B. EINLEITUNG
5. Nachweis gentechnisch veränderter Organismen und ihrer Produkte in Lebensmitteln
5.3. Ergebnisse
5.3.3. Protein-Nachweis (PAT) in gentechnisch veränderten Zuckerrüben (LL- T120-7) über
Auch wenn der Nachweis der DNA mit Hilfe der PCR für den Nachweis der gentechnischen Veränderung i.d.R.
ausreicht, wurde am Beispiel der Phosphinothricin-resistenten Zuckerrübe der Nachweis der gentechnischen Veränderung auch auf Protein-Ebene mit Hilfe eines ELISA-Tests durchgeführt. Entsprechend der in Kap. B-5.2.7 beschriebenen Methode wurden die Zuckerrüben-Blätter aufgearbeitet und das im Proteinextrakt enthaltende PAT-Enzym nachgewiesen. Auch in diesem Fall wurden Blattmaterial verwendet, das von Pflanzen aus dem Jahre 1995-1999 stammte. Als Negativkontrollen wurde Wasser und Agrobacterium tumefaciens EHA 18AC5 verwendet, welches das Plasmid enthält, mit dem die Zuckerrüben ursprünglich transformiert wurden.
Hierzu wurden die Bakterien direkt von der LB-Platte abgestrichen, mit 150 µl Extraktionspuffer versetzt und gemischt.
Probe OD Probe OD
Standard 1 0,098 ZR-LL (T 120-7) 1995 1,151
Standard 2 0,089 ZR-LL (T 120-7) 1996 1,075
Standard 3 0,107 ZR-LL (T 120-7) 1997 1,149
Standard 4 0,144 ZR-LL (T 120-7) 1998 1,195
Standard 5 0,206 ZR-LL (T 120-7) 1999 1,072
Standard 6 0,262 Negativkontr. (Wasser) 0,088
Standard 7 0,286 Negativkontr. (Agrobacterium) 0,058
Standard 8 0,504 Positivkontr. 1,127
Tab. 18 Messung der Optischen Dichte (OD) von Proteinextrakt aus Phosphinothricin resistenten Zuckerrüben-Blattmaterial (ZR-LL (T 120-7)) verschiedener Jahrgänge (1995-1999).
Alle untersuchten Proben zeigten ein deutliches Signal, so daß die Expression des Phosphinothricin-Gens auch über mehrere Generationen in den untersuchten Zuckerrüben-Transformanten nachgewiesen werden konnte.
5.3.4 DNA-Nachweis in Mischungen aus konventionellem und gentechnisch verändertem Mais
Neben der beabsichtigten Verwendung und dem Inverkehrbringen gentechnisch veränderter Pflanzen in Lebensmitteln kommt es aufgrund der Saatgutgewinnungsmethoden, der Art des landwirtschaftlichen Anbaus und der Art der Weiterverarbeitung von Pflanzen zu Lebensmitteln auch zu unbeabsichtigten Vermischungen zwischen gentechnisch veränderten und nicht-gentechnisch veränderten Pflanzen. Aus diesem Grunde wurde untersucht, in welchen Konzentrationen der Nachweis einer solchen unbeabsichtigten Vermischung noch möglich ist. Hierzu wurde DNA aus verschiedenartigen Mischungen zwischen konventionellem und gentechnisch verändertem Mais isoliert und mit Hilfe der PCR untersucht. Der gentechnisch veränderte, Phosphinothricin-resistente Mais (LL T25) wurde mit konventionellem Mais im Verhältnis 1+9, 1+99 und 1+999 vermischt. Ein Maiskorn hat ein durchschnittliches Gewicht von 0,3 g.
5.3.4.1 DNA-Isolierung aus Maiskörnern
In einem ersten Arbeitsschritt wurde aus verschiedenen Mischungen zwischen gentechnisch verändertem und konventionellem Mais DNA isoliert. Hierzu wurde das Verfahren des Macherey & Nagel–Kits (s. Kap. B-5.2.5) leicht modifiziert.
