Teile dieser Arbeit wurden bereits in folgender Publikation veröffentlicht:
Wittchen, Manuel; Busche, Tobias; Gaspar, Andrew H.; Lee, Ju Huck; Ton-That, Hung; Ka-linowski, Jörn and Tauch, Andreas. Transcriptome sequencing of the human pathogen Co-rynebacterium diphtheriae NCTC 13129 provides detailed insights into its transcriptional landscape and into DtxR-mediated transcriptional regulation. BMC Genomics 2018 19:82.
https://doi.org/10.1186/s12864-018-4481-8
Im Folgenden werden die verwendeten Materialien und Methoden aufgeführt, die im Rahmen dieser Arbeit benötigt und verwendet wurden. Bei Lösungen sind im Allgemeinen alle Mengen-oder Konzentrationsangaben auf einen Liter bezogen. Wenn nicht anders angegeben, wurde als Lösungsmittel reines Wasser, welches aus einer MilliQ-Anlage von Millipore (Merck) gewonnen wurde, verwendet.
3.1 Bakterienstämme, Plasmide und Primer
Die Plasmidkarten befinden sich im Anhang.
Tabelle 3.1:Liste der verwendeten Stämme vonCorynebacterium diphtheriae und Corynebacteri-um glutamicCorynebacteri-um. Alle Stämme und Mutanten vonC. glutamicumbasieren auf dem Wildtyp ATCC 13032.
Abkürzungen: Bs.,Bacillus subtilis.
Corynebacterium diphtheriae
Stamm Relevante Eigenschaft Referenz
NCTC 13129 Wildtyp NCTC, Cerdeño-Tárragaet al.(2003)
∆dtxR ∆DIP1414 (∆dtxR) Andrew H. Gaspar
Corynebacterium glutamicum
Stamm Relevante Eigenschaft Referenz
ATCC 13032 Wildtyp; NxR ATCC, Kinoshitaet al.(1958)
∆rho ∆cg1354(∆rho) Diese Arbeit
∆rhopEC-rho ∆cg1354pEC-XC99E::Cg.rho; CmR Diese Arbeit
pEC-XC99E Leervektor; CmR Diese Arbeit
pRIM2 Genomische Integration des Plasmids pRIM2; KmR Diese Arbeit
∆rhopRIM2:rho ∆cg1354pRIM2::∆cg1354; KmR Diese Arbeit
∆rhopRIM2 ∆cg1354pRIM2; KmR Diese Arbeit
∆rne ∆cg2597(∆rne) Diese Arbeit
∆rnj ∆cg2160(∆rnj) Diese Arbeit
∆rnjpEC-rnjA ∆cg2160pEC-XC99E::Bs.rnjA; CmR Diese Arbeit
∆rnjpEC-rnjB ∆cg2160pEC-XC99E::Bs.rnjB; CmR Diese Arbeit tadOE pEC-XC99E::cg0362-cg0369(tad-Cluster); CmR Diese Arbeit tadOE pZMP pEC-XC99E::cg0362-cg0369; CmRund pZMP; KmR Diese Arbeit
Tabelle 3.2:Liste der verwendeten Stämme vonE. coli.
Stamm Relevante Eigenschaft Referenz
S17–1 Konjugationsstamm ATCC 47055
DH5αMCR F-endA1 supE44 thi-lλ- re-cA1 deoR∆(lacZYA – argF) U169 φ80dlacZλM15 mcrA ∆ (mrr-hsdRMS-mcrBC)
Grantet al.(1990)
ER2566 Chromosomal kodierte, mit IPTG induzierba-re T7 RNA-Polymerase, induzierba-reduzierte Protease-Ausstattung,
New England Biolabs
S17–1 pK18mobsacB::∆dtxR Deletionsplasmid für DIP1414/dtxR Andrew H. Gaspar, Wittchenet al.(2018) DH5αMCR pK18mobsacB::∆rho Deletionsplasmid fürcg1354/rho Diese Arbeit
DH5αMCR pK18mobsacB::∆rne Deletionsplasmid fürcg2597/rne Diese Arbeit DH5αMCR pK18mobsacB::∆rnj Deletionsplasmid fürcg2160/rnj Diese Arbeit DH5αMCR pRIM2::rho Plasmid für Geninsertion vonC. glutamicum
rho inkl. nativem Promotor und nativem Haarnadel-Terminator des Operons
Diese Arbeit
DH5αMCR pEC-XC99E::tadOE Expressionsplasmid fürtad-Cluster (cg0362 -cg0369)
Diese Arbeit DH5αMCR pEC-XC99E::Bs.rnjA Expressionsplasmid fürB. subtilisRNase J1 Diese Arbeit DH5αMCR pEC-XC99E::Bs.rnjB Expressionsplasmid fürB. subtilisRNase J2 Diese Arbeit ER2566 pTXB1::rne Expressionsplasmid für Proteinaufreinigung
vonC. glutamicumRNase E/G, AmpR
Diese Arbeit ER2566 pTXB1::rnj Expressionsplasmid für Proteinaufreinigung
vonC. glutamicumRNase J, AmpR
Diese Arbeit
Tabelle 3.3:Für Klonierungen, Northern Blot und qRT-PCR verwendete Primer. Diese Liste befindet sich auch auf der beiliegenden Daten-CD (Tabelle S1). Das Zeichen←-zeigt einen Zeilenumbruch an.
