Soweit nicht anders angegeben wurden die verwendeten Puffer sterilfiltriert und bei Raumtemperatur gelagert. Es wurde MILLIPORE bzw. bidestilliertes Wasser verwendet.
2.11.1 Arbeiten mit E. coli Antibiotika
Die langfristige Lagerung der gelösten Antibiotika erfolgte nach Sterilfiltrierung bei 20 °C, die kurzfristige Lagerung erfolgte bei 4 °C.
Ampicillin (1000 x): 150 mg/ml Ampicillin (Na-Salz) in Wasser gelöst und sterilfiltriert.
Chloramphenicol (1000 x): 30 mg/ml Chloramphenicol in 100 % EtOH gelöst und sterilfiltriert.
Kanamycin (1000 x): 75 mg/ml Kanamycin in Wasser gelöst und sterilfiltriert.
Dulbecco‟s PBS Puffer: Sigma-Aldrich
Glucose-Stammlösung: 20 % (w/v) Glucose in Wasser gelöst und autoklaviert.
Glycerin (87 %)
IPTG-Stammlösung 1 M IPTG in Wasser gelöst, sterilfiltriert, bei -20 °C gelagert.
KCl-Stammlösung: 1 M KCl in Wasser gelöst, sterilfiltriert und bei -20 °C gelagert.
MgCl2-Stammlösung: 1 M MgCl2 in Wasser gelöst, sterilfiltriert und bei -20 °C gelagert.
MgSO4-Stammlösung: 1 M MgSO4 in Wasser gelöst, sterilfiltriert und bei -20 °C gelagert
TFB I-Puffer: 100 mM KCl, 50 mM MnCl2, 30 mM KOAc,
10 mM CaCl, 15 % Glycerol.
Die Stammlösungen der Einzelkomponenten wurden bei 4 °C gelagert. Der Puffer wurde direkt vor der Verwendung frisch angesetzt.
TFB II-Puffer: 100 mM Tris/HCl pH 7,0, 10 mM KCl, 75 mM CaCl2. Die Stammlösungen der
Einzel-komponenten wurden bei 4 °C gelagert. Der Puffer wurde direkt vor der Verwendung frisch angesetzt.
2.11.2 Arbeiten mit DNA
dNTP-Lösung für PCR: je 2 mM dNTP (N = A, C, G oder T) in Wasser gelöst und bei -20 °C gelagert.
MgCl2 für epPCR: 50 mM MgCl2 Stammlösung von Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase (NEW ENGLAND BIOLABS); bei -20 °C gelagert.
MnCl2 für epPCR: 1 M MnCl2 in Wasser gelöst, autoklaviert und bei -20 °C gelagert.
2.11.3 Agarosegelelektrophorese
Agarose (1 %): Eine entsprechende Menge an Agarose in 0,5 x TBE gelöst, aufgekocht und bei 60 °C aufbewahrt.
Ethidiumbromid-Stammlösung (10 mg/ml)
Sukrose-Farbmarker: 60 % (w/v) Sukrose, 0,1 % (w/v) Bromphenol-blau, 0,1 % (w/v) Xylencyanol FF in 0,5 x TBE gelöst.
TBE (5 x): 445 mM Borsäure, 12,5 mM EDTA, 445 mM
Tris (pH-Wert automatisch bei 8,15).
2.11.4 Arbeiten mit Proteinen
2.11.4.1 Allgemeine Arbeiten
EDTA-Stammlösung: 500 mM EDTA unter Zugabe von ca. 20 Plätzchen KOH in 1 l Wasser gelöst und
anschließend mit 1 M KOH den pH-Wert auf 7,5 eingestellt. Die Lösung wurde bei RT gelagert.
Labelpuffer für Metallchelat-
Affinitätschromatographie: 50 mM EDTA, 1 M NaCl zum Herunterwaschen der alten Ni2+-Ionen;
250 mM NiCl2 zum Beladen der Säule mit frischen Ni2+-Ionen;
500 mM NaCl zum Herunterwaschen unspezifisch gebundener Metallionen.
2.11.4.2 Arbeiten mit hPCSK931-454 Ammoniumsulfat-Lösung
zur fraktionierten Präzipitation: 3 M (NH4)2SO4 in 50 mM Tris/Cl, 5 mM DTT, pH 8,0. Die exakte Konzentration wurde refraktometrisch bestimmt (3.5.9).
Aufschlusspuffer
bei Protein-Herstellung im
analytischen Maßstab: 50 mM Tris/Cl, 2 mM EDTA, pH 8,0.
bei präparativer Proteinreinigung: 50 mM Tris/Cl, 1 mM DTT, pH 8,0.
Dialyse-Puffer: 50 mM Tris/Cl, 5 mM DTT, pH 8,0.
DTT-Stammlösung: 500 mM DTT in Wasser gelöst, sterilfiltriert, bei -20 °C gelagert.
Puffer für Metallchelat-Affinitätschromatographie:
Laufpuffer: 50 mM Tris/Cl, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazol, pH 8,0.
Elutionspuffer: 50 mM Tris/Cl, 300 mM NaCl, 1 M Imidazol, pH 8,0.
Harnstoff-Stammlösung
für Auffaltungsexperimente: 10 M Urea unter Erhitzen in 50 mM Tris/Cl, pH 8,0 gelöst. Danach wurde zusätzlich 5 mM DTT zugegeben. Die exakte Konzentration des Harnstoffs wurde refraktometrisch bestimmt (3.5.9).
Tris/Cl-Puffer Stammlösung: 1 M Tris mit HCl auf pH 8,0 eingestellt und autoklaviert.
