Klonierung von hgr-lbd Einzel- und Kombinationsvarianten in pER13a und pERN7

Die Klonierung der hgr-lbd Einzelvarianten in pERN7 wurde bereits in 4.3.4 beschrieben. Die Klonierung der entsprechenden pER13a_hgr-lbd Konstrukte wurde analog hierzu durchgeführt, wobei jedoch pER13a_hgr-lbd bei den jeweiligen Amplifikationsschritten als Templat diente und 5‟pER13 bzw. 3„pER13 als genflankiernder Primer bei der Megaprimer-PCR bzw. der finalen Amplifikation des Volllängengens benutzt wurden.

Die hgr-lbd Kombinationsvarianten wurden hergestellt, indem sukzessive zusätzliche Mutationen in lbd(F602S) bzw. pER13a_hgr-lbd(F602S) und pERN7_hgr-lbd(A605V) bzw. pER13a_hgr-pERN7_hgr-lbd(A605V) durch Megaprimer-PCR (3.3.3.1) eingeführt wurden. Der Megaprimer wurde hierbei stets mit einem mutagenen Primer, welcher einen oder mehrere Austausche beinhaltete (3‟hgr-lbd (M560K), 3‟hgr-lbd (A605V), 3‟hgr-lbd (F602S+A605V), 5‟hgr-lbd (V702A), 5‟hgr-lbd (E705G), 5‟hgr-lbd (V702A+E705G)) und einem genflankierenden Primer (bei pER13a: 5‟pER13 bzw. 3„pER13; bei pERN7: pERN7up bzw. T7 Terminator) mittels PCR (3.3.1) amplifiziert, wobei zuerst die oben genannten Vektoren und dann sukzessive die pERN7_hgr-lbd bzw. pER13a_hgr-lbd Konstrukte mit den zuvor eingefügten Austauschen als Templat dienten. Die Volllängen-Gene wurden anschließend mit Hilfe des aus einem Agarosegel aufgereinigten (3.3.5) Megaprimers und des entsprechenden genflankierenden Primers (bei pER13a: 5‟pER13 bzw. 3„pER13; bei pERN7:

pERN7up bzw. T7 Terminator) mit Hilfe desselben Templats wie zuvor durch PCR amplifiziert. Mittels der Restriktionsenzyme NdeI und NotI konnten die erhaltenen mutagenisierten Gene jeweils in pERN7 bzw. pER13a kloniert werden und dienten dann als Templat für die nächste Megaprimer-PCR, bei welcher ein neuer Austausch hinzugefügt werden konnte. Nach jeder Klonierung wurde die Nukleotidsequenz durch Sequenzierung mit vektorspezifischen Primern (bei pER13a: 5‟pER13 bzw. 3„pER13; bei pERN7: pERN7up bzw. T7 Terminator) bestätigt.

4.3.5.2 Analyse der Fluoreszenz von E. coli durch die eGFP-fusionierten hGR-LBD Einzel- und Kombinationsvarianten

Der spezifische Einfluss von M560K, F602S, A605V, V702A, E705G bzw. M752T auf die Fluoreszenz in vivo von hGR-LBD-eGFP wurde nun im Detail analysiert. Hierzu wurden die in 4.3.5.1 hergestellten pER13a_hgr-lbd Einzel- und Kombinationsvarianten in frisch hergestellte E. coli BL21(DE3) Zellen (3.2.4) transformiert (3.2.6), woraufhin die Expression bei 30 °C nach Zugabe von 500 µM Dexamethason für 6 h mit 0,5mM IPTG induziert wurde (3.2.8.1). Die Fluoreszenz der Expressionskulturen wurde mit Hilfe von Fluoreszenz-Mikroskopie (3.2.10) und Durchflusszytometrie (3.2.9) charakterisiert. Um auch sehr kleine Unterschiede in der Fluoreszenz eindeutig bestimmen zu können, wurde bei der FACS-Analyse jede Probe dreimal ausgezählt. Nach Bestimmung der mittleren Fluoreszenz der Proben (FL1>10) wurde nur der Medianwert der drei Analysen und das dazugehörige FACS-Histogramm weiter verwendet.

