Motivanalyse von möglichen rut sites von mRNAs

FürE. coli konnte gezeigt werden, dass der Rho-FaktorC-reiche und G-arme Sequenzen, sogenannte CG-Blasen (CG-Bubbles), auf der RNA erkennt und anschließend die Transkrip-tionstermination einleitet (Alifanoet al., 1991; Walmacqet al., 2004). Aus diesem Grund

gelten CG-Blasen als Indikatoren für Rho-abhängige Terminatorstrukturen und werden daher auchRho utilisation sites(rut sites) genannt (Menouniet al., 2013; Peterset al., 2012). Eine distinkte Sequenzabfolge mit einem Erkennungsmotiv ist nicht bekannt. Daher sind bioinfor-matische Vorhersagen Rho-abhängiger Terminatoren im Gegensatz zu Rho-unabhängigen (intrinsischen) Terminatoren nicht möglich (Hart und Roberts, 1991; Ray-Soniet al., 2016).

Es stellt sich die Frage, wie der Rho-Faktor in Bakterien mit hohemG₊C-Gehalt zwischen zu terminierenden und nicht zu terminierenden Transkripten unterscheidet, da CG-Blasen häufiger auftreten sollten, als in Bakterien mit geringemG₊C-Gehalt. Die Abteilung der Actinobakterien umfasst viele Bakterien die einen hohen bis sehr hohenG₊C-Gehalt besitzen (Venturaet al., 2007). Daneben besitzen viele Actinobakterien eine NTD-Insertion im

Rho-Faktor (D’Heygèreet al., 2013), für die zumindest in M. tuberculosis eine RNA-bindende Eigenschaft nachgewiesen wurde (Mitraet al., 2014; D’Heygèreet al., 2015). Zumindest für Actinobakterien besteht eine gewisse Korrelation zwischenG₊C-Gehalt und NTD-Insertion im Rho-Protein.

FürC. glutamicum wurden in dieser Arbeit die Rho-abhängig terminierten Transkripte genomweit identifiziert. Obwohl einige Studien zur genomweiten Identifikation von Rho-abhängig terminierten Transkripten durchgeführt wurden (Peterset al., 2012; Botellaet al., 2017; Mäderet al., 2016), wurde auf dessen Basis bisher keine umfassende Analyse der CG-Blasen bzw.rut sitesdurchgeführt. Aufgrund von Strukturanalysen des Rho-Hexamers inE. coliwird von einerrut sitemit einer Länge von ca. 80 bis 90 nt ausgegangen (Chen und Richardson, 1987; Zalatan und Platt, 1992; McSwiggenet al., 1988). Diese Länge wird benötigt, damit jedes Rho-Monomer gleichzeitig mit einem Teil derrut sitein Kontakt treten kann (Kosloveret al., 2012). Der Erkennungsmechanismus des Rho-Hexamers ist allerdings nicht geklärt. So könnte es ebenso wahrscheinlich sein, dass die einzelnen Rho-Monomere erst nacheinander mit derrut sitein Kontakt treten. In diesem Fall wäre eine wesentlich kürzererut site, die von Monomer zu Monomer wandert, für eine Induktion der Termination ausreichend (Canals et al., 2010). Darüber hinaus könnte der Erkennungsmechanismus aufgrund der in vielen Rho-Homologen identifizierten NTD-Insertion und Verlängerungen im 5’-YC-Dimer-Motiv von dem inE. colivermuteten Mechanismus unterschiedlich ablaufen.

Für den Rho-Faktor ausC. glutamicumwurde in dieser Arbeit eine Analyse der verlängerten proteinkodierenden Transkripte hinsichtlich möglicher CG-Blasen bzw.rut sitesdurchgeführt.

In 244 von 245 der Rho-abhängig terminierten mRNAs wurden CG-Blasen mit einer Länge von mindestens 10 nt bis maximal 478 nt gefunden. Im Durchschnitt haben die CG-Blasen eine Länge von circa 35 nt (Abbildung 4.19). Da der Rho-Faktor inC. glutamicumaufgrund der NTD-Insertion wesentlich größer ist als inE. coli, würde nach der oben genannten Annahme eine CG-Blase von über 90 nt benötigt werden, um eine Rho-abhängige Termination einzuleiten.

Nur 66 (27 %) der verlängerten proteinkodierenden Transkripte besitzen eine CG-Blase die mindestens 90 nt lang ist. Die Längen der CG-Blasen ist somit, zumindest fürC. glutamicum, kein eindeutiges Indiz für eine Rho-abhängige Termination.