LF, Linke Flanke; RF, Rechte Flanke; Reskl., Restriktionsklonierung; GA, GibsonAssembly; Plasmidamp., Plasmidamplifikation; Del., Deletion; Überexpr., Überexpression.
Verwendungszweck Name Sequenz (5‘ - 3‘)
Primer für Deletionen (pK18mobsacB-System)
Del. vondtxRinC. diphtheriaeLF (Reskl.) dtxR-A CGGGATCCGGAAGAATCTGGCATTGAAGA
Del. vondtxRLF (Reskl.) dtxR-B CCCATCCACTAAACTTAAACAATCGACTAAGTCCTTCATTGTA
Del. vondtxRRF (Reskl.) dtxR-C TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGGCCACATCACGTTGAGC
Del. vondtxRRF (Reskl.) dtxR-D CGGGATCCCGCAGACTCGTCGCCGC
Del. vonrho(GA) LF (Reskl.) rho-d1 GGTGGTCTCGAATTCACGCAACGACAGTGCAAGC
Del. vonrho(GA) LF (Reskl.) rho-d2 AGATTTCCTTTCATTGCAGTTC
Del. vonrho(GA) RF (Reskl.) rho-d3 GAACTGCAATGAAAGGAAATCTACTCGTTTGGGCCGTGCGTAC Del. vonrho(GA) RF (Reskl.) rho-d4 GGTGGTCTCGGATCGCCATTAGGAGTAATCCTCCTC
Test-Primer Del. vonrho MW95 TGGGTGCCACGTTCAATTAC
Test-Primer Del. vonrho MW96 CGAGTAGCGCTTACCTACCC
Plasmidamp. für Del.en (GA) MW66 GGTACCCGGGGATCCTCTAG
Plasmidamp. für Del.en (GA) MW67 GAGCTCGAATTCGTAATCATG
Del. vonrne(GA) LF W281 TTTAAGAAGGAGATATACATATGCCAAATAACAAGGCAGT
Del. vonrne(GA) LF W282 AGTGCATCTCCCGTGATGCAGTATCGTGGGCCTCGTCGGGTAG
Del. vonrne(GA) RF W187 ACCATCGGGTGCTCCGCAGCCAGCGCCTGCTCAATGCGAC
Del. vonrne(GA) RF W277 GCTTTCTACGTGTTCCGCTTGCGCAACCTACTGACTTCGAGGCGGC
Test-Primer Del. vonrne MW23 TCACCTGGGTGGAACTTG
Test-Primer Del. vonrne MW24 GACAGCGCACTAATTCACG
Del. vonrnj(GA) LF rnj-d1 ACTCTAGAAATCGCGGCCGGAAGGTTAC
Del. vonrnj(GA) LF rnj-d2 AGGTGAAACGGGATGCCAAG
Del. vonrnj(GA) RF rnj-d3 CTTGGCATCCCGTTTCACCTCAGATCACTGTCCGTGATGG
Del. vonrnj(GA) RF rnj-d4 CTTCTAGATTACAGGGACTCGCGTGAAG
Test-Primer Del. vonrnj MW85 CCTCATATGGTCGGGTAAG
Test-Primer Del. vonrnj MW86 GGGACTTGCCTGGTATTC
Primer für Überexpressionen (pEC-XC99E-System)
Tabelle 3.3:Fortgesetzt
Verwendungszweck Name Sequenz (5‘ - 3‘)
Plasmidamplifikation von pEC-XC99E (GA) pEC-for TTTGCGCCGACATCATAACG Plasmidamplifikation von pEC-XC99E (GA) pEC-rev GGCGGATTTGTCCTACTCAG
Überexpr. vonrho(GA) rho-ov-1 AACCCTCATAAAAGGAGGACAACCGTGACAACCACAGACAACACC
Überexpr. vonrho(GA) rho-ov-2 CCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCATGTTAGGAGTAATCCTCCTCTT
Überexpr. von Bs.rnjA(GA) W111 CACAGGAAGGAGAATAGACAATGAAATTTGTAAAAAATGA
