4.3 Erhöhung der Löslichkeit und der Stabilität von hGR-LBD durch gelenkte
4.3.5.5 Konformationelle Stabilität der hGR-LBD Einzel- und Kombinationsvarianten
die konformationelle Stabilität von hGR-LBD zu untersuchen, wurden die in Tabelle 14 aufgelisteten hGR-LBD Einzel- und Kombinationsvarianten in Anwesenheit von gebundenem Agonisten (Dexamethason) bzw. Antagonisten (Mifepriston) thermisch aufgefaltet (3.5.10) (Abbildung 57). In Abwesenheit eines Liganden ist hGR-LBD sehr instabil und kann nicht aufgereinigt bzw. untersucht werden (siehe 4.3.5.7). Aus den Auffaltungskurven konnte für jede hGR-LBD Variante eine apparente Schmelztemperatur (TMapp
= Temperatur bei der die Hälfte des Proteins in nicht-nativem Zustand vorliegt) bestimmt werden (3.5.10), welche als operationelles Maß für die Proteinstabilität diente (Tabelle 15). Da das wildtypische hGR-LBD Protein nicht aufgereinigt werden kann und somit auch die Bestimmung seines TMapp – Wertes nicht möglich war, wurden die Effekte der einzelnen Mutationen aus dem Vergleich der verschiedenen Einzel- und Kombinationsvarianten abgeleitet.
Die gemessenen bzw. abgeleiteten TMapp-Werte zeigten, dass die vorteilhaften Mutationen F602S (Bledsoe et al., 2002) bzw. A605V, V702A, E705G und M752T (4.3.2.2, 4.3.4), welche bereits die Fluoreszenz in vivo von hGR-LBD-eGFP (4.3.5.2) und die lösliche Herstellung von hGR-LBD (4.3.5.3, 4.3.5.4) deutlich verbessern, vereinzelt und additiv auch die konformationelle Stabilität von hGR-LBD erhöhen. Hierbei führt die Kombination der im Rahmen dieser Arbeit identifizierten Austausche (A605V+V702A+E705G+M752T) zu einer Stabilisierung der Agonist-Konformation von +8,3 °C und der Antagonist-Konformation von +8,2 °C. Der bekannte Austausch F602S stabilisiert die Agonist- bzw. die Antagonist-Konformation des Proteins um +4,5 °C bzw. um +5,0 °C.
Abbildung 57: Thermische Auffaltungen der hGR-LBD Einzel- und Kombinationsvarianten.
Die Auffaltungen aller Proteine erfolgte mit einer Rate von 1 °C/min von 30 °C bis 70 °C in 25 mM Tris/Cl,
0,1 M NaCl, 2 mM TCEP, 10 % Glycerin (pH 7,9 bei RT; pH 7,8 - 6,6 bei 30 - 70 °C, da
pKa/°C(Tris) = -0,028, Mandaji et al., 2009) und wurde durch CD Spektroskopie bei 220 nm verfolgt.
Zu den Ansätzen wurde zusätzlich entweder der Agonist Dexamethason (200 µM; Proteinkonzentration: 10 µM) (a/c) oder der Antagonist Mifepriston (50 µM; Proteinkonzentration: 2,5 µM) (b/d) zugegeben. Aufgrund der niedrigen Löslichkeit von Mifepriston in wässrigem Puffer wurde in diesen Ansätzen eine niedrigere Proteinkonzentration eingesetzt, um die vollständige Sättigung des Proteins mit dem Liganden garantieren zu können (KD(Mifepriston) < 1 nm; Jung-Testas et al., 1983). Um das so verschlechterte CD-Signal - Rausch Verhältnis des Proteins zu optimieren wurden die Auffaltungen mit Mifepriston mindestens dreimal durchgeführt und gemittelt.
a/b Auffaltungskurven von hGR-LBD Einzel- und Kombinationsvarianten mit Aminosäuremutationen, welche im Rahmen dieser Arbeit identifiziert wurden (A605V, V702A, E705G und M752T). Die Auffaltungen wurden in Anwesenheit des Agonisten Dexamethason (a) oder des Antagonisten Mifepriston (b) durchgeführt.
c/d Auffaltungskurven von hGR-LBD Einzel- und Kombinationsvarianten, welche F602S (Bledsoe et al., 2002) enthalten. Die Auffaltungen wurden in Anwesenheit des Agonisten Dexamethason (c) oder des Antagonisten Mifepriston (d) durchgeführt.
Tabelle 15: Apparente TM-Werte (TMapp) der hGR-LBD Einzel- und Kombinationsvarianten.
Die durch die eingeführten Mutationen induzierten Veränderungen des TMapp von hGR-LBD wurde durch den Vergleich der TMapp-Werte verschiedener hGR-LBD Varianten ermittelt (verwendete Varianten sind in Klammern angegeben). Falls der Effekt einer Mutation von mehreren Vergleichen abgeleitet werden konnte, wird ein Mittelwert und die Maximal-Abweichung von diesem angegeben.
