Das grün fluoreszierende Protein (GFP) wurde 1962 zum ersten Mal aus der Kristallqualle Aequorea victoria (Abbildung 3a) isoliert (Shimomura et al., 1962). Im Jahre 1994 gelang die Klonierung der cDNA, wodurch GFP molekularbiologischen und biochemischen Anwendungen zugänglich gemacht werden konnte (Chalfie et al., 1994). GFP besteht aus 238 Aminosäuren, besitzt ein Molekulargewicht von 28 kDa, und bildet als Tertiärstrukur ein -Fass aus elf antiparallelen -Strängen (Abbildung 3b) (Yang et al., 1996).
Es absorbiert Licht maximal bei Wellenlängen von 395 nm (UV) oder 475 nm (blau), woraufhin Licht mit einer Wellenlänge von λmax = 508 nm bzw. λmax = 503 nm (grün) emittiert wird (Heim et al., 1994; Tsien, 1998). Die in der Tiefsee in absoluter Dunkelheit lebende Qualle stellt das zur Anregung benötigte blaue Licht mit Hilfe des Photoproteins Aequorin selbst her (Abbildung 3b) (Morise et al., 1974). Aequorin bindet kovalent das Luciferin-Molekül Coelenterazin (Shimomura, 2005). Bei Bindung von Calciumionen erfolgt eine Konformationsänderung, woraufhin die kovalente Bindung zwischen Aequorin und Coelenterazin gespalten wird, Coelenterazin unter CO2-Abspaltung zu Coelentaramid abreagiert und Licht mit einer Wellenlänge von λmax = 470 nm (blau) freigesetzt wird (Shimomura, 2005).
Abbildung 3: Die Biolumineszenz der Kristallqualle Aequorea victoria durch Aequorin und GFP.
a Die Biolumineszenz der Kristallqualle Aequorea victoria findet nur in einem schmalen, grün leuchtenden Ring am Rand des Schirms statt, wo sich das GFP in sogenannten photophoren Zellen befindet (aus Veith & Veith, 2005). b GFP (pdb 1gfl) emittiert grünes Licht (max = 503 nm) nach Anregung mit blauem Licht. Dieses wird durch das Photoprotein Aequorin (pdb 1ej3) mit Hilfe von Ca2+ und eines kovalent gebundenen Coelenterazin-Moleküls erzeugt.
Bei GFP ist der Chromophor nicht wie bei Aequorin ein zusätzlich gebundenes Molekül, sondern wird von einem Teil der Polypeptidkette selbst gebildet. So liegt im Zentrum des -Fasses eine kurze -Helix, in deren Mitte die Aminosäuren Serin 65, Tyrosin 66 und Glycin 67 durch eine autokatalytische Zyklisierungs-Reaktion ein konjugiertes Elektronenresonanzsystem ausbilden (Abbildung 4) (Cubitt et al., 1995; Tsien, 1998).
Abbildung 4: Chromophor des GFP bestehend aus Ser65, Tyr66 und Gly67.
a Der Chromophor des GFP (pdb 1gfl) wird aus 3 Aminosäuren gebildet, die im Inneren des elfsträngigen -Fasses sitzen. In enhanced GFP (eGFP) ist Phe64 zu Leucin und Ser65 zu Threonin mutiert. b Mechanismus der Chromophor-Bildung in GFP nach Cubitt et al. (1995). Der erste Ring des Chromophors (p-Hydroxybenzylidenimidazolinon) wird durch eine autokatalytische Zyklisierung gebildet, wobei die Amidgruppe von Gly67 die Carbonylgruppe von Ser65 nukleophil angreift und anschließend H2O abgespalten wird (= Imidazolinon). Durch O2 wird die --Bindung von Tyr66 unter Bildung von H2O2 dehydriert, wodurch die phenolische Seitenkette in Konjugation mit dem Imidazolinonring gebracht wird. Das Elektronenresonanzsystem (grün) kann in einer protonierten (neutrales Phenol) und deprotonierten (Phenolat-Anion) Form vorliegen, was die beiden unterschiedlichen Anregungsmaxima von GFP erklärt.