Die Analyse der verschiedenen Expressionskulturen zeigte, dass die Einführung von F602S, A605V, V702A, E705G bzw. M752T in hGR-LBD-eGFP jeweils zu einer Erhöhung der Fluoreszenz führt, wobei die positiven Effekte additiv wirken (Abbildung 52a). Durch Kombination der neu identifizierten Austausche A605V, V702A, E705G und M752T, welche die lösliche Herstellung von hGR-LBD in E. coli verbessern (4.3.4.), konnte so die mittlere Fluoreszenz (mf) der Expressionskulturen von 83,8 auf 122,9 relative Fluoreszenz-Einheiten erhöht werden (Abbildung 51a, 52a). Die zusätzliche Einführung der bekannten F602S Mutation (Bledsoe et al., 2002) in die Kombinationsvariante führte zu einer weiteren Fluoreszenz-Steigerung (mf = 132,8, Abbildung 51b). Die stärkere Fluoreszenz der Zellen kann in beiden Varianten auf eine Erhöhung der Fluoreszenz in der löslichen Zellfraktion zurückgeführt werden, was durch ein stärker fluoreszierendes Cytoplasma dokumentiert wird (Abbildung 51a,b). Somit spiegelt hier die Fluoreszenz des C-terminal fusionierten Reporters eGFP die erhöhte Löslichkeit des Proteins sehr gut wider. Im Gegensatz dazu führt die

Einführung von M560K in hGR-LBD-eGFP zwar auch zu einer Verstärkung der Zell-Fluoreszenz auf mf = 148,0 (einzeln) bzw. mf = 150,6 (in Kombination mit F602S+A605V+M752T), allerdings durch Erhöhung der Fluoreszenz der inclusion bodies, welche an den Zell-Polen abgelagert werden (Abbildung 51c,d). Dies erklärt weshalb M560K einerseits in hGR-LBD-eGFP A8 zusammen mit A605V zu einer starken Erhöhung der Fluoreszenz führt (4.3.2.2), andererseits aber die lösliche Herstellung von hGR-LBD in E. coli nicht verbessert (4.3.4). Somit repräsentiert die Mutation M560K neben Verkürzungen auf Genebene (siehe 4.3.2.1, 4.3.2.2) oder Proteinebene (siehe 4.3.4) eine weitere Ursache falsch positiver Artefakte im eGFP-Reportersystem. Hierbei kommt es nicht durch lösliches eGFPwt, sondern durch erhöhte Fluoreszenz des unlöslichen hGR-LBD-eGFP Proteins zu einem falsch positiven Signal. Die Ursache für diesen Effekt ist unklar, wobei in der Literatur unterschiedlich starke Aktivität von Proteinen in inclusion bodies bereits mehrfach beschrieben worden ist (Ventura & Villaverde, 2006).

Abbildung 51: FACS-Analyse und Fluoreszenz-Mikroskopie von Zellen mit hGR-LBDwt (schwarz;

mittlere Fluoreszenz (mf): 83,8) im Vergleich zu Zellen mit hGR-LBD Einzel- und Kombinationsvarianten, nach Expression bei 30 °C in Anwesenheit von Dexamethason.

Die Expression der egfp-fusionierten Gene erfolgte jeweils in E. coli BL21(DE3), für 6 h bei 30 °C in Anwesenheit von 500 µM Dexamethason. Bei der Durchflusszytometrie wurden jeweils 300.000 Ereignisse analysiert. Die Fluoreszenz-Mikroskopie wurde bei allen Expressionskulturen an einem Zeiss Axiovert 200M Mikroskop bei konstanter Belichtungsdauer (100 ms) durchgeführt.

hGR-LBD(A605V+V702A+E705G+M752T) (a, magenta) bzw. hGR-LBD(F602S+A605V+V702A+E705G+

M752T) (b, orange) zeigen eine erhöhte mittlere Fluoreszenz (mf) von 122,9 bzw. 132,8 im Vergleich zu hGR-LBDwt (mf = 83,8) durch eine stärkere Fluoreszenz im Cytoplasma (= lösliche Zellfraktion). Die Einführung der

Mutation M560K führt vereinzelt (c, hellgrün), aber auch in Kombination mit vorteilhaften Mutationen (d, dunkelgrün) zu einer hohen mittleren Fluoreszenz von 148,0 bzw. 150,6 durch eine Steigerung der

Fluoreszenz in den inclusion bodies (= unlösliche Zellfraktion).