Interessanterweise besitzen die intrinsisch terminierten Transkripte ebenfalls CG-Blasen mit einer zu den Rho-abhängig terminierten Transkripten identischen Längenverteilung (Ab-bildung 4.19). Im Mittel sind die CG-Blasen der intrinsisch terminierten wie die Rho-abhängig terminierten Transkripte 35 nt lang und sind somit nicht von den CG-Blasen der Rho-abhängig terminierten Transkripte zu unterscheiden. InC. glutamicumkönnen CG-Blasen daher kei-nerut sitedarstellen. Die Rho-abhängige Termination muss, zumindest inC. glutamicum, möglicherweise auch in allen Rho-Homologen mit vergleichbarer NTD-Insertion und/oder verlängertem 5’-YC-Dimer-Motiv, anders ablaufen als es fürE. colibeschrieben wird.

InE. colikonnte gezeigt werden, dass die Rho-abhängige Termination von den Antitermina-torproteinen NusA und NusG beeinflusst wird (Peterset al., 2012). Auch die Packungsstruktur der chromosomalen DNA durch das Histon-ähnliche Nukleoid-strukturierende Protein H-NS beeinflusst die Termination durch den Rho-Faktor inE. coli(Kotlajichet al., 2015). Der Mecha-nismus der Rho-abhängigen Transkriptionstermination ist daherin vivowesentlich komplexer, als über das bloße Vorhandensein von CG-Blasen erkennbar ist.C. glutamicumbesitzt Homolo-ge von NusA und NusG (Charlebois und Doolittle, 2004) mit zu denE. coliProteinen ähnlicher Domänenstruktur. Ein H-NS-Homolog existiert allerdings nicht inC. glutamicum(Kalinowski et al., 2003). Es ist daher wahrscheinlich, dass auch NusA oder NusG die Termination durch den Rho-Faktor inC. glutamicumbeeinflussen. Dies könnte in weiteren Studien analysiert werden.

5.3.8 Rho reguliert ein Typ IVb Pilussystem

In derC. glutamicum∆rho-Mutante gehören die Genecg0362biscg0369zu den am stärksten differenziell transkribierten Genen. Diese Gene kodieren für ein putatives Typ IVb Pilussystem und wurden daher auch zusammenfassend alstad-Cluster bezeichnet (Imamet al., 2011;

Tomichet al., 2007).

Funktion des Typ IVb Pilussystems in C. glutamicum

Bifidobacterium breveexprimiert den Typ IVb Pilus nur, wenn es in Kontakt mit eukaryotischen Zellen tritt, da es Teil der natürlichen Darmflora von Säugetieren ist und den Pilus zur Adhäsion an den Darmzellen verwendet (Motherwayet al., 2011). NebenB. brevewurde der Typ IV Pilus auch inMicrococcus luteusfunktional beschrieben (Angelovet al., 2015). Obwohl M. luteuswieB. brevezu den Actinobakterien zählt, nutzt dieses Bakterium den Typ IV Pilus

als DNA-Aufnahmesystem, was die natürliche Kompetenz vonM. luteuserklärt (Angelovet al., 2015). Die Fähigkeit vonC. glutamicumzur natürlichen Kompetenz ist nicht beschrieben (Johnstonet al., 2014).

Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Typ IVb Pilus vonC. glutami-cumebenfalls die DNA-Aufnahme verbessert (Abbildung 4.24C). Eine Nutzung des Typ IVb Pilus durchC. glutamicumzur Adhäsion an Oberflächen ist für ein Bodenbakterium eher unwahrscheinlich, kann aber nicht ausgeschlossen werden. Obwohl die Ergebnisse der Charak-terisierung des Typ IV Pilus inC. glutamicumundM. luteusfür die DNA-Aufnahme sprechen, sind die für Kompetenzpilisysteme in grampositiven Bakterien bekannten Proteine ComEC, ComEA und EndA für die DNA-Aufnahme nicht imtad-Cluster, sondern an einem genomisch entfernten Bereich kodiert. Das Protein ComEC bildet eine Pore für die DNA-Aufnahme in der Zellmembran durch die einzelsträngige DNA mit Hilfe des DNA-Rezeptors ComEA hindurch geleitet wird. Die einzelsträngige DNA wird dabei durch die Nuklease EndA aus doppelsträn-giger DNA erzeugt. Der Kompetenzpilus fungiert in diesem System als eine Art Antenne an die DNA bindet (Johnstonet al., 2014). Die DNA-Aufnahme kann unspezifisch oder über die Erkennung von DNA-Aufnahmesequenzen, wie beiNeiserria gonorrhoeae, erfolgen (Aas et al., 2002). Nach erfolgter Bindung wird der Pilus in die Zelle zurückgezogen, um die DNA in Richtung Pore zu leiten (Provvedi und Dubnau, 1999; Chen und Gotschlich, 2001; Seitz et al., 2014). In derC. glutamicum∆rho-Mutante sind neben demtad-Cluster auch die Gene comECundcomEAverstärkt differenziell transkribiert (Abbildung 4.22). EinendAHomolog konnte inC. glutamicumnicht nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Die im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Transformierbakeit der∆rho-Mutante lässt sich vermutlich auf die Expression destad-Clusters und/oder der beiden GenecomECundcomEAzurückzuführen.