Die Mischung der Maiskörner wurde mit Hilfe eines Mixers (Fa. Waring – Blendor) zerkleinert. Die abnehmbaren Schnitzelwerke des Mixers wurden hierfür zuvor autoklaviert. Die Zeit für die Zerkleinerung und Homogenisierung betrug bei der 1+9 und 1+99-Mischung jeweils 30 sec. Um zu untersuchen, ob eine Abhängigkeit zwischen dem Zeitraum der Zerkleinerung/ Homogenisierung und der Nachweisempfindlichkeit besteht, wurden bei der 1+999 Mischung Aliquots von ca. 0,6 g (ca. ½ Eppendorfgefäß) nach 30, 60 und 120 sec der Zerkleinerung und Homogenisierung entnommen.
Zur Isolierung der DNA wurden zwei Wege beschritten:
(a) Nach dem Zerkleinern wurden Aliquots des Mais entnommen (ca. ½ Eppendorfgefäß) und mit 1,2 ml Macherey & Nagel- Kit-Extraktionspuffer versetzt (ohne RNAse A). Nach 20 min Inkubation im Wasserbad bei 65° C wurden 20 µl RNAse A hinzugegeben und für weitere 10 min inkubiert.
(b) Die zerkleinerten Mischungen wurden in Ihrer Gesamtheit für die DNA-Isolierung aufgearbeitet. Pro Maiskorn wurden 600 µl ZR-Extraktionspuffer statt C1-Puffer verwendet (d.h. 6 ml bei der 1+9 Mischung, 60 ml bei der 1+99-Mischung und 600 ml bei der 1+999 Mischung). Die Zerkleinerungsgefäße wurden mit Teilen des Puffers ausgewaschen, um eine möglichst vollständige Übertragung des Maisschrots zu gewährleisten. Nach 20 min Inkubation im Wasserbad bei 65° C wurden 600 µl Überstand mit Hilfe einer Pipette mit abgeschnittener Spitze entnommen und mit 10 µl RNAse A (10mg/ ml) versetzt und für weitere 10 min im Wasserbad bei 65° C inkubiert.
Ziel der unterschiedlichen Aufarbeitung war es, zu untersuchen, ob die Homogenisierung des Pflanzenmaterials durch den Zerkleinerungsprozeß ausreichend ist (Aliq.) oder ob eine ausreichende Homogenisierung nur durch eine Verarbeitung des gesamten Pflanzenmaterials für die DNA-Isolierung (Lsg.) möglich ist.
Alle Proben wurden dann entsprechend dem Macherey & Nagel–Kit-Protokoll (s. Kap. B-5.2.5) weiterverarbeitet (Zentrifugation der Proben für 10 min bei 12.000 rpm; Abnahme des Überstandes (400 µl) und Überführung in ein neues Eppendorfgefäß; Zugabe von 600 µl C4-Puffer und 400 µl EtOH (abs.); Whirlen der Probe für 30 sec;
Auftragen von 750 µl auf die Säule, Zentrifugation bei 7000 rpm für 1 min; Auftragen des Restes des Überstandes (300 µl); Zentrifugation; Waschen mit CW-Puffer, Waschen mit C5-Puffer (2x); Auffanggefäß noch mal leer zentrifugieren, um Ethanolreste zu entfernen und eluieren mit 100 µl65°C warmen Wasser (bidest)).
5.3.4.2 Optimierung der Nachweisgrenze für Mischungen aus gentechnisch verändertem Mais (LL – T25) und konventionellem Mais
Mit der isolierten DNA wurden PCR-Reaktionen durchgeführt. Als Primer wurden 35S-1 und 35S-2 in einer Konzentration von jeweils 1 µM verwendet. Die Annealing-Temperatur betrug entsprechend der Optimierungsversuche 55 °C.
1+9 (Aliq.) 1+9 (Lsg.) 1+99 (Aliq.) 1+99 (Lsg.) 1+999 (Aliq. 30 sec)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Marker
505 bp 396 bp 1018 bp 344 bp 298 bp 220 bp
1+999 (Aliq. 120 sec)
1+999 (Aliq. 60 sec) K(+): ZR-LL (T120-7)
K(-): ZR (konv.) Marker
K(-): TE K(-): Ma (konv.)