Anders als bei der Verkürzung des Zielproteins auf Genebene (4.3.2.1, 4.3.2.2) oder Proteinebene (4.3.4) können solche Artefakte nicht durch Überprüfung der korrekten Länge des Gens (Abbildung 45) bzw. des Proteins (Abbildung 50) erkannt werden. Um sie dennoch zügig identifizieren zu können, sollten bei zukünftigen Experimenten die sortierten Varianten sofort nochmals in E. coli exprimiert und mit Hilfe von Fluoreszenz-Mikroskopie die Lokalisation der erhöhten Fluoreszenz (Cytoplasma = lösliches Protein; Zell-Pole = unlösliche inclusion bodies) überprüft werden.

Abbildung 52: Mittlere Fluoreszenz von E. coli in der Durchflusszytometrie durch (a) gezielt hergestellte Einzel- und Kombinationsvarianten von hGR-LBD-eGFP und (b) durch FACS angereicherte Populationen (links) bzw. sortierte Varianten (rechts).

Die Expression der egfp-fusionierten Gene erfolgte jeweils in E. coli BL21(DE3), für 6 h bei 30 °C nach Zugabe von 500 µM Dexamethason. Es wurden jeweils 300.000 Ereignisse analysiert. Alle hier gezeigten Werte sind Medianwerte von drei Messungen und wurden parallel bei konstanter Kalibrierung des MoFlo^© Zytometers aufgenommen.

a Mittlere Fluoreszenz von E. coli, vermittelt durch hGR-LBD-eGFP Einzel- und Kombinationsvarianten. Die in den FACS-Histogrammen in Abbildung 51 gezeigten Varianten sind farbig unterlegt bzw. mit der entsprechenden Abbildungsnummerierung versehen. Die Austausche die zu einer tatsächlich verbesserten löslichen Herstellung von hGR-LBD in E. coli führen (4.3.4) - F602S (Bledsoe et al., 2002) und A605V, V702A, E705G und M752T (in dieser Arbeit identifiziert: 4.3.2.2, 4.3.4) - führen zu einer additiven Verbesserung der hGR-LBD-eGFP vermittelten Fluoreszenz in vivo. Die falsch positive Mutation M560K führt zu einer ungewöhnlich hohen Fluoreszenz der inclusion bodies (Abbildung 51c,d), was durch gepunktete Pfeile angedeutet ist.

b Mittlere Fluoreszenz von E. coli, vermittelt durch FACS-Anreicherungen bzw. sortierte hGR-LBD-eGFP Varianten aus 4.3.2.2. Die FACS-Anreicherungen bzw. die sortierten hGR-LBD-eGFP Varianten A5-1 - A5-3 und A8 aus denen die Austausche M560K, A605V, V702A, E705G und M752T identifiziert wurden, führen zu deutlich höherer Fluoreszenz als die vereinzelten bzw. neu kombinierten Austausche (in a gezeigter Fluoreszenzbereich ist grau hinterlegt).

Um die eGFP Einzel- und Kombinationsvarianten mit den sortierten hGR-LBD-eGFP Varianten A5-1 - A5-3 und A8, aus denen die untersuchten Mutationen identifiziert wurden, vergleichen zu können, wurden diese Varianten, die hGR-LBD Banken 1+2 und die daraus resultierten hGR-LBD-eGFP Anreicherungen parallel mit den Einzel- und Kombinationsvarianten auf gleiche Weise bei konstanter Kalibrierung des MoFlo^© Zytometers analysiert (Abbildung 52b). Dieser Vergleich macht deutlich, dass die ursprüngliche Zusammensetzung der Mutationen in den sortierten hGR-LBD-eGFP Varianten A5-1 - A5-3 und A8 zu einer wesentlich höheren Fluoreszenz führt, als dies bei Vereinzelung bzw. Neu-Kombination der positiven Mutationen A605V, V702A, E705G und M752T in hGR-LBD-eGFP der Fall ist (Abbildung 52). Dieses Phänomen wird vermutlich durch synergistische Wechselwirkungen der Mutationen in hGR-LBD-eGFP A5-1 - A5-3 und A8 (siehe Tabelle 12), sowie durch Mutationen wie M560K, welche zu einer falsch positiven Verstärkung des Fluoreszenz-Signals führen, hervorgerufen.

4.3.5.3 Quantitative Analyse der löslichen Herstellung der hGR-LBD Einzel- und