Analyse und Anreicherung fluoreszierender E. coli Zellen durch Durchflusszytometrie

Bei der Durchflusszytometrie mittels Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) können Zellen auf der Basis unterschiedlicher physikalischer und molekularer Eigenschaften analysiert und sortiert werden. Mit dem verwendeten Gerät (MoFlo^© Zytometer mit Cyclone-Sortiereinheit und Coherent Enterprise II Laser) können bei der Analyse von bis zu 70.000 Zellen pro Sekunde drei verschiedene Parameter detektiert werden: das Vorwärts-Streulicht

(Forward Scatter, FSC), das Seitwärts-Streulicht (Side Scatter, SSC) und die Fluoreszenzintensität nach Anregung mit einem Argonlaser (488 nm) (FL1). Der FSC liefert ein Maß für die Größe der analysierten Zellen, die Detektion des SSC erfolgt zur Analyse der Granularität der Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde jedoch ausschließlich die Fluoreszenz der Zellen nach Anregung bei 488 nm analysiert, wobei die Emission über einen 530/40 nm (FITC) Bandpassfilter detektiert wurde. Durch hydrodynamische Fokussierung (Watson, 1999) in einer Düse wird die in das MoFlo^© Zytometer eingeleitete Zellsuspension (in 1x PBS) in einem Strahl mit definiertem Durchmesser (verwendete Keramik-Düse:

70 µm) am gebündelten Laserstrahl vorbeigeleitet, wobei stets nur eine Zelle im Querschnitt des Meßbereiches vorhanden ist. Um eine Sortierung von einzelnen Zellen vornehmen zu können wird die Düse so in Schwingungen versetzt, dass der Strahl in einzelne Tropfen bricht, wobei jeder Tropfen eine Zelle enthält. Die Detektoren für das Seitwärts (SSC)- und Vorwärtsstreulicht (FSC) bzw. die Fluoreszenz (FL1) nehmen dabei das Signal auf, dass jede einzelne Zelle liefert. Wird dabei eine Zelle mit den zuvor definierten Eigenschaften erkannt, kann diese heraus sortiert werden. Dies erfolgt durch ein elektrisches Feld, in welchem der entsprechende Tropfen elektrostatisch aufgeladen wird und anschließend seitlich in ein Auffanggefäß oder auf eine LB-Selektivagarplatte über geladene Platten abgelenkt wird (Abbildung 18).

Abbildung 18: Schematischer Aufbau des MoFlo^© Zytometers und exemplarisches Histogramm einer FACS-Analyse.

a Graphische Darstellung des Sortier-Prinzips des MoFlo^© Zytometers. Nach erfolgreicher Kalibrierung des Tropfenabrisses und des Argon-Lasers auf den Flüssigkeitsstrahl können einzelne Zellen durch Ablenkung geladener Tropfen sortiert werden.

b Analyse von 300.000 E. coli BL21(DE3) Zellen, 4 h nach Induktion der Expression bei 37 °C von tmHisF-eGFP. Das FACS-Histogramm zeigt einen homogenen Peak, wobei 277.453 gezählte Ereignisse mit FL1>10 eine mittlere Fluoreszenz (mf) von mf = 1035,1 zeigen. Die 22.357 gezählten Ereignisse mit FL1<10 gehen auf Signalrauschen und Zellen mit fehlerhafter Expression zurück. Sie werden bei der Bestimmung des mittleren Fluoreszenzwerts der Zellen vernachlässigt.

Die Kalibrierung des Geräts mit Hilfe von fluoreszierenden Beads (Durchmesser: 6 µM) (AlignFlow^©, Invitrogen) erfolgte bei einer Photomultiplier-Spannung von 400 Volt für alle drei Detektoren (FSC, SSC und FL1). Der Strahlengang und der Tropfenabrisspunkt des MoFlo^© Zytometers wurden vor jedem Lauf justiert und fokussiert. Die Datenverwaltung erfolgte durch das Softwarepaket SUMMIT™ 3.1. Zur Reinigung nach jedem Lauf wurde das System für 15 min mit 1× PBS und anschließend für 15 min mit 70 % Ethanol über die Probenaufnahme gespült.

