3.6.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine Methode zur Ver-vielfältigung von DNA anhand einer Vorlage (template) (Sambrooket al., 2001). Im ersten Schritt wird die DNA-Vorlage (z. B. das bakterielle Chromosom) mittels Hitze in Einzelstränge
denaturiert. Anschließend lagern sich spezifisch Primer (Oligonukleotide) über komplemen-täre Basenpaarung an die DNA-Einzelstränge an. Eine DNA-Polymerase beginnt hinter den Primern den DNA-Einzelstrang mit dem komplementären Einbau von Nukleotiden. Diese drei Schritte werden in mehreren Zyklen wiederholt, so dass das DNA-Fragment zwischen den beiden Primern exponentiell vervielfältigt wird.
Die für die PCR benötigten Primer werden mit Hilfe von speziellen Programmen entwor-fen. Dabei sind die Schmelztemperatur und der GC-Gehalt die wichtigsten zu beachtenden Parameter und sollten für beide Primer nach Möglichkeit ähnlich sein.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden alle PCRs für Klonierungen von DNA-Fragmenten mit der „KOD Hot Start“ DNA-Polymerase (Novagen/Toyobo) durchgeführt, da diese eine gute Fehlerkorrektur (proof reading) besitzt und auch bei anspruchsvollen DNA-Vorlagen gute Ergebnisse liefert.
Für einfache PCRs die nur zum Längennachweis in der Agarose-Gelelektrophorese dienen, wurde die günstigere DNA-Polymerase „BioTAQ“ (Bioline) verwendet. Diese besitzt nur eingeschränkte Fehlerkorrekturfähigkeiten.
Abhängig von der zu amplifizierenden DNA werden unterschiedliche PCR-Protokolle durch-geführt, sodass hier nicht die Reaktionsbedingungen für jede PCR aufgeführt werden können.
Die grundlegenden PCR-Reaktionsbedingungen für beide DNA-Polymerasen sind in Tabellen 3.13 und 3.14 aufgeführt.
Tabelle 3.13:Pipettierschema für PCR-Reaktionen. Für die Amplifikation von chromosomaler DNA wurden 100 ng DNA, für die Amplifikation von Plasmid-DNA maximal 10 ng DNA als Vorlage eingesetzt.
KOD-PCR Volumen[µL] BioTAQ-PCR Volumen[µL]
„KOD Hot Start Buffer“ (10-fach) 5 „NH4-Reaction-Buffer“ (10-fach) 5
Magnesiumsulfat (25 mM) 3 Magnesiumchlorid (50 mM) 2,5
dNTP-Mix (2,5 mM) 5 dNTP-Mix (2,5 mM) 5
KOD Hot Start Polymerase (1 U/µL) 1 BioTaq-Polymerase (1 U/µL) 0,5
Primer 1 (10µM) 1,5 Primer 1 (10µM) 1,5
Primer 2 (10µM) 1,5 Primer 2 (10µM) 1,5
DNA-Vorlage 1 DNA-Vorlage 1
Wasser 32 Wasser 33
Gesamtvolumen 50 Gesamtvolumen 50
Tabelle 3.14:PCR-Programme für die „KOD Hot Start“ und BioTAQ DNA-Polymerasen. Abhängig von den verwendeten Primern und der Länge des zu amplifizierenden DNA-Fragments müssen die Annealing-Temperatur sowie die Elongationszeit angepasst werden.
# Schritt Temperatur[°C] Zeit
1 Initiale Denaturierung 95 2 min
2 Denaturierung 95 20 s
3 Annealing 55 10 s
4 Elongation (10 – 25 s/kbp) 70 X
20 – 40 Zyklen der Schritte 2 bis 4
5 Finale Elongation 70 5 min
3.6.2 Isolierung von DNA
Zur Isolierung von chromosomaler oder plasmidärer DNA aus Zellen wurde das Kit „GeneJET Plasmid Midiprep Kit“ (Thermo Fisher Scientific) nach Anleitung verwendet. Für die DNA-Isolierung ausC. glutamicumwurde der Zellaufschluss angepasst, da die Zellen nur schwer chemisch aufgeschlossen werden können.C. glutamicum-Zellen wurden von einer frischen Festmedium-Petrischale in Resuspensionspuffer des Kits resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen mittels Glaskügelchen (0,1 mm Durchmesser) in der Kugelmühle Ribolyzer (Peqlab) 3x für 30 s bei 6.500 rpm aufgeschlossen und die Glaskügelchen danach durch Zentrifugation (5 min, 13.000 x g) pelletiert. Der Überstand konnte im Anschluss wieder nach der
Anlei-tung des Kits weiterverarbeitet werden. Die anschließende DNA-Konzentrationsbestimmung erfolgte mittels NanoDrop (Peqlab).