Genetische Organisation und mögliche Regulation des Typ IVb Pilussystems in C. glutamicum

Das inC. glutamicumfür den Typ IVb Pilus kodierendetad-Cluster besteht aus sieben Genen (plus der abseits kodierten Prepillinpeptidase TadV) und ist damit wesentlich kleiner als das inA. actinomycetemcomitans(14 Gene; Tomichet al.(2007)). In Actinobakterien befindet sich die das Gen der Prepillinpeptidase häufig abseits des eigentlichentad-Clusters (Tomich et al., 2007). Da grampositive Bakterien keine äußere Membran besitzen, ist der Aufbau des Typ IV Pilus vermutlich weniger komplex und erfordert daher weniger Proteine und somit weniger Gene.

Im C. glutamicum Wildtyp ist unter Standard-Kultivierungsbedingungen das für einen putativen Typ IVb Pilus kodierendetad-Cluster nicht bzw. nur sehr gering transkribiert. Auch

unter Einfluss von unterschiedlichen Stressbedingungen ist keine erhöhte Transkription beobachtet worden (Pfeifer-Sancaret al., 2013). Nur in derC. glutamicum∆rho-Mutante ist das tad-Cluster verstärkt differenziell transkribiert. Anhand der Volllängen- sowie der Primärtranskriptdaten der∆rho-Mutante konnte in dieser Arbeit die genetische Organisation destad-Clusters inC. glutamicumerstmalig beschrieben werden. Demnach ist dastad-Cluster in zwei Operons mit jeweils eigenem TSS unterteilt: Operon 1 voncg0362biscg0364und Operon 2 voncg0365biscg0369.B. brevebesitzt ebenfalls eintad-Clusters mit identischer Genzahl und ähnlicher Operonstruktur (Motherwayet al., 2011). Dieses Bakterium exprimiert den Typ IVb Pilus nur, wenn es in Kontakt mit eukaryotischen Zellen tritt, um an diese zu binden (Motherwayet al., 2011). In vielen Spezies (Myxococcus xanthus, Dichelobacter nodosus, Geobacter sulfurreducens, Kingella kingae, Xanthomonas axonopodisundPseudomonas aeruginosa) wird das Typ IV Pilussystem über einenσ⁵⁴ Promotor reguliert (Giltneret al., 2012). Eine weitere Regulation inP. aeruginosasfindet über das Zweikomponentensystem PilR/PilS statt. PilS ist eine membrangebundene Histidinkinase die durch ein unbekanntes Signal autophosphoryliert wird. Anschließend phosphoryliert PilS PilR welcher die Pilin-Expression verstärkt (Giltneret al., 2012).

C. glutamicumbesitzt weder ein PilR/PilS-System, noch den Sigmafaktorσ⁵⁴. Die Regulation destad-Clusters muss daher über einen anderen Mechanismus ablaufen. Die Bedingungen, unter denenC. glutamicumdastad-Cluster nativ exprimiert, sind nicht bekannt. Unter den von Pfeifer-Sancaret al.(2013) getesteten Stressbedingungen (Hoher Sauerstoffpartialdruck, Wasserstoffperoxid-, Diamid-, Ethanol-, Salz-, Hitze- und Kältestress) findet keine verstärkte Expression statt. In der∆rho-Mutante ist dastad-Cluster stark differenziell transkribiert. Die Regulation destad-Clusters muss daher direkt oder indirekt über den Rho-Faktor erfolgen. Das tad-Cluster inA. actinomycetemcomitansbesitzt drei Terminatoren T1 bis T3. Terminator T2 reagiert auf Bicyclomycin (BCM), was auf eine Rho-abhängige Termination hindeutet (Kram et al., 2008), da BCM den Rho-Faktor spezifisch inhibiert. Diese Beobachtung unterstützt somit die Hypothese, dass dastad-Cluster inC. glutamicumdurch den Rho-Faktor reguliert wird.