1+999 (Lsg.)
195 bp
Abb. 16 Einfluß verschiedener Mischungsverhältnisse auf die Empfindlichkeit der PCR zum Nachweis von Verunreinigungen von konventionellem Mais durch gentechnisch veränderten Mais (MA-LL-T25).
Als Mischungsverhältnisse wurden untersucht 1+9 (d.1. 1 Maiskorn von Phosphinothricin-resistenten Mais (MA-LL-T25) und 9 Maiskörner von konventionellem Mais) (Spur 2 und 3)), wobei nach der Zerkleinerung der Maiskörner ein Aliquot zur DNA-Isolierung entnommen worden ist (Spur 2) bzw. der gesamte Mais mit Puffer versetzt wurde, um aus einer Teilmenge des Überstandes DNA zu isolieren (Spur 3). In gleicher Weise wurde mit den Mischungen im Verhältnis 1+99 und 1+999 verfahren (Spuren 4/5 bzw. 6-9). Des weiteren wurde der Einfluß der Zeit für die Homogenisierung (30 sec, 60 sec und 120 sec (Spuren 6-8) auf den Grad der Nachweisbarkeit mit Hilfe der PCR untersucht.
Als Negativkontrolle wurde genomische Zuckerrüben-DNA (K(-): ZR-konv.) (Spur 10), TE-Puffer (K(-):
TE) (Spur 11) und genomische Mais-DNA (K(-): Ma-konv.) (Spur 12) verwendet. Als Positivkontrolle wurde genomische DNA aus einer LibertyLink-resistenten, transgenen Zuckerrüben-Transformante (K(+): ZR-LL (T120-7) verwendet (Spur 13). Die Auftrennung erfolgte auf einem 3%igen Agarosegel (120 V/ 1h). Als Marker wurde Ready-Load - 1Kb DNA Ladder der Fa. Gibco BRL verwendet.
Es zeigte sich, daß die Intensität der PCR-Signale identisch war; und zwar sowohl bei Verwendung der DNA, die aus einem Mais-Aliquot gewonnen wurde, als auch bei der DNA, die gewonnen wurde, indem der gesamte Mais mit Puffer versetzt wurde, um dann aus einer Teilmenge des Überstandes DNA zu isolieren. Auch die Zeit des Prozesses der Zerkleinerung und Homogenisierung hatte keinen wesentlichen Einfluß auf die Nachweisempfindlichkeit wie an der Menge des Reaktionsproduktes bei den verschiedenen behandelten 1+999-Mischungen zu erkennen ist. Unter den beschrieben Reaktionsbedingungen war ein Nachweis einer Mischung von 1 + 99 (d.h. 1% Vermischung) möglich.
5.3.4.3 Modifikation der DNA- und Taq-Polymerase-Menge
In den folgenden Versuchen wurden eine Reihe von Parametern modifiziert, um die Nachweisempfindlichkeit der Reaktion weiter zu erhöhen. Dies umfaßte eine Erhöhung der:
• DNA-Konzentration (4 µl, 8 µl und 12 µl);
• Konzentration an Taq-Polymerase (0.3 µl, 0.6 µl, 0.9 µl, 1.2 µl und 1.5 µl);
• Zyklenzahl (40 statt bisher 35).
Die Primerkonzentration war in allen Fällen mit 1 µM/ Primer (35S-1 und 35S-2) konstant. Die Annealing-Temperatur betrug 55 °C. In einem ersten Ansatz wurde DNA untersucht, die aus einer 1+9- bzw. aus einer 1+99-Mischung aus gentechnisch verändertem und konventionellem Mais isoliert wurde.
505 bp 396 bp 1018 bp 344 bp 298 bp 220 bp
195 bp
K(+): ZR-LL (T120-7)
141bp
K(-): ZR (konv.)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Marker K(-): TE
K(-): Ma (konv.)