2.11.4.3 Arbeiten mit hGR-LBD Ammoniumsulfat-Lösung zur
fraktionierten Präzipitation: 2,5 M (NH4)2SO4 in 25 mM Tris/Cl, 100 mM NaCl, 2 mM TCEP, 10 % Glycerin, 50 µM Dexamethason, pH 7,9. Die exakte Konzentration wurde refraktometrisch bestimmt (3.5.9).
Aufschlusspuffer
bei Protein-Herstellung im
analytischen Maßstab: 50 mM Tris/Cl, 400 mM NaCl, 0,5 % CHAPS, 10 % Glycerin, pH 7,9 (± 50 µM Dexamethason).
bei präparativer Proteinreinigung: 50 mM Tris/Cl, 2 M Urea, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 40 mM Imidazol, 2 mM TCEP, pH 7,9 (± 50 µM Dexamethason); direkt vor Benutzung wurde DNase I (Roche) (1 mg/ 50 ml) und
EDTA-freier Protease Inhibitor Cocktail complete (Roche) (1 Tablette / 50 ml) zugesetzt.
Dexamethason-Stammlösung: 20 mM Dexamethason in EtOH gelöst, sterilfiltriert und bei 4 °C gelagert.
Dialyse-Puffer für Thrombin-Verdau: 50 mM Tris/Cl, 500 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0.5 % CHAPS, 10 % Glycerin, pH 7,9 (± 10 µM Dexamethason).
Mifepriston-Stammlösung: 20 mM Mifepriston in EtOH gelöst, sterilfiltriert und bei 4 °C gelagert.
Puffer für Metallchelat-Affinitätschromatographie:
Laufpuffer: 50 mM Tris/Cl, 500 mM NaCl, 40 mM Imidazol, 2 mM TCEP, 10 % Glycerin, pH 7,9 (± 50 µM Dexamethason).
Elutionspuffer: 50 mM Tris/Cl, 500 mM NaCl, 340 mM Imidazol, 2 mM TCEP, 10 % Glycerin, pH 7,9 (± 50 µM Dexamethason).
Puffer für Glutathion-Affinitätschromatographie:
Laufpuffer: 50 mM Tris/Cl, 500 mM NaCl, 2 mM TCEP,
0.25 % CHAPS, 10 % Glycerin, pH 7,9 (± 10 µM Dexamethason).
Elutionspuffer: 50 mM Tris/Cl, 500 mM NaCl, 2 mM TCEP, 0.25 % CHAPS, 10 % Glycerin, 10 mM L-Glutathion, pH 7,9 (± 10 µM Dexamethason).
Puffer für präparative Gelfiltration: 25 mM Tris/Cl, 100 mM NaCl, 2 mM TCEP, 10 % Glycerin, pH 7,9.
Puffer für analytische Gelfiltration: 25 mM Tris/Cl, 100 mM NaCl, 2 mM TCEP, 10 % Glycerin, 20 µM Dexamethason, pH 7,9.
Puffer für HPLC
polares Laufmittel: H2O, 0,1 % TFA
unpolares Laufmittel: Acetonitril, 0,08 % TFA
Tris/Cl-Puffer Stammlösung: 1 M Tris mit HCl auf pH 7,9 eingestellt und autoklaviert.
2.11.5 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (12,5 % SDS-Gele) Ammoniumperoxodisulfid (APS)-
Stammlösung (25 % und 40 %): 25 % bzw. 40 % (w/v) APS in Wasser gelöst, sterilfiltriert, bei -20 °C gelagert.
Coomassie Färbelösung: 0,2 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue G250 und R250, 50 % (v/v) Ethanol, 10 % (v/v) Eisessig, filtriert, bei RT lichtgeschützt gelagert.
ProtogelTM: 30 % (v/v) Acrylamid, 0,8 % (v/v) Bisacrylamid, in Wasser gelöst und bei 4 °C gelagert.
SDS-PAGE Trenngelpuffer: 0,4 % (w/v) SDS, 1,5 M Tris HCl, pH 8,8
SDS-PAGE Sammelgelpuffer: 0,4 % (w/v) SDS, 0,5 M Tris HCl, pH 6,8 SDS-PAGE Laufpuffer: 0,1 % (w/v) SDS, 0,025 M Tris, 0,2 M Glycin
(pH-Wert automatisch bei 8,5).
SDS-PAGE Probenpuffer (2x): 2 % (w/v) SDS, 10 % (w/v) Glycerin,
5 % (v/v) -Mercaptoethanol, 2 % (w/v) SDS, 0,01 % (w/v) Bromphenolblau, 1,25 M Tris/HCl, pH 6,8.
SDS-PAGE Probenpuffer (5x): 5 % (w/v) SDS, 25 % (w/v) Glycerin,
12,5 % (v/v) -Mercaptoethanol, 5 % (w/v) SDS, 0,025 % (w/v) Bromphenolblau, 1,25 M
Tris/HCl, pH 6,8.
2.11.6 Lösungen für Western-Blotting
Towbin Transfer Puffer: 10 mM Tris, 75 mM Glycin, 10 % Methanol, 0,01 % SDS.
PBS (10x): 91 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, 0,15 M NaCl, auf pH 7,4 mit NaOH eingestellt.
Blockierungspuffer PBS/T+M: 1x PBS, 0,1 % Tween-20, 5 % Milchpulver.
Antikörperlösungen:
Die Lösungen wurden stets frisch hergestellt und verwendet.
Anti-GFP Antikörper
mouse monoklonal: 1:1000 in 1x PBS, 0,1 % Tween-20.
Peroxidase-konjugierter
anti-mouse IgG: 1:5000 in 1x PBS, 0,1 % Tween-20, 1 % Milchpulver.
Waschpuffer PBS/T: 1x PBS, 0,1 % Tween-20.