Charakterisierung der angereicherten hGR-LBD Varianten

4.3.3.1 Analyse der Löslichkeit der angereicherten hGR-LBD Varianten in vivo mit Hilfe der Chloramphenicol-Acetyltransferase als Reporter

Um zu überprüfen, ob die verbesserte Fluoreszenz der sortierten Varianten auf eine veränderte Wechselwirkung mit eGFP zurückgeht und somit möglicherweise ein falsch positives Ergebnis darstellt, sollte die Löslichkeit in vivo mit Hilfe eines anderen Reporterproteins nochmals überprüft werden. Hierbei wurde die Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) benutzt, die bereits in anderen Arbeiten (Maxwell et al.; 1999; Sieber et al., 2001; Seitz, 2006) erfolgreich als Faltungsreporter eingesetzt wurde. Zunächst wurde ein neuer cat-Fusionsvektor pER13cat (2.8.1.2.3) konstruiert, welcher analog zum egfp-cat-Fusionsvektor pER13a aufgebaut ist. Hierzu wurde die kodierende Sequenz für CAT (inklusive des Linkers GGRLEAAR) mit den Primern 5‟cat(NotI) und 3‟cat(XhoI) aus dem Templat pCFN1 (2.8.3, Maxwell et al., 1999) mittels PCR (3.3.1) amplifiziert. Das erhaltene Produkt konnte anschließend über die Restriktionsschnittstellen NotI und XhoI in pER13a eingefügt werden,

wodurch egfp durch cat ersetzt wurde. Anschließend wurden tmhisF (Positivkontrolle), hgr-lbdwt, hgr-lbd(F602S) und die Varianten hgr-lbd A5-1 - A5-4 über die

Restriktionsschnittstellen NdeI und NotI jeweils aus pER13a bzw. pER13b in pER13cat umkloniert.

Frisch hergestellte elektrokompetente (3.2.4) E. coli T7 Express Zellen (2.7) wurden mit den verschiedenen pER13cat-Konstrukten transformiert (3.2.6). Nach Induktion der Expression mittels 0,5 mM IPTG in Anwesenheit von Dexamethason wurden sie auf LB-Agarplatten mit unterschiedlichen Konzentrationen an Chloramphenicol (0 – 800 µg/ml) ausplattiert und das Wachstum bei 30 °C für 85 h verfolgt (3.2.8.2). Die LB-Agarplatten enthielten kein Dexamethason, da dieses in Ethanol gelöst ist, was in den Platten zu einer Hemmung des Kolonie-Wachstums führte (Daten nicht gezeigt). In Abbildung 47 ist das Wachstumsverhalten bei einigen Chloramphenicol-Konzentrationen exemplarisch dargestellt und in Tabelle 13 sind alle Ergebnisse zusammengefasst.

Abbildung 47: Wachstum von transformierten E. coli T7 Express Zellen auf LB-Platten in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen an Chloramphenicol.

Mit leerem pER13cat-Vektor transformierte Zellen können nur bei 0 µg/ml Chloramphenicol wachsen. Zellen mit sehr löslichem tmHisF-CAT zeigen starkes Wachstum bei allen Chloramphenicol-Konzentrationen. Die durch hGR-LBD-CAT Varianten vermittelte Chloramphenicol-Resistenz unterscheidet sich folgendermaßen:

WT < F602S < A5-2 < A5-1 < A5-3 < A5-4.

Tabelle 13: Wachstum von transformierten E. coli T7 Express Zellen auf LB-Platten in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen an Chloramphenicol.

LB-Platten ohne Chloramphenicol enthielten 75 µg/ml Kanamycin. ++++ bis +: relatives Maß für die Anzahl und Größe der Kolonien; K.: gezählte Einzelkolonien; - : kein deutliches Wachstum nach 85 h bei 30 °C.

l e e r tmhisF wt F602S A5-1 A5-2 A5-3 A5-4

Die Negativ- bzw. Positivkontrolle pER13cat_leer bzw. pER13cat_tmhisF, bei der kein Protein bzw. das sehr lösliche und thermostabile tmHisF als CAT-Fusion in den Zellen hergestellt wird, führt zu nahezu keinem Wachstum bzw. zu Wachstum bis 800 µg/ml Chloramphenicol (Abbildung 47, Tabelle 13). Der neu hergestellte pER13cat-Vektor eignet sich demnach als cat-Fusionsvektor für die Analyse der Proteinlöslichkeit in vivo.