Während F602S, A605V, V702A bzw. E705G hGR-LBD sowohl mit gebundenem Dexamethason (Agonist) als auch mit gebundenem Mifepriston (Antagonist) stabilisieren, führt M752T nur in Anwesenheit des Agonisten zu einer Erhöhung des TMapp
-Wertes. Das Screening der hGR-LBD-eGFP Banken, durch welches die neuen positiven Mutationen identifiziert worden sind, erfolgte in Anwesenheit von Dexamethason (4.3.2.2). Es bestätigt sich hier somit einmal mehr die Beobachtung, dass bei gelenkter Evolution von Proteinen im Labor in allerster Linie solche Mutationen gefunden werden, welche unter den angelegten Bedingungen den untersuchten Effekt bewirken („you get what you screen for“;
Arnold & Moore, 1997). Somit ist es eher erstaunlich, dass A605V, V702A und E705G beide Konformationen des Proteins stabilisieren. Mögliche Ursachen für die durch die einzelnen Mutationen vermittelte Stabilisierung von hGR-LBD werden in 4.3.5.8 näher besprochen.
+Agonist
8 A605V+M752T+V702A+E705G 54,4°C 56,8°C
hGR-LBD Varianten mit F602S
Die falsch positive Mutation M560K, welche zu hoher Fluoreszenz von hGR-LBD-eGFP inclusion bodies in E. coli (4.3.5.2) jedoch zu keiner erhöhten Löslichkeit von His6 -GST-hGR-LBD führt (4.3.5.3), destabilisiert -GST-hGR-LBD deutlich um -6,1 °C (Agonist-Konformation) bzw. -2,0 °C (Antagonist-(Agonist-Konformation). Die erhöhte Fluoreszenz von inclusion bodies in E. coli stellt in diesem Fall somit keine erhöhte „konformationelle Qualität“ des aggregierten Proteins dar, wie dies in anderen Publikationen angedeutet wird (Garcia-Fruitos et al., 2007).
Abgesehen von M560K korrelieren die ermittelten TMapp
-Werte der verschiedenen hGR-LBD Einzel- und Kombinationsvarianten gut mit der durch die entsprechenden hGR-LBD-eGFP Varianten erzeugten mittleren Fluoreszenz von E. coli (4.3.5.2) (Abbildung 58). Die Fluoreszenz des C-terminal fusionierten eGFP-Reporters in vivo spiegelt in diesem Fall somit nicht nur die Löslichkeit der hGR-LBD Varianten (siehe 4.3.5.3, Abbildung 54) sondern auch deren konformationelle Stabilität wider.
Abbildung 58: Korrelation zwischen der hGR-LBD-eGFP vermittelten Fluoreszenz in E. coli und der konformationellen Stabilität von gereinigtem hGR-LBD (Agonist-Konformation).
Die durch hGR-LBD-eGFP vermittelte mittlere Fluoreszenz von E. coli nach Genexpression in Anwesenheit von Dexamethason wurde durch Durchflusszytometrie analysiert (siehe 4.3.5.2, Abbildung 52). Die Stabilität der Agonist-Konformation der hGR-LBD Varianten wurde durch thermische Auffaltung in Anwesenheit von Dexamethason bestimmt, woraus apparente TM-Werte abgeleitet werden konnten (Abbildung 57, Tabelle 15).
Gefüllte Kreise: Bei den untersuchten hGR-LBD Einzel- und Kombinationsvarianten besteht eine Korrelation zwischen der Fluoreszenz in vivo von hGR-LBD-eGFP und der Stabilität des entsprechenden hGR-LBD Proteins (linearer Fit: r2 = 0,84). Leerer Kreis: die hGR-LBD Variante mit der Mutation M560K stellt einen Ausreißer dar, da bei ihr die Fluoreszenz der unlösliches Fusionsprotein enthaltenden inclusion bodies stark erhöht ist (siehe 4.3.5.2, Abbildung 51), welche aus instabilen und aggregierten Proteinspezies bestehen.
Zusammenfassend kann somit festgestellt werden, dass die Fluoreszenz von eGFP in vivo sehr gut als Reporter für die Löslichkeit und die konformationelle Stabilität eines N-terminal fusionierten Zielproteins verwendet werden kann. Allerdings müssen beim Screening von eGFP-fusionierten Banken die bereits beschriebenen Ursachen für falsch positive Artefakte (Verkürzungen auf Genebene durch neu eingeführte Stoppcodone bzw. Verlust des Zielgens:
siehe 4.3.2.1 bzw. 4.3.2.2; Verkürzungen auf Proteinebene durch neu eingeführte Proteolyse-Anfälligkeit: siehe 4.3.4; Erhöhung der inclusion body-Fluoreszenz: siehe: 4.3.5.2) berücksichtigt werden und solche Klone nach der FACS-Anreicherung von fluoreszierenden E. coli Zellen durch Kolonie-PCR (3.3.2), Sequenzierung (3.3.10), Probeexpression (3.4.1.1) und Fluoreszenz-Mikroskopie (3.2.10) ausgeschlossen werden.