InC. glutamicumbefindet sich direktupstreamdestad-Clusters die nichtkodierende RNA

„6C RNA“. Die 6C RNA ist in Actinomyceten weit verbreitet (Weinberg et al., 2010) und ist inC. glutamicumin der SOS-Antwort involviert (Pahlkeet al., 2016). InM. tuberculosis und M. smegmatiswird die 6C RNA als B11 RNA bezeichnet und befindet sich ebenfalls upstreameinestad-Clusters (DiChiaraet al., 2010; Arnvig und Young, 2009). Obwohl für die 6C RNA bzw. B11 RNA ein Rho-unabhängiger intrinsischer Terminator vorhergesagt wurde (Mentzet al., 2013; DiChiaraet al., 2010; Arnvig und Young, 2009), konnte in der C. glutamicum∆rho-Mutante gezeigt werden, dass die 6C RNA um den Faktor fünf verlängert

vorliegt und somit Rho-abhängig terminiert sein muss. Dieses Ergebnis wird auch durch die Primärtranskriptdaten der∆rho-Mutante unterstützt (Abbildung 4.23). In einem Microarray-Experiment wurde nachgewiesen, dass unter anderem die Gene destad-Clusters in einer 6C Deletionsmutante verstärkt exprimiert werden (Pahlke, 2014). Somit sind die 6C RNA-Deletionsmutante sowie die∆rho-Mutante die einzigen bekannten Bedingungen, in der das tad-Cluster inC. glutamicumverstärkt transkribiert wird. Die Transkriptionsregulation des tad-Clusters könnte daher über die Rho-abhängig terminierte 6C RNA erfolgen. Allerdings konnte bei einemknock downdes Rho-Faktors inM. tuberculosisgezeigt werden, dass die Transkription destad-Clusters leicht verringert ist (Botellaet al., 2017). Die mögliche Regulation des tad-Clusters durch den Rho-Faktor ist somit nicht einheitlich innerhalb der Corynebacterineae.

InLegionella pneumophilawurde kürzlich nachgewiesen, dass die Expression eines Kompe-tenzpilus-Clusters über eine ncRNA reguliert wird (Attaiechet al., 2016). Im Folgenden wird Regulation vorgestellt und Parallelen zuC. glutamicumdiskutiert.

Die ncRNA „RocR“ reprimiert zusammen mit dem RNA-Chaperon RocC die Expression eines Kompetenzpilus-Clusters inL. pneumophila(Attaiechet al., 2016). RocR besteht aus dreistem loopsund ist der 6C RNA ausC. glutamicumstrukturell ähnlich. Der Repressionsmechanismus des Kompetenzpilus-Clusters durch RocR/RocC erfolgt über die Bindung von RocR an RocC, wobei einstem loopvon RocR linearisiert und frei exponiert wird. Über eine komplementäre Bindung des exponierten Teils von RocR an das 5’-Ende der mRNA voncomEA, comEC, comM undcomF wird die ribosomale Bindestelle blockiert. Durch die fehlende Translation durch Ribosomen ist die jeweilige mRNA vor RNasen ungeschützt und wird schnell degradiert. Erst durch verringerte Expression von RocR wird das Kompetenzpilus-Cluster exprimiert und die Zellen kompetent (Attaiechet al., 2016). Aufgrund der großen Ähnlichkeit zwischen den beiden ncRNAs RocR und 6C RNA sowie der verstärkten Expression destad-Clusters bei Deletion vonrhobzw. der 6C RNA könnte die Regulation destad-Clusters inC. glutamicum ähnlich wie die Regulation des Kompetenzpilus inL. pneumophilafunktionieren.Downstream destad-Clusters inC. glutamicum, wie auch inM. tuberculosis, befindet sich eine putative RNA-Helicase (inC. glutamicumkodiert durch das Gencg0370). Es wäre denkbar, dass diese RNA-Helicase die 6C RNA bindet, einen Teil der 6C RNA-Sequenz frei exponiert und so eine Bindung zur mRNA voncg0362oder auchcomEAbzw.comECermöglicht. Da die 6C RNA konstitutiv exprimiert wird, würde dies die stets geringe Transkriptabundanz destad-Clusters inC. glutamicumerklären. Somit wäre die verstärkte Transkription destad-Clusters in der