3.6.3 Agarose-Gelelektrophorese
Die Auftrennung von DNA anhand ihrer Größe erfolgte über Agarose-Gelelektrophorese mit einer Agarosekonzentration von 0,7 bis 2,0 %, abhängig von der zu trennenden DNA. Die Auftrennung im Gel erfolgte für ca. 30 min bei 80 V
3.6.4 DNA-Aufreinigung und -Quantifizierung
DNA aus PCR-Ansätzen und aus Agarosegelen ausgeschnittene DNA-Fragmente wurden mit Hilfe des Kits „NucleoSpin Gel and PCR Clean-up“ (Macherey-Nagel) nach Anleitung aufgereinigt. Die anschließende DNA-Konzentrationsbestimmung erfolgte mittels NanoDrop (Peqlab).
3.6.5 Klonierung mittels Gibson-Assembly
DNA-Fragmente wurden mittels Gibson-Assembly(Gibsonet al., 2009) kloniert. Die Methode basiert auf dem isothermalen Zusammenbau von DNA-Fragmenten mit komplementären Enden. In einem Ansatz befinden sich die T5-Exonuklase, eine DNA-Polymerase, sowie eine DNA-Ligase. Die T5-Exonuklease verdaut die 5’-Enden der DNA-Fragmente, sodass die kom-plementären Enden an einander binden können. Diese komkom-plementären Enden dienen der DNA-Polymerase als Primer um die, durch die Exonuklease entstandenen, Lücken aufzufüllen.
Die Einzelstrangbrüche (nicks) werden durch die DNA-Ligase aufgefüllt.
Das Gibson-Assemblyeignet sich für die Klonierung von mehreren DNA-Fragmenten in Plasmide. Ein typisches Protokoll zum klonieren von einem DNA-Fragment in ein Plasmid ist im Folgenden aufgeführt: Es wurden zwei Primer P1 und P2 entworfen, die an die Enden des zu klonierenden Fragments binden. Zwei weitere Primer P3 und P4 wurden entworfen, die an der Stelle im Plasmid binden, an der das DNA-Fragment eingefügt werden soll. Diese Primer müssen in entgegengesetzte Richtungen zeigen. An die Primer P1 und P2 wurden Überhänge angefügt, die komplementär zum Einfügeort auf dem Plasmid sind. Es wurde analog für Primer P3 und P4 vorgegangen. Mit Hilfe von PCR wurden das DNA-Fragment mit den Primern P1 und P2 und das Plasmid mit den Primern P3 und P4 amplifiziert. Falls Fehlbanden neben dem gewünschten PCR-Produkt erkennbar waren, wurden die jeweiligen Produkte aus dem Agarosegel ausgeschnitten und aufgereinigt. Das PCR-Produkt des DNA-Fragments wurde mit dem des amplifizierten Plasmids in einem Molverhältnis von 1:1 oder 2:1 gemischt und mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 5µL aufgefüllt. Zu den gemischten PCR-Produkten wurden 15µL Gibson-Assembly Master Mixhinzugefügt (enthält Exonuklease, Polymerase und Ligase, sowie dNTPs und Kofaktoren). Der Reaktionsansatz wurde für 60 min bei 50 °C inkubiert und anschließend in kompetente Zellen transformiert.
3.6.6 Herstellung von kompetenten Zellen
Kompetente Zellen werden für die Transformation von Plasmiden benötigt. FürE. coliund C. glutamicumwurden jeweils unterschiedliche Protokolle verwendet. Die benötigten Lösun-gen und Puffer sind in Tabelle 3.15 aufgeführt.
Tabelle 3.15:Puffer und Lösungen für die Herstellung von kompetenten Zellen.
TB-Puffer
PIPES 10 mM
Calciumchlorid 15 mM
Kaliumchlorid 250 mM
Auf ca. 800 mL auffüllen, pH auf 6,7 einstellen (mit KOH oder HCl)
Manganchlord 55 mM
In Wasser lösen, sterilfiltrieren und bei 4 °C lagern.
TG-Puffer
Tris-HCl 1 mM
Glycerin (auf pH 7,5 einstellen) 10 %
Glycerin 10 %ig
Glycerin (auf pH 7,0 einstellen) 10 %
Herstellung von ultrakompetenten E. coli-Zellen für Hitzeschocktransformation Herstellung der ultrakompetenten Ecolis nach einer modifizierten Calciumchlorid-Methode zur Hitzeschocktransformation nach Inoueet al.(1990).