Analyse und Sortierung fluoreszierender Zellen erfolgte mit folgenden Einstellungen am MoFlo^© Zytometer:

Frequenz: 100.000 Hz (für 70 µm Düse)

Amplitude der Düse: 10–15 Volt (legt die Form der Tropfen fest) Spannung der elektrischen

Platten bei Sortierung: 2500 Volt

Photomultiplier-Spannung: FSC (Forward Scatter): 400 Volt SSC (Side Scatter): 750 Volt FL1 (Fluoreszenz): 600 Volt

Probendruck: 57–59 psi

Die Empfindlichkeit des Gerätes wird über den Threshold eingestellt, wobei das Hintergrundrauschen der Signal-Detektion niedrig gehalten werden muss. Dazu wird das Gerät so eingestellt, dass ca. 100 - 200 Ereignisse pro Sekunde gezählt werden, wenn über die Probenaufnahme nur 1× PBS (ohne Zellen) zugeführt wird.

Die zu vermessenden Zellen der E. coli-Kulturen mit eGFP-Fusionsproteinen (3.2.8.1) wurden in einem 5 ml Probenröhrchen so verdünnt, dass das Gerät üblicherweise 10.000 bis 15.000 Ereignisse (Zellen) pro Sekunde (eps) analysierte.

Zur Analyse der Fluoreszenzintensität von Expressionskulturen wurden stets jeweils 310⁵ Zellen vermessen. Bei Quantifizierung der mittleren Fluoreszenz (mf) der Zellen wurden Fluoreszenz-Ereignisse mit einem Signal kleiner als zehn vernachlässigt, da es sich hierbei um Hintergrundrauschen des Geräts oder E. coli - Zellen mit fehlerhafter Expression handelt (Abbildung 18). Die täglich neu durchgeführte Kalibrierung des Gerätes kann zur Verschiebung der Fluoreszenz identischer Kulturen an verschiedenen Tagen führen, weswegen alle in dieser Arbeit gezeigten Analysen innerhalb eines FACS-Histogramms stets parallel aufgenommen wurden.

Bei Sortierungen von Zellen wurden in der ersten Sortierungsrunde 10⁷-10⁸ Ereignisse analysiert. Diejenigen Zellen, deren Fluoreszenzintensität in einem zuvor definierten

Screening-Bereich lag, wurden in einem leeren Probenröhrchen gesammelt. Um die Qualität der Auslese zu erhöhen wurden die gesammelten Zellen ohne erneute Anzucht direkt nochmals im gleichen Screening-Bereich einer Sortierung unterzogen („Resort“). Die hierbei sortierten Zellen wurden in einem mit LB-Medium gefüllten Probenröhrchen aufgefangen, womit anschließend 50 ml LB-Selektivmedium angeimpft werden konnten. Nach Inkubation üN bei 37 °C im Schüttler mit 220 rpm konnte von dieser Mischkultur die Plasmid-DNA präpariert werden (3.3.7.1). Nach Transformation von frischen elektrokompetenten E. coli BL21(DE3) Zellen (3.2.4/3.2.6) mit dem so gewonnenen Plasmid-Gemisch und anschließender Expression der sortierten egfp-Fusionsvarianten (3.2.8.1) konnte die nächste Anreicherungsrunde durchgeführt werden. Dieser Zyklus wurde so lange wiederholt, bis eine ausreichende Anreicherung von Zellen im eingestellten Screening-Bereich erfolgt war. Diese wurden dann mit Hilfe der Cyclone Sortiereinheit auf LB-Selektivagarplatten vereinzelt, wobei nur mit einer Rate von 500 Ereignissen pro Sekunde sortiert wurde. Die LB-Selektivagarplatten wurden üN bei 37 °C inkubiert und anschließend bei 4 °C gelagert. Um sicherzustellen, dass keine Varianten während der Anreicherungszyklen verloren gehen, wurden in jeder neuen Runde mindestens 10x mehr Varianten analysiert als in der vorherigen Runde sortiert worden waren. Darüber hinaus wurde bei jedem Transformationsschritt die Anzahl der unabhängigen Transformanten über parallel ausplattierte Verdünnungsreihen bestimmt, um sicherzustellen dass mindestens 10x mehr Zellen transformiert wurden als in der vorherigen Runde sortiert worden waren (siehe 3.2.8.1). Im Anhang dieser Arbeit ist ein detailliertes Protokoll zur näheren Erläuterung der Vorgehensweise bei FACS-Sortierungen gezeigt (siehe 7.1; Abbildung A1). Darüber hinaus wird in 4.2.2 eine exemplarische Anreicherung stark fluoreszierender Zellen aus einem Zell-Gemisch dargestellt.