Überexpr. von Bs.rnjA(GA) W112 CCACACTACCATCGGCGCTATTAAACCTCCATAATGATCG
Überexpr. von Bs.rnjB(GA) W113 CACAGGAAGGAGAATAGACATTGAAAAAGAAAAATACAGAAAAC
Überexpr. von Bs.rnjB(GA) W114 CCACACTACCATCGGCGCTATTATACTTCCATAATAATTG
Überexpr. von tadOE (cg0362 – cg0369) (GA) W243 CACAGGAAGGAGAATAGACAATGAAAGCACGTAAGCCTCAG Überexpr. von tadOE (cg0362 – cg0369) (GA) W242 CCACACTACCATCGGCGCTATCATAAAGGTCCTGCTTTTG Primer für Insertion (pRIM2-System)
Insertion vonrhoin pRIM2 Reskl. W316 AGCTGGGTACCCGGGGATCCTCTAGGCAGCTTTTAGCGAGGGGAATGAGA Insertion vonrhoin pRIM2 Restkl. W314 GCCTGCAGGTCGACTCTAGCGCCCCCACTCCCCTGTTTCAAGGGGTGTGG←
-GGGCGTTGAAATTAGGAGTAATCCTCCTCT Primer für Proteinaufreiningung (IMPACT-System)
Amplikation vonrnj(GA) MW31 AGAAGGAGATATACATATGA
Amplikation vonrnj(GA) MW32 TCGACTCGCGAGCTAGCCAT
Amplifikation von pTXB1 mit Überhängen zurnj(GA) MW33 GCGCTTCACGCGAGTCCCTG Amplifikation von pTXB1 mit Überhängen zurnj(GA) MW34 CGATTTCGGGAATCATTCAT
Amplifkation pTXB1 (GA) MW21 ATGGCTAGCTCGCGAGTCGAC
Amplifkation pTXB1 (GA) MW22 TCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG
Aufreinigung vonrne(GA) W274 CTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGTGCCAAATAACAAGGCAGTAG
Aufreinigung vonrne(GA) W275 CGCCGTCGACTCGCGAGCTAGCCATGTATCGTGGGCCTCGTCGGGTAG
Primer für Northern Blot
Sonde 6C RNA N009 CAAGGCCCCGATATACAGTG
Sonde 6C RNA N010 TAATACGACTCACTATAGGGCTAAGGGCACTAGTTTAGAA
Sonde 5S rRNA N021 TGTGTCGGTGGTGATAGTAG
Sonde 5S rRNA N022 TAATACGACTCACTATAGGGGGTCGGCGGTAACCTACTCTC
Primer für qRT-PCR
cg1478 q097 ATGGGAGCCAGTTACTAACC
cg1478 q098 CGTACTTCGGACCAATACTGAC
cg1478Übergang q127 AAAAACGGCTAACCCAAAAG
cg1478Übergang q128 CACGCATGGCCTGGATCAAC
cg1478Verlängerung q099 AATCGCCAAGCACGTAGTAG
cg1478Verlängerung q100 CCAACGTAGAGATCGTGGATTCTG
cg0369 q079 TGGCCAGGGAACAAGCACAG
cg0369 q080 GTGGGCTTCTTGTCCACGAACG
cg0369Übergang q129 TCCAACGCCAACGGATCAAT
cg0369Übergang q130 TTGGAGGACGAGGTTTTTGA
cg0369Verlängerung q131 GCCGAATCAGGACTCAGCTC
cg0369Verlängerung q132 TTCGGGGTCATGTTTATTGC
6C RNA q173 CCCCGATATACAGTGTGGC
6C RNA q174 CCCGCGCCTCGGGGGGGGTG
6C RNA Übergang q177 CGTTGCCGGGTTACTGACG
6C RNA Übergang q178 TTCACTTTCGAATGCAGAGG
6C RNA Verlängerung q179 TTATTTTCTAAACTAGTGCCCTT
6C RNA Verlängerung q180 TGTGGATAACTCACCTCTCAAC
ascg0066 q149 GGTAAATCTTGCAAAAGTAG
