wird die Ligation mit dem RNA-Adapter (Tabelle 3.21) durchgeführt. Anschließend wird überschüssiger RNA-Adapter über „RNA MinElute“-Säulen (Qiagen) entfernt, die RNA chemisch fragmentiert und erneut über „RNA MinElute“-Säulen (Qiagen) aufgereinigt.

Die folgenden Schritte sind mit der Methode zur Sequenzierung von Primärtranskripten (Pfeifer-Sancaret al., 2013) ab dem Schritt zur Vorbereitung des Schlaufen-Adapters identisch.

Der in vitro RNase-Assay

Für denin vitro RNase-Assaywird die RNA einer RNase-defizienten Mutante benötigt, da das Einbringen der RNase-Schnittstellenin vitromit aufgereinigter RNase erfolgt. Bei der aufgereinigten RNasen muss es sich um die selbe RNase handeln, dessen Gen in der Mutante deletiert wurde. Die RNA der RNase-defizienten Mutante wird in einer Probe mit der

aufgerei-nigten RNase behandelt und einmal unbehandelt (als Kontrolle) weiterverarbeitet. Im ersten Schritt desin vitro RNase-Assayswird die rRNA mit „Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Bacteria)“

(Epicentre) abgereinigt, mit Ethanol präzipitiert und die Abereicherung mittels „Agilent RNA Pico 6000 Kit“ und dem „Agilent 2100 Bioanalyzer“ (Agilent Technologies) kontrolliert. Falls RNase-Schnittstellen in der rRNA untersucht werden sollen, wird die rRNA-Abreicherung übersprungen.

Anschließend wird die RNA der RNase-defizienten Mutante mit der jeweiligen (aufgereinig-ten) RNase behandelt. Die Inkubationsdauer ist abhängig von der RNase-Aktivität und sollte vorher ermittelt werden. Als Kontrolle dient RNA die nicht mit der RNase behandelt wurde.

Um die Vergleichbarkeit zwischen behandelter und unbehandelter Probe zu erhöhen, sollte die unbehandelte RNA allerdings mit möglichst ähnlichen Bedingungen (Puffer, Temperatur, Dauer) inkubiert werden. Anschließend wird die RNase der behandelten Probe mittels PCI-Reagenz (Carl Roth) entfernt und die RNA mit Ethanol präzipitiert. Für die Vergleichbarkeit wird die unbehandelte Probe ebenfalls mit PCI-Reagenz behandelt und mit Ethanol präzipi-tiert. Falls möglich kann der Effekt der RNase-Behandlung bereits im „Agilent RNA Pico 6000 Kit“ und dem „Agilent 2100 Bioanalyzer“ (Agilent Technologies) beobachtet werden.

Im Folgenden werden in beiden Proben die Schnittstellen über Ligation eines RNA-Adapters (Tabelle 3.21) markiert. Alle Schritte nach der Adapter-Ligation sind mit denen desin vivo

RNase-Assaysidentisch.