Die Proteine LBDwt-CAT / LBD(F602S)-CAT / LBD A5-1-CAT / hGR-LBD A5-2-CAT / hGR-hGR-LBD A5-3-CAT / hGR-hGR-LBD A5-4-CAT befähigen die Zellen unter

den genannten Bedingungen auf Medium mit bis zu

240 µg/ml / 320 µg/ml / 400 µg/ml / 400 µg/ml / 400 µg/ml / 600 µg/ml Chloramphenicol zu wachsen (Abbildung 47, Tabelle 13). Somit zeigen E. coli T7 Express Zellen, welche die aus dem eGFP-Reportersystem erhaltenen hGR-LBD Varianten A5-1 - A5-4 oder die bekannte Variante hGR-LBD(F602S) (Bledsoe et al., 2002) als CAT-Fusionsproteine herstellen eine höhere Chloramphenicol-Resistenz als Zellen mit hGR-LBDwt-CAT.

Die verbesserte Löslichkeit in vivo von hGR-LBD(F602S) bzw. von hGR-LBD A5-1 - A5-4 kann also mit Hilfe der Chloramphenicol-Acetyltransferase als C-terminal fusioniertes Reporterprotein ebenfalls dargestellt werden. Dadurch kann ausgeschlossen werden, dass die verbesserte Fluoreszenz der in 4.3.2.2 isolierten eGFP-fusionierten hGR-LBD Varianten auf eGFP-abhängige Effekte zurückgeht.

4.3.3.2 Expression der angereicherten hgr-lbd Varianten in Abwesenheit von Reporterprotein

Um hGR-LBDwt, hGR-LBD(F602S) und die in 4.3.2.2 isolierten hGR-LBD Varianten A5-1 - A5-4 und A8 ohne eGFP oder CAT- Fusion herstellen zu können, wurden die

kodierenden Sequenzen mit Hilfe der Restriktionsschnittstellen NdeI und NotI aus pER13b bzw. pER13a in pER14 (2.8.1.2.2) umkloniert. Bei pER14-Kontrukten wird nach Genexpression den Proteinen C-terminal ein His6-Tag angefügt. Probeexpressionen der hergestellten pER14_hgr-lbd Konstrukte in E. coli BL21(DE3) bei 20 °C in Anwesenheit von Dexamethason (3.4.1.1) zeigten, dass keine der hGR-LBD Varianten in der löslichen Zellfraktion der Zellen zu finden war (Daten nicht gezeigt). Da in der Literatur bereits beschrieben wurde, dass auch die bekannte hGR-LBD(F602S) Variante nur als Glutathion-S-Transferase (GST) –Fusionsprotein löslich hergestellt werden kann (Bledsoe et al., 2002), wurden alle Varianten in den his6-gst-Fusionsvektor pERN7 (2.8.1.2.4, Abbildung 11) umkloniert. Hierzu wurden die kodierenden Sequenzen mit den Primern 5‟pER13 und 3‟hgr-lbd (NotI/Stop) mittels PCR (3.3.1) amplifiziert, wobei die jeweiligen pER13a_hgr-3‟hgr-lbd bzw.

pER13b_hgr-lbd-Konstrukte als Templat dienten. Die erhaltenen Produkte konnten anschließend über die Restriktionsschnittstellen NdeI und NotI in pERN7 eingefügt werden.

Daneben wurden neue hgr-lbd Konstrukte in pERN7 hergestellt, bei denen der bekannte Austausch für F602S zusätzlich in die Sequenzen der sortierten Varianten eingebracht wurde.