0.6 Taq
MA-LL/ konv. 1 + 9 A(60)
0.3 Taq 0.9 Taq 1.2 Taq 1.5. Taq (4 µl DNA) 1.5. Taq (8 µl DNA) 1.5. Taq (12 µl DNA) K(+): Ma-LL/konv. 1+9
0.6 Taq
MA-LL/ konv. 1 + 99 A(60)
0.3 Taq 0.9 Taq 1.2 Taq 1.5. Taq (4 µl DNA) 1.5. Taq (8 µl DNA) 1.5. Taq (12 µl DNA) Marker
Abb. 17 Einfluß verschiedener Konzentrationen an Taq-Polymerase und unterschiedlicher DNA-Konzentrationen auf die Empfindlichkeit der PCR zum Nachweis von Verunreinigungen von konventionellem Mais durch gentechnisch veränderten Mais (MA-LL-T25).
Zur PCR wurden 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 und 1.5 µl Taq-Polymerase (Fa. Pharmacia) mit 5 U/ µl verwendet.
Die Reaktion wurde mit DNA durchgeführt, die aus einem Aliquot isoliert wurde, welches nach 60 sec Zerkleinerung und Homogenisierung eines Gemisches aus konventionellem Mais und gentechnisch verändertem Mais im Verhältnis 1+9 (MA-LL/ konv. 1 + 9 A (60)) bzw. 1+99 (MA-LL/ konv. 1+99 A (60)) abgenommen wurde. Als Negativkontrolle wurde genomische Zuckerrüben-DNA (K(-): ZR-konv.; Spur 16), genomische Mais-DNA (K(-): Ma-konv.; Spur 17) und TE-Puffer (K(-): TE; Spur 18) verwendet. Als Positivkontrolle wurde genomische DNA aus einer LibertyLink resistenten, transgenen Zuckerrüben-Transformante (K(+): ZR-LL T120-7; Spur 19) sowie DNA verwendet, die aus einem Gemisch aus konventionellem Mais und LibertyLink resistentem, transgenem Mais (MA-LL-T25) im Verhältnis 1:9 gewonnen wurde, welche in früheren Versuchen bereits ein positives Signal zeigte (Spur 20). Die Auftrennung erfolgte auf einem 3%igen Agarosegel (120 V/ 1h). Als Marker wurde Ready-Load - 1Kb DNA Ladder der Fa. Gibco BRL verwendet.
Die Effizienz der PCR nimmt entgegen den ursprünglichen Erwartungen bei steigender Konzentration an Taq-Polymerase ab. Auch die Verwendung einer höheren DNA-Konzentration führte entgegen den ursprünglichen Erwartungen nicht zu einem stärkeren Signal. Neben dem erwarteten PCR-Produkt von 195 bp kommt es bei der Verwendung genomischer Mais-DNA zur Bildung verschiedener Nebenprodukte von ca. 450 und 300 bp, die im Falle der Zuckerrüben-DNA nicht auftreten, sich aber auf dem 2,5% TAE-Agarosegel aufgrund Ihres Laufverhaltens leicht unterscheiden lassen. Die Versuche zeigen, daß Verunreinigungen von transgenen in konventionellen Maiskörnern im Verhältnis 1:10 und 1:100 (d.h. 10 und 1%) nachweisbar sind, und daß die
Menge an verwendeter DNA im Reaktionsansatz keinen wesentlichen Einfluß auf die Nachweisempfindlichkeit hat. In einem weiteren Versuch wurde der Einfluß der verschiedenen Konzentrationen an Taq-Polymerase auf die Nachweisempfindlichkeit bei einem Mischungsverhältnis von 1+999 untersucht. Darüber hinaus sollte evaluiert werden, ob die Art der Mischung einen Einfluß auf die Nachweisgrenze hat. Hierzu wurde DNA aus einem 1+9 Gemisch mit bidest. Wasser 1:10 verdünnt und die PCR verglichen mit DNA als Edukt, die aus einem 1+99 Gemisch isoliert wurde.
K(+): ZR-LL (T120-7)
141bp
K(-): ZR (konv.)
Marker
0.6 Taq MA-LL/konv. 1+9
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Marker K(-): TE
K(-): Ma (konv.)
