4.2 Rho-abhängige Transkriptionstermination in Corynebacterium glutamicum
4.2.13 Überexpression des Typ IVb Pilus-Gen-Clusters führt zu höherer Trans-
In der∆rho-Mutante sind neben dem für den Typ IVb Pilus kodierendentad-Cluster (cg0362 biscg0369) auch Gene, die für einen putativen DNA-Rezeptor (cg2578) und eine putative DNA-Pore zur DNA-Aufnahme (cg2577) kodieren, stark differenziell transkribiert. Somit wären alle oder zumindest ein Großteil der theoretisch benötigten Komponenten für ein DNA-Aufnahmesystem zur Ausbildung von Kompetenz in der∆rho-Mutante exprimiert. Nur wenige Bakterien sind als natürlich kompetent bekannt (Johnstonet al., 2014). FürC. glutamicumist natürliche Kompetenz nicht beschrieben. Aufgrund der in der∆rho-Mutante stark differenziell transkribierten Gene, liegt der Schluss nahe, dass die∆rho-Mutante besser zu transformieren sein könnte als der Wildtyp. Es wurde daher die Transformationsfrequenzen des Wildtyps und der∆rho-Mutante bestimmt. Außerdem wurde der StammtadOE (basierend auf dem Wildtyp) konstruiert. Der Stamm trägt dastad-Cluster auf dem induzierbaren Plasmid pEC-XC99E mit Ptrc-Promotor anstelle des nativen Promotors und der nativen 5’-UTR voncg0362. Auch von diesem Stamm wurde die Transformationsfrequenz bestimmt. Darüber hinaus wurde mittels qRT-PCR die relative Transkriptmenge der Genecg0362undcg0365im Wildtyp und imtadOE-Stamm bestimmt.
Das Wachstum destadOE-Stamms bricht nach Induktion mit IPTG ein, während das Wachs-tum des uninduziertentadOE-Stamms dem des Wildtyps ähnelt (Abbildung 4.24A). Durch die Induktion steigt die Transkriptmenge um den Faktor 100 an (Abbildung 4.24B). Die starke Überexpression destad-Clusters hat vermutlich negative Auswirkungen auf die Mem-branintegrität der Zelle hat und somit das Zellwachstum stört. Aus diesem Grund wurde die Transformationsfrequenz nur für den uninduziertentadOE Stamm bestimmt.
Die Transformationsfrequenz der∆rho-Mutante ist etwa 50 % höher als die des Wildtyps (Abbildung 4.24C). Die Transformationsfrequenz des uninduziertentadOE Stamms übertrifft die der∆rho-Mutante und ist ca. 225 % höher als die des Wildtyps. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die Funktion des vomtad-Cluster kodierten Typ IVb Pilus inC. glutamicumdie DNA-Aufnahme der Zelle ist. Allerdings wächst dertadOE Stamm schlechter als der Wildtyp. Die Induktion der Expression destad-Clusters führt zu einem Wachstumseinbruch (Abbildung 4.24A). Aufgrund des schlechteren Wachstums des induziertentadOE Stamms wurden die Transformationsfrequenzen für den nicht induziertentadOE Stamm bestimmt.
Mit einem Rasterkraftmikroskop wurde untersucht, ob Pilus-Strukturen auf der Zelloberflä-che der∆rho-Mutante erkennbar sind. Dabei konnte kein Unterschied in der Zelloberfläche der∆rho-Mutante von der des Wildtyps beobachtet werden (Abbildung A.9). Der ebenfalls als DNA-Aufnahmesystem charakterisierte Typ IVb Pilus inMicrococcus luteuskonnte, vermutlich
rho tadOE
Transformatonsfrequenz [-]
-Mutante tadOE
tadOE tadOE ind. B
A C
cg0362 cg0365
Abbildung 4.24:Charakterisierung destad-Clusters inC. glutamicum. (A) Wachstumsvergleich des tadOE Stamms uninduziert (orange) und induziert (gelb) im Vergleich zum Wildtyp mit Leerplasmid (blau). Induziert wurde nach 6 Stunden mit 0,4 mM IPTG (Pfeil). (B) Relative Transkriptmenge der zwei tad-Cluster-Gene cg0362 undcg0365 nach Induktion ermittelt mit qRT-PCR. (C) Trans-formationsfrequenzen des uninduziertentadOE Stamms im Vergleich zur∆rho-Mutante und dem Wildtyp.
aufgrund der geringen Größe, mikroskopisch ebenfalls nicht nachgewiesen werden (Angelov et al., 2015). Es wird daher vermutet, dass der Typ IVb Pilus inC. glutamicumebenfalls sehr kurz, aber dennoch funktional ist.
Über DNA-Aufnahmesysteme kann potenziell Fremd-DNA in die Zelle gelangen. Da dieses DNA-Aufnahmesystem in der∆rho-Mutante stark differenziell transkribiert wird, zeigt dies wiederum, dass der Rho-Faktor neben der Transkripttermination auch eine ArtSilencervon Fremd-DNA ist. Dies passt sehr gut zu den weiter oben beschriebenen anderen, ebenfalls in der∆rho-Mutante differenziell transkribierten Genen aus potentiell zellfremden Quellen, wie IS-Elementen und Prophagen-Genen
4.3 RNA-Degradation durch die RNasen E/G und J in C. glutamicum
Die beiden vorherigen Kapitel des Ergebnisteils behandelten die Analyse der RNA ausgehend von den Transkriptenden. So wurden im ersten Kapitel mit Hilfe der 5’-Transkriptenden unter anderem Promotoren und 5’-UTRs inC. diphtheriaecharakterisiert. Im zweiten Kapitel wurde auf die Transkripttermination von Rho-abhängig terminierten Transkripten inC. glutamicum eingegangen und diese untersucht. Es wurden die Prozesse der Transkription von der Bildung bis zur Termination behandelt. Das folgende Kapitel beschäftigt sich mit der Prozessierung bzw. dem Abbau von Transkripten durch RNasen. Hierzu wurde der Einfluss der RNasen E/G und J auf das Transkriptom vonC. glutamicumanalysiert und mit einer eigens entwickelten Methode die RNase-Schnittstellen identifiziert.
4.3.1 Vergleich von RNase E/G und RNase J mit Homologen der Modellorganismen
Die zu untersuchenden RNasen E/G und J ausC. glutamicumwurden bioinformatisch mit den Homologen der ModellorganismenE. coli bzw.B. subtilissowie den Actinobakterien S. coelicolorundM. tuberculosisauf Ebene der Aminosäuresequenzen verglichen.
Die RNasen E/G besitzt einen zusätzlichen N-terminale Bereiche
Die RNase E/G ausC. glutamicum(Cg.RNase E/G) ist ein 1.021 Aminosäuren langes Pro-tein. Obwohl die Längen von E. coli RNase E (Ec.RNase E) mit 1.061 Aminosäuren und Cg.RNase E/G mit 1.021 Aminosäuren ähnlich sind, unterscheiden sich beide Proteine in der Lokalisation der katalytischen Domäne. Vor der katalytischen Domäne von Cg.RNase E/G befindet sich ein zusätzlicher N-terminaler Bereich, den weder Ec.RNase E noch Ec.RNase G besitzen (Abbildung 4.25A). Cg.RNase E/G besitzt dafür einen im Vergleich zu Ec.RNase E kürzeren C-terminalen Bereich. Die Funktion des zusätzlichen N-terminalen Bereichs ist unbekannt, da keine bekannten Domänen für diesen Bereich identifiziert wurden. Der zu-sätzliche N-terminale Bereich ist auch in den Homologen der ActinobakterienS. coelicolor (Sc.RNase ES) undM. tuberculosis(Mt.RNase E/G) vorhanden und dort noch länger als in C. glutamicum. Aufgrund des zusätzlichen N-terminalen Bereichs, ist die Ähnlichkeit von Cg.RNase E/G zu Ec.RNase G und Ec.RNase E mit 31 bis 33 % gering. Die höchste Ähnlichkeit besitzt Cg.RNase E/G zu Mt.RNase E/G mit 47 % (Tabelle 4.10).
Für RNase E und G ausE. coliwurden für die Funktion wichtige Motive (hier als M1 bis M5 bezeichnet) in der katalytischen S1-Domäne identifiziert (Schubertet al., 2004; Callaghan
E. coli RNase G E. coli RNase E C. glut. RNase E/G S. coe. RNase ES M. tub. RNase E/G
1 489
1 1061
1 1021
1 1340
1 953
KAAFLHA QVVKDPL KDPLGTK LGTKGARL ITLPSRY RHGFLPL QIDKEER KEERGNK RGNKGAAL ISLAGSY RNGVLYA QVSKDPL KDPLGHK LGHKGARL ISLAGRY RNGVLYA QVTKDPI KDPIGHK IGHKGARL VSLPGRY RNGVLYA QVSKDPV KDPVGHK VGHKGARL VSLAGRF M1 M2 M3 M4 M5
A B
C D
B. sub. RNase J1 B. sub. RNase J2 C. glut. RNase J S. coe. RNase J M. tub. RNase J
1 555
1 558
1 555
1 718
1 561
GIKFPED GIDYVIP GHEDHIGG MPIHGEY GLMHPEN GIDVVIP GHDENIGG IPVNGEY GVLFPSS GVDLILP GHEDHIGA MPVHGEW GVLFPEE GIDLILP GHEDHIGG MPVHGEW GVLFPGH GVDLILP GHEDHIGA MPVHGTW M1 M2 M3 M4
Abbildung 4.25:Vergleich der RNase E bzw. G und J-Homologe der Modellorganismen mitC. glutami-cum,S. coelicolorundM. tuberculosissowie deren charakteristischen Motiven. Längenvergleich von RNase E bzw. G (A) und J-Homologen (C); Vergleich der charakteristischen Motive für RNase E bzw.
G (B) und J (D). Wichtige Domänen sind in schwarz (katalytische S1-Domäne), grau (Metallo-β-Lactamase-Domäne) und hellgrau (β-CASP-Domäne) eingezeichnet. Wichtige Aminosäure-Reste in den charakteristischen Motiven (M1 - M5 bzw. M1 bis M4) sind in rot markiert und in fett gedruckt, wenn sie von den RNase G bzw. RNase J1 Homologen der Modellorganismen abweichen.
et al., 2005). Die Motive M2, M3 und M4 von Cg.RNase E/G sind identisch zu Ec.RNase G (Abbildung 4.25B). Anstelle eines Phenylalanins (F) im Motiv M1 besitzt Cg.RNase E/G ein Valin (V). Dieser Austausch befindet sich ebenfalls in den RNase E-Homologen vonS. coelicolor undM. tuberculosis. Da sowohl Phenylalanin als auch Valin unpolare Aminosäuren sind, wurde davon ausgegangen, dass dieser Aminosäureaustausch keinen wesentlichen Effekt auf die Eigenschaften der RNasen der gezeigten Actinobakterien hat. Motiv M5 von Cg.RNase E/G ist identisch zu dem aus Ec.RNase E. Cg.RNase E/G besitzt somit Motive die sowohl identisch zu Ec.RNase G (Motiv M1) als auch zu Ec.RNase E (Motiv M5) sind.
Vergleich der RNase J mit bekannten Homologen
C. glutamicumbesitzt im Gegensatz zuB. subtilis, in dem RNase J zuerst beschrieben wur-de, nur ein RNase J-Homolog. Im Allgemeinen wird RNase J in drei Domänen unterteilt:
einerβ-Lactamase-, einerβ-CASP-Domäne und einer C-terminalen Domäne (Li de la Sierra-Gallayet al., 2008). Cg.RNase J besitzt einen im Vergleich zuB. subtilisRNase J1 bzw. J2 (Bs.RNase J1 bzw. J2) um 136 Aminosäuren verlängerten N-terminalen Bereich (Abbildung 4.25C). Cg.RNase J ist somit ca. 22 % länger als die Homologe in den nahen Verwandten M. tuberculosisundS. coelicolor. Für den inC. glutamicumverlängerten N-terminalen Bereich
Tabelle 4.10:Globales Alignment der RNase E bzw. E/G und RNase J-Homologe der Modellorganis-men mit denen vonC. glutamicum,S. coelicolorundM. tuberculosis. Das Alignment wurde mittels Needleman-Wunsch-Algorithmus (Needleman und Wunsch, 1970) durchgeführt. Angegeben ist die Sequenzidentität und -ähnlichkeit in Prozent. Ec,E. coli; Cg,C. glutamicum; Sc,S. coelicolor; Mt, M. tuberculosis; Bs,B. subtilis.
RNase E/G
Homolog Ec. RNase G Ec. RNase E Cg. RNase E/G Sc. RNase ES Mt. RNase E
Ec.RNase G 100/100 16 / 24 25 / 31 13 / 20 18 / 27
Ec.RNase E – 100/100 25 / 33 17 / 25 15 / 25
Cg.RNase E/G – – 100/100 36 / 44 39 / 47
Sc.RNase ES – – – 100/100 32 / 41
Mt.RNase E – – – – 100/100
RNase J
Homolog Bs. RNase J1 Bs. RNase J2 Cg. RNase J Sc. RNase J Mt. RNase J
Bs.RNase J1 100/100 49 / 70 28 / 44 37 / 57 35 / 54
Bs.RNase J2 – 100/100 26 / 47 38 / 59 34 / 58
Cg.RNase J – – 100/100 41 / 55 44 / 57
Sc.RNase J – – – 100/100 55 / 71
Mt.RNase J – – – – 100/100
von RNase J wurden keine bekannten Motive oder Domänen identifiziert. Eine Aussage über die Funktion des zusätzlichen N-terminalen Bereichs ist somit nicht möglich.
Die größte Ähnlichkeit von 57 % besitzt Cg.RNase J mit dem Homolog inM. tuberculosis.
Die geringste Ähnlichkeit weist Cg.RNase J zu Bs.RNase J2 auf (Tabelle 4.10).
Beim Vergleich der für RNase J charakteristischen Motive zeigte sich, dass Cg.RNase J eine höhere Identität zu Bs.RNase J1 als zu Bs.RNase J2 besitzt. Nur das Motiv M2 von Cg.RNase J besitzt eine von Bs.RNase J1 unterschiedliche Aminosäure. In dem Motiv M2 ist die polare Aminosäure Tyrosin (Y) gegen die unpolare Aminosäure Leucin (L) ausgetauscht (Abbildung 4.25D). Dieser Austausch wurde auch in den RNase J-Homologen vonM. tuberculosisund S. coelicolorbeobachtet und könnte die Aktivität oder Spezifität dieser RNase J-Homologe beeinflussen.