Zur molekularbiologischen und biotechnologischen Nutzung von GFP wurden zahlreiche GFP-Derivate entwickelt, bei denen die Fluoreszenzeigenschaften und die Stabilität des Proteins variiert wurden (Tsien, 1998). So gibt es mittlerweile viele in ihrer Leuchtkraft modifizierte Versionen des GFP, die eine erhöhte Fluoreszenz aufweisen („enhanced GFP“ = eGFP: F64L+S65T) (Heim et al., 1995; Yang et al., 1996; Cormack et al., 1996; Patterson et al., 1997) bzw. blau („BFP“: Y66H), gelb („YFP“: F64L+S65G+T203Y) oder cyan („CFP“:
Y66W) leuchten (Shaner et al., 2007). Diese neuen GFP-Varianten können für FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) -Experimente benutzt werden, bei denen die Überlagerung des Emissionspektrums einer GFP-Variante (z.B. CFP) mit dem Anregungsspektrum einer anderen GFP-Variante (z.B. YFP) ausgenutzt wird (Tsien et al., 1993). Ein Beispiel für solche FRET-Experimente ist die Verwendung eines CFP-Calmodulin-YFP Fusionsproteins als Ca2+-Indikator. Hierbei kommt es nach Ca2+-Bindung zur Annäherung von CFP und YFP, weshalb die Emission des Fusionsproteins nach Anregung des CFP von cyan nach gelb umschlägt (Miyawaki et al., 1999).
Split-GFP- bzw. BiFC- („Bimolecular fluorescence complementation“) Systeme (siehe 1.3.2) werden bevorzugt zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen benutzt. Hierbei werden die potentiellen Interaktionspartner mit sich ergänzenden Hälften von GFP fusioniert und nur bei intakter Interaktion kann sich das fluoreszierende Protein rekonstituieren (Hu et al., 2002;
Hu & Kerppola, 2003; Hu et al., 2006; Barnard et al., 2008; Horvath et al., 2009).
Modifizierte GFP-Derivate werden daneben auch vielfach in der Zellbiologie angewendet zur Analyse von Genexpression (Chalfie et al., 1994) bzw. Gentransfer (Cheng et al., 1996;
Muldoon et al., 1997), zur Visualisierung von Proteinen, Zellkompartimenten bzw. Zell-Transportvorgängen (Yokoe & Meyer, 1996; Hanakam et al., 1996; DeGiorgi et al., 1996;
Straight et al., 1997; Presley et al., 1997; Grebenok et al., 1997) und zur Messung des intrazellulären pH-Wertes (Llopis et al., 1998) bzw. des Membranpotentials (Siegel & Isacoff, 1997). Zur selektiven bzw. induzierbaren Markierung stehen auch photoaktivierbare GFP-Derivate zur Verfügung (Patterson et al., 2004; Haigh et al., 2007;
Baltrusch et al., 2008). Aufgrund der beschriebenen enormen Bedeutung des grün fluoreszierenden Proteins für die Molekularbiologie, Biochemie und medizinische Forschung erhielten Osamu Shimomura, Marty Chalfie und Roger Tsien für die Entdeckung und Weiterentwicklung von GFP den Nobelpreis für Chemie 2008.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Variante von GFP verwendet, die u.a. die Austausche von eGFP (F64L und S65T) (Heim et al., 1995; Yang et al., 1996; Cormack et al., 1996;
Patterson et al., 1997) trägt. Durch diese beiden Austausche erfolgt aufgrund der Bevorzugung des Phenolat-Anions im Chromophor (Abbildung 4) eine Unterdrückung des Anregungsmaximums bei 395 nm, während das höherwellige Anregungsmaximum eine Rotverschiebung von 475 nach 488 nm erfährt und die Fluoreszenz-Emission stark erhöht wird (Heim et al., 1995; Cormack et al., 1996). So zeigt eGFP nach Anregung bei 488 nm eine 30-fach stärkere Fluoreszenz als das wildtypische GFP, wobei das Emissionsmaximum bei 507 nm liegt (Cormack et al., 1996). Die Fluoreszenz des eGFP kann somit optimal mit einem Argonlaser angeregt werden, weshalb es sich sehr gut für die Durchflusszytometrie eignet (Cormack et al., 1996). Neben diesen Mutationen trägt die in dieser Arbeit verwendete eGFP-Variante zusätzlich die sogenannten „Cycle-3“-Mutationen (F99S, M153T, V163A), welche die Faltungseigenschaften von GFP bei 37 °C verbessern und die Aggregationstendenz bei hohen Konzentrationen reduzieren (Crameri et al., 1996). Zusätzlich ist der weit verbreitete, neutrale Aminosäurenaustausch Q80R enthalten, der bei der ersten Klonierung durch einen PCR-Fehler eingeführt wurde (Chalfie et al., 1994). Die beschriebene eGFP-Variante wurde in der vorliegenden Arbeit, wie in Kapitel 1.2.2 erläutert, als Reporter für die Stabilität eines fusionierten Proteins in vivo benutzt, wobei die mit den verschiedenen Konstrukten transformierten E. coli-Zellen mit Hilfe eines MoFlo© Zytometers analysiert und sortiert wurden.