Als Vorkultur wurden 10 mL LB-Medium in einem 100 mL-Schüttelkolben mit 50µL einer Glycerinkultur des gewünschten Stammes beimpft und bei 180 rpm und 37 °C über Nacht inkubiert. Für die Hauptkultur wurden 250 mL SOB-Medium in einem 1 L-Kolben mit 2,5 mL der Vorkultur beimpft und bei 180 rpm und 19 °C bis OD600=0,5 inkubiert (Dauer 24 - 36 h).
Anschließend wurde der Kolben 10 min im Eiswasser abgekühlt. Da alle weiteren Schritte bei 4 °C durchgeführt wurden, wurden die Lösungen und die Zentrifuge ebenfalls vorgekühlt. Die Hauptkultur wurde in fünf 50 mL-Zentrifugengefäßen umgefüllt und bei 5.000 g für 5 min pelletiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Zellpellet wurde mit je 20 mL eiskaltem TB-Puffer resuspendiert und 10 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen erneut bei 5.000 g für 5 min zentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgegossen. Das Zellpellet wurde in 6 mL eiskaltem TB-Puffer resuspendiert mit 420µL DMSO (Dimethylsulfoxid) gemischt und sofort gevortext. Die nun kompetenten Zellen werden in 150µL Aliquots abgefüllt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.
Herstellung von elektrokompetenten C. glutamicum-Zellen
ElektrokompetenteC. glutamicum-Zellen wurden mit einem modifizierten Protokoll nach Kirchner und Tauch (2003) erstellt.
Es wurde eineC. glutamicumGlycerinkultur frisch auf einer CASO-Platte mit Nalidixin ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Als Vorkultur wurde eine Einzelkolonie in 50 ml CASO+S-Medium (CASO mit 91 g/L Sorbitol) überimpft und über Nacht bei 30 °C bei 300 rpm inkubiert. Die Hauptkulur wurde mit einer OD600 0,5 in 2x 250 ml CASO+ S-Medium (auf 30 °C vorgewärmt) angesetzt und bei 30 °C bis zu einer OD600 von ca. 2,0 bis 2,5 angezogen (Dauer ca. 2 - 2,5 h). Anschließend wurde der Kolben ca. 15 min auf Eis gekühlt. Da alle weiteren Schritte bei 4 °C durchgeführt wurden, wurden die Lösungen und die Zentrifuge ebenfalls vorgekühlt. Es wurden 500 ml Kultur in Zentrifugenbecher transferiert und diese für 8 min bei 4.500 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 100 ml eiskaltem TG-Puffer resuspendiert und 7 min bei 4.500 rpm zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde anschließend in 5 ml kaltem 10 %igem Glycerin resuspendiert und 7 min bei 4.500 rpm zentrifugiert. Die nun kompetenten Zellen wurden in Aliquots von 150µL in vorgekühlte Eppis überführt und bei -80 °C eingefroren.
3.6.7 Transformation von DNA
Die Transformation von DNA in Zellen erfolgt über Hitzeschock oder Elektroporation. Für die Hitzeschocktransformation vonE. coliwurde auf das Protokoll von Sambrooket al.(2001) zurückgegriffen: Es wurden 100µL kompetenteE. coli-Zellen mit maximal 20 µL der zu transformierenden DNA vermischt und für 2 min auf Eis gestellt. Anschließend wurde der Ansatz bei 42 °C für 30 s im Wasserbad erhitzt und direkt im Anschluss für 1 min auf Eis gestellt. Für die Regeneration der transformierten Zellen wurden diese in 1 mL SOC-Medium resuspendiert und für 45 bis 60 min bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Im Anschluss wurden die transformierten Zellen auf Selektionsmedien ausgestrichen.
FürC. glutamicum-Zellen eignet sich die Hitzeschocktransformation nicht. Daher wurde hier die Transformation über Elektroporation nach Tauchet al.(2002) durchgeführt. Dazu wurden die zu transformierenden elektrokompetenten Zellen zunächst auf Eis aufgetaut und anschließend mit 0,1 bis 10,0µg DNA in einer Elektroküvette vermischt. Die Elektrotrans-formation wurde bei eine Kapazität von 25µF, einem Parallelwiderstand von 200Ωund einer Spannung von 2,5 kV in einem Elektroporator von BioRad durchgeführt. Anschließend wurden die transformierten Zellen in auf 46 °C vorgewärmtes 4 mL BHIS-Medium für 6 min bei 46 °C inkubiert und danach für 50 min in einem Rotationsschüttler bei 30 °C regeneriert.
Die Zellen wurden im Anschluss auf Selektionsmedien ausgestrichen.