MA-LL/ konv. 1 + 999 A(60)
0.3 Taq 0.9 Taq 1.2 Taq 1.5. Taq (4 µl DNA) 1.5. Taq (8 µl DNA) 1.5. Taq (12 µl DNA) MA-LL/konv. 1+9 (1:10) MA-LL/konv. 1+99 MA-LL/konv. 1+9 (1:100) MA-LL/konv. 1+999 MA-LL/konv. 1+9 (1:1.000) K(+): Ma-LL/konv. 1+9
505 bp 396 bp
1018 bp 344 bp 298 bp 220 bp
195 bp
Abb. 18 Einfluß verschiedener Konzentration an Taq-Polymerase, unterschiedlicher DNA-Konzentrationen und verschiedener Mischungsarten auf die Empfindlichkeit der PCR zum Nachweis von Verunreinigungen von konventionellem Mais durch gentechnisch veränderten Mais (MA-LL-T25) (Mischungsverhältnis 1+999).
Zur PCR wurden 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 und 1.5 µl Taq-Polymerase (Fa. Pharmacia) mit 5 U/ µl verwendet (Spuren 2-8). Die Reaktion wurde mit DNA durchgeführt, die aus einem Aliquot isoliert wurde, welches nach 60 sec Zerkleinerung und Homogenisierung eines Gemisches aus konventionellem Mais und gentechnisch verändertem Mais im Verhältnis 1+999 (MA-LL/ konv. 1+999 A (60)) abgenommen wurde. Als Negativkontrolle wurde genomische Zuckerrüben-DNA (K(-): ZR-konv.; Spur 16), genomische Mais-DNA (K(-): Ma-konv.; Spur 17) und TE-Puffer (K(-): TE; Spur 18) verwendet. Als Positivkontrolle wurde genomische DNA aus einer LibertyLink resistenten, transgenen Zuckerrüben-Transformante (K(+): ZR-LL (T120-7; Spur 19) sowie DNA verwendet, die aus einem Gemisch aus konventionellem Mais und LibertyLink resistentem, transgenem Mais (MA-LL-T25) im Verhältnis 1:9 gewonnen wurde (Spur 20).
Die Spuren 10-14 zeigen die Ergebnisse unterschiedlicher Mischungsformen. So wurde die Reaktion mit DNA isoliert aus MA-LL/konv. (1+99) (Spur 10) verglichen mit einer 1:10 (bidest.)-Verdünnung an DNA, die aus MA-LL/konv. (1+9) gewonnen wurde. Entsprechend wurde eine 1+100 Verdünnung der 1+9 DNA mit der 1+999 DNA-Mischung verglichen (Spuren 12 und 13). Die Auftrennung erfolgte auf einem 3%igen Agarosegel (120 V/ 1h). Als Marker wurde Ready-Load - 1Kb DNA Ladder der Fa.
Gibco BRL verwendet.
Wie bereits beim Mischungsverhältnis 1+9 und 1+99 zeigt sich auch hier, daß die Effizienz der PCR bei steigender Konzentration an Taq-Polymerase abnimmt und die Menge an DNA im Reaktionsansatz keinen wesentlichen Einfluß auf die Nachweisempfindlichkeit besitzt. Neben dem erwarteten PCR-Produkt von 195 bp kommt es bei der genomischen Mais-DNA zur Bildung verschiedener Nebenprodukte von ca. 450 und 300 bp.
Der Versuch zeigt, daß Verunreinigungen von transgenen in konventionellen Maiskörnern im Verhältnis 1:1.000 (d.h. 0,1%) nachweisbar sind. Die Art der Mischung hat keinen signifikanten Einfluß auf die Nachweisempfindlichkeit.
5.3.4.4 Effizienz unterschiedlicher Polymerasen
Um die Nachweisempfindlichkeit weiter zu steigern, wurde der Einfluß unterschiedlicher Polymerasen auf die PCR analysiert. Hierfür wurde DNA verwendet, die zuvor aus einem 1+999 Gemisch aus gentechnisch verändertem und konventionellem Mais isoliert wurde. Bei den verwendeten Polymerasen handelt es sich um:
• Taq-Polymerase der Fa. Pharmacia;
• Advantage cDNA Polymerase der Fa. Clontech;
• Advantage 2 Polymerase der Fa. Clontech.