∆rho-Mutante über die stark verlängerte 6C RNA, die nicht mehr von der RNA-Helicase gebun-den wergebun-den kann, zu erklären. Um diese Hypothese zu überprüfen wurde eineC. glutamicum Deletionsmutante des Genscg0370erstellt und die Transkriptabundanz destad-Clusters im Vergleich zum Wildtyp gemessen. Die mittels qRT-PCR gemessene Transkriptabundanz des

tad-Clusters in der RNA-Helicase Deletionsmutante war identisch zu der des Wildtyps (Daten nicht gezeigt). Die RNA-Helicase Cg0370 ist somit nicht über den vermuteten Mechanis-mus an der Regulation destad-Clusters beteiligt. Möglicherweise übernimmt eine andere RNA-Helicase die Funktion von RocC inC. glutamicum.

5.4 RNA-Degradation durch die RNasen E/G und J in C. glutamicum

Der Abbau und die Stabilität von RNA sind essenzielle Funktionen zur Aufrechterhaltung der zellulären Prozesse und erfolgen über unterschiedliche RNasen (Arraianoet al., 2010;

Laalamiet al., 2014). Aus dem Grund ist eine Charakterisierung und Analyse der RNasen für das Verständnis des RNA-Abbaus essenziell.

In dieser Arbeit wurden die RNasen E/G und J inC. glutamicumuntersucht und charakteri-siert. Dazu wurden die RNasen mit entsprechenden Homologen aus anderen Organismen verglichen. Da RNasen auf Transkriptebene wirken, wurden die Transkriptome von den je-weiligen Deletionsmutanten der RNasen untersucht. Darüber hinaus wurde eine Methode zur Identifizierung von RNase-Schnittstellen mit RNA-Sequenzierung entwickelt und zur Charakterisierung der Schnittstellen von RNase E/G und J angewendet.

5.4.1

besitzt eine von den Modellorganismen abweichende RNase-Ausstattung

C. glutamicumbesitzt die RNasen E/G und J, aber kein RNase Y-Homolog. Somit ist die Enzy-mausstattung vonC. glutamicuman zentralen RNasen weder mit der Enzymausstattung der ModellorganismenE. coliundB. subtilisidentisch.C. glutamicumbesitzt, wieE. coli(Arraiano et al., 2010), die 3’-5’-Exoribonukleasen PNPase und RNase R.B. subtilisbesitzt ebenfalls je ein PNPase- und RNase R-Homolog (Condon, 2007). Somit ist die Enzymausstattung an 3’-5’-Exoribonukleasen inC. glutamicumder Enzymausstattung inE. coliähnlicher als der von B. subtilis. Ein RppH-Homolog zur Abspaltung von Triphosphaten an den 5’-Enden von Pri-märtranskripten ist inC. glutamicum, wie auch inB. subtilis(Durand und Condon, 2018) und E. coli(Deanaet al., 2008), vorhanden. Da Ec.RNase E und Bs.RNase J zentrale Funktionen in der RNA-Degradation der jeweiligen Modellorganismen besitzen, wird vermutet, dass die Homologe RNase E/G und J inC. glutamicumebenfalls zentrale Rollen einnehmen. Die Initia-tion der RNA-DegradaInitia-tion inC. glutamicumwürde demnach zum Teil aus RNase E/G, wie bei E. coliund zum Teil aus RNase J, wie beiB. subtilis, erfolgen. Der anschließende Abbau würde wie beiB. subtilisvom 5’- als auch vom 3’-Ende durch RNase J, PNPase und RNase R erfolgen.

DaC. glutamicum, wieE. coli, ein Homolog der Oligo-Ribonuklease besitzt, erfolgt der Verdau der Fragmente zusätzlich über diese RNase. Allerdings sind die 3’-5’-Exoribonukleasen nicht Gegenstand dieser Arbeit gewesen. Um den tatsächlichen Einfluss dieser Exoribonukleasen auf die RNA-Degradation zu ermitteln, müssen weitere Studien erfolgen.

5.4.2 Die RNasen E/G und J besitzen zusätzliche N-terminale Bereiche