Dies erfolgte über Megaprimer-PCR (3.3.3.1). Der Megaprimer wurde mit einem mutagenen Primer (3‟hgr-lbd(F602S) bzw. 3„hgr-lbd(F602S+A605V)), und pERN7up mittels PCR (3.3.1) amplifiziert, wobei jeweils pERN7_hgr-lbd A5-1 - A5-4 bzw. pERN7_hgr-lbd A8 als Templat diente. Das Volllängen-Gen wurde anschließend jeweils durch den aus einem Agarosegel aufgereinigten (3.3.5) Megaprimer und 3‟hgr-lbd (NotI/Stop) mit Hilfe desselben Templats wie zuvor durch PCR amplifiziert. Mittels der Restriktionsenzyme NdeI und NotI konnten die erhaltenen mutagenisierten Gene wieder in pERN7 kloniert werden.

Die so hergestellten pERN7_hgr-lbd Konstrukte, bei denen die in Tabelle 12 (siehe 4.3.2.2) aufgelisteten hgr-lbd Sequenzen mit und ohne die für F602S kodierende Mutation vorliegen, wurden in E. coli BL21(DE3) bei 20 °C in Anwesenheit von Dexamethason exprimiert (3.4.1.1). Die lösliche Zellfraktion wurde anschließend über Nickel-Sepharose gereinigt, um eindeutige Aussagen über die Menge an löslichem Ziel-Protein treffen zu können. Diese Analysen zeigten eindeutig, dass das wildtypische Protein und alle fünf neuen hGR-LBD Varianten A5-1 - A5-4 und A8 im Gegensatz zur bekannten Variante hGR-LBD(F602S) unter diesen Bedingungen vollständig unlöslich in E. coli hergestellt werden. Auch die Einführung von F602S in die neuen Varianten führte zu keiner Verbesserung (Abbildung 48). Vielmehr wurde der vorteilhafte Effekt dieser Mutation durch die anderen Austausche aufgehoben.

Abbildung 48: Analytische Herstellung His₆-GST-fusionierter hGR-LBD Varianten in E. coli BL21(DE3), dokumentiert durch SDS-PAGE (12,5 %).

P: unlösliche Zellfraktion (Pellet), C: lösliche Zellfraktion (crude extract), C*: über Nickel-Sepharose gereinigte lösliche Zellfraktion. Die Expression erfolgte jeweils in E. coli BL21(DE3), üN bei 20 °C nach Zugabe von 500 µM Dexamethason. Es ist nur der 45-66 kDa Bereich des SDS-PA Gels gezeigt, in welchem sich His₆ -GST-hGR-LBD (Molekulargewicht: ~58 kDa) befindet. Bei der Darstellung von Variante A5-3 wurden zwei SDS-Gele zusammengefügt. hGR-LBD(F602S) zeigt im Gegensatz zum Wildtyp und allen anderen Varianten eine deutliche Bande in C*.

Die durch eGFP- (4.3.2.2) bzw. CAT-Fusion (4.3.3.1) dokumentierte verbesserte Löslichkeit der sortierten hGR-LBD Varianten kann somit nicht mehr beobachtet werden, sobald die C-terminal fusionierten Reporterproteine entfernt werden: weder mit C-C-terminalem His6-Tag noch mit N-terminalem His6-GST-Tag können die Varianten löslich in E. coli hergestellt werden. Die hohe Anzahl an Aminosäurenaustauschen (5-9) in den fünf sortierten hGR-LBD Varianten könnte eine Ursache für dieses Problem darstellen. Die vorliegenden Ergebnisse lassen vermuten, dass zumindest einige der Austausche in hGR-LBD zu einer Erhöhung der eGFP-Fluoreszenz bzw. der CAT-Aktivität führen, ohne die Löslichkeit der jeweiligen Fusionsproteine zu verbessern. Alternativ könnte ein Teil der Mutationen zu einer Verbesserung der Löslichkeit der eGFP- bzw. CAT-Fusionsproteine führen, welche jedoch an den Kontext der beiden Reporter gebunden ist und sich somit im His6-GST-hGR-LBD Fusionsprotein nicht ausprägt. Um solche Mutationen auszusortieren und um Mutationen aus hGR-LBD A5-1 - A5-4 und A8 identifizieren zu können, welche ebenfalls in hGR-LBD ohne fusioniertes Reporterprotein zu erhöhter Löslichkeit führen, wurden im Folgenden 14 der 30 Mutationen einzeln analysiert.

4.3.4 Einzel-Analyse von Mutationen aus hGR-LBD A5-1 - A5-4 und hGR-LBD A8