Bei den Advantage-Polymerasen wurde dNTP der Konzentration 40 mM der Fa. Stratagene verwendet. Bei der Taq-Polymerase betrug die dNTP-Konzentration 50 mM. Als Puffer (10x) wurde jeweils der im Kit der Polymerase-Herstellerfirma vorliegende verwendet. Die Primer (35S-1 und 35S-2) lagen jeweils in einer Konzentration von 1 µM vor. Die Annealing-Temperatur betrug 55 °C.
K(+): GT/ konv. (1+9)
141bp
Marker
Taq Advantage Advantage 2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Marker K(-): TE
K(-): Ma (konv.)
MA-GT/ konv.
1+999
195 bp
505 bp 396 bp
1018 bp 344 bp 298 bp 220 bp
Taq Advantage Advantage 2 Taq Advantage Advantage 2
MA-GT/ konv.
1+999 (1:10)
MA-GT/ konv.
1+999 (1:100)
Taq Advantage Advantage 2
K(+): GT/ konv. (1+9)
K(+): ZR-LL/ (1:100)
K(-): Ma (konv.) K(+): GT/ konv. (1+9)
K(+): ZR-LL/ (1:100)
K(-): Ma (konv.)
Abb. 19 Einfluß verschiedener Polymerase auf die Empfindlichkeit der PCR zum Nachweis von Verunreinigungen von konventionellem Mais durch gentechnisch veränderten Mais (MA-LL-T25).
Es wurde die Effizienz der Taq-Polymerase (Fa. Pharmacia) (Spur 2) mit der der Advantage-Polymerase (Fa. Clontech) (Spur 3) und der Advantage 2-Advantage-Polymerase (Fa. Clontech) (Spur 4) verglichen. Als Edukt wurde DNA verwendet, die aus einem Gemisch von Maiskörner im Verhältnis 1:999 (MA-LL-T25 : konv. Mais) isoliert wurde. Die gleiche Reaktion wurde mit einer 1:10 (Spuren 5-7) und einer 1 :100-Verdünnung dieser DNA durchgeführt (Spuren 8-10). Als Negativkontrolle wurde genomische Mais-DNA (K(-): Ma-konv.) (Spuren 11, 14 und 17) verwendet. Als Positivkontrolle wurde DNA verwendet, die aus einem Gemisch aus konventionellem Mais und LibertyLink resistentem, transgenem Mais (MA-LL-T25) im Verhältnis 1:9 (K(+): GT/konv. (1+9)) (Spuren 13, 16 und 19) gewonnen wurde sowie eine 1:100 Verd. von ZR-LL/ T120-7-DNA (K(+): ZR-LL/(1:100)) (Spuren 15 und 18). Die Ansätze erfolgten mit Taq-Polymerase (Spuren 11-13), Advantage-Polymerase (Spuren 14-16) und Advantage 2-Polymerase (Spuren 17-19). Die Auftrennung erfolgte auf einem 3%igen Agarosegel (100 ml) (90V/ 1h). Als Marker wurde Ready-Load - 1Kb DNA Ladder der Fa. Gibco BRL verwendet.
Die Advantage-Polymerase führte im Vergleich zur Taq-Polymerase zu einer größeren unspezifischen Bindung, was zu einer deutlichen Bildung eines Reaktionsproduktes der Größe von ca. 450 bp Größe führte, ohne daß die Nachweisgrenze für das gewünschte Fragment (195 bp) wesentlich gesteigert werden konnte. Die Nebenreaktionen, die bei der Verwendung der Advantage2–Polymerase auftraten, ließen eine deutliche Unterscheidung zwischen dem erwarteten Fragment von 195 bp und dem Nebenprodukt nicht mehr zu, so daß diese Polymerase für die hier untersuchte Fragestellung und unter den angegeben Reaktionsbedingungen nicht verwendet werden kann. Insgesamt betrachtet sind die mit der Taq-Polymerase erzielten Ergebnisse am eindeutigsten in der Interpretation der Veränderung des untersuchten, LibertyLink -resistenten Mais.
5.3.5 DNA-Nachweis in verarbeitetem (gekochten und frittierten), gentechnisch veränderten Mais (LL T-27) mit Hilfe der PCR-Methode
Viele Pflanzen werden nicht roh, sondern verarbeitet verzehrt. Aus diesem Grunde wurde der Einfluß von zwei für Mais typischen Verarbeitungsmethoden, dem Kochen und die Behandlung mit heißem Fett (Popcorn) auf die Nachweisempfindlichkeit der PCR untersucht.
5.3.5.1 DNA-Isolierung aus den behandelten Maiskörnern
Vor der Isolierung der DNA wurden die Maiskörner unterschiedlich behandelt:
(a) Zwei Körner Mais wurden in 50 ml bidest. Wasser für 20 min gekocht. Danach wurden die Körner auf Fließpapier getrocknet und in einem autoklaviertem Mörser zerkleinert.
(b) Zwei Körner Mais wurden in 20 ml Speiseöl für 10 min auf 200 ° C erhitzt. Danach wurden die Körner auf Fließpapier getrocknet und in einem autoklaviertem Mörser zerkleinert.
Die weitere Aufarbeitung wurde entsprechend dem Protokoll von Macherey & Nagel (Kit) vorgenommen (s. Kap.
B-5.2.5). Die Proben wurden zum einen vorschriftsmäßig mit C1-Puffer behandelt; eine zweite Probe im Vergleich dazu jedoch mit ZR-Extraktionspuffer. Ziel dieser Vorgehensweise war es, zu untersuchen, ob (a) die Ausbeute an DNA von der Art des Extraktionspuffers beeinflußt wird und (b) die Art des Extraktionspuffers Einflüsse auf die Qualität der DNA hat, die wiederum die Durchführung der PCR negativ beeinflussen können.
Zur Bestimmung der DNA-Konzentration und auch zur Analyse der Qualität der DNA wurde zunächst eine Bestimmung mit Hilfe eines Agarosegels durchgeführt. Hierbei zeigte sich (s. Abb. 20), daß DNA, die mit Hilfe der C1-Lösung aus dem Macherey & Nagel-Kit isoliert wurde, in Form einer Bande auf dem Gel zu beobachten und von daher weniger stark abgebaut war, als dies bei der Isolierung mit Hilfe des ZR-Extraktionspuffers der Fall war, wo keine einzelne DNA-Bande zu beobachten war.
1 2 3 4
ZR-Puffer C1-Puffer C1-Puffer
ZR-Puffer
Mais (konv.) Mais-LL-T 25
Abb. 20 Laufverhalten genomischer Mais-DNA, die mit (a) der Macherey &Nagel Methode und (b) einer modifizierten Form der Methode (Verwendung von ZR-Extraktionspuffer statt C1-Puffer) isoliert wurde.
Spur 1: Mais-DNA isoliert mit ZR-Puffer
Spur 3 Mais-DNA (LL – T25) isoliert mit ZR-Puffer Spur 2 Mais-DNA isoliert mit C1-Puffer
Spur 4 Mais-DNA (LL – T25) isoliert mit C1-Puffer
Bei der Verwendung des C1-Puffers liegt die DNA sehr kompakt vor, während dies bei der Verwendung des ZR-Puffers nicht der Fall ist. Bei den vergleichenden PCR-Tests zeigt sich jedoch in bezug auf die Nachweisempfindlichkeit der PCR kein Unterschied bei der Verwendung genomischer Mais-DNA, die unter Verwendung des C1-Puffers isoliert wurde, und solcher, die alternativ dazu mit Hilfe des ZR-Puffers isoliert wurde (s. Abb. 21).
5.3.5.2 DNA-Konzentrationsbestimmung mit Fluorometer
Um zu evaluieren, ob die Art der Verarbeitung der Maiskörner (kochen bzw. Behandlung mit heißem Fett) bzw.
die Art des verwendeten Extraktionspuffers Einfluß auf die Ausbeute der Isolierung hatte, wurde die DNA