ascg0066 q150 TAGTCTTCCGCATGTCACAG
ascg0066 Übergang q151 GGCGATGTCAGGTTTTCTCAC
ascg0066 Übergang q152 ACACCTCCGTGCAGTACATC
ascg0066 Verlängerung q153 GGAGACGCGGAAAATACGTG
ascg0066 Verlängerung q154 GGTGCTCACGGGAGTTTCAA
ascg0511 q155 CACCGATGACTACGGCACTG
ascg0511 q156 ACGACCACGTCCGCTACTAT
ascg0511 Übergang q157 ACAGGAGGCTGGTTTTCATT
ascg0511 Übergang q158 GTCATCGGTGATGACGACCC
ascg0511 Verlängerung q159 ACCACCAAGCGCTGATATCC
ascg0511 Verlängerung q160 GATCTCTGGCATGACATCAA
ascg0700 q093 GATGTCGCTGCGGCACGTCGTGATTAC
ascg0700 q094 CACAGCATCTGCGCCACAGGCAATAG
ascg0700 Übergang q163 AGGTGATTGCTGCGTATGAG
ascg0700 Übergang q164 ATCTCACGAACATTTTGTGG
ascg0700 Verlängerung q095 AGCAGCACGGCGATCCATTGTTTTTTAG
ascg0700 Verlängerung q096 GTCCGCTGCAGTGTTGATGGT
cg0362 q067 CAGTCACCACTGTGCTTATC
cg0362 q068 TAGACAACACCACGACCTCATC
cg0365 q073 GCTGACCCAGTGGATGTCTC
cg0365 q074 GCACTCACTCCAATCGATAG
Tabelle 3.4:Liste der verwendeten Plasmide.
Plasmid Beschreibung Referenz
pK18mobsacB Plasmid für die Gendeletion/Genaustausch inC. diphtheriaeundC. glutamicum, KmR
Schäferet al.(1994) pK18mobsacB::∆dtxR Deletionsplasmid für DIP1414/dtxR Andrew H. Gaspar,
Wittchenet al.(2018) pK18mobsacB::∆rho Deletionsplasmid fürcg1354/rho Diese Arbeit
pK18mobsacB::∆rne Deletionsplasmid fürcg2597/rne Diese Arbeit pK18mobsacB::∆rnj Deletionsplasmid fürcg2160/rnj Diese Arbeit
pRIM2 Plasmid für Geninsertion, KmR Vašicováet al.(1998) pRIM2::rho Plasmid für Geninsertion vonC. glutamicum
rho inkl. nativem Promotor und nativem Haarnadel-Terminator des Operons
Diese Arbeit
pEC-XC99E Shuttle-Expressionsplasmid, CmR Kirchner und Tauch (2003)
pEC-XC99E::tadOE Expressionsplasmid fürtad-Cluster (cg0362 -cg0369)
Diese Arbeit pEC-XC99E::rho Expressionsplasmid fürrho Diese Arbeit pEC-XC99E::Bs.rnjA Expressionsplasmid fürB. subtilisRNase J1 Diese Arbeit pEC-XC99E::Bs.rnjB Expressionsplasmid fürB. subtilisRNase J2 Diese Arbeit pZMP Shuttle-Expressionsplasmid, KmR Walteret al.(2016) pTXB1 Expressionsplasmid für Proteinaufreinigung
über das IMPACT-System, C-terminale Fusion, T7-Promotor, AmpR
New England Biolabs
pTXB1::rne Expressionsplasmid für Proteinaufreinigung
vonC. glutamicumRNase E/G, AmpR Diese Arbeit pTXB1::rnj Expressionsplasmid für Proteinaufreinigung
vonC. glutamicumRNase J, AmpR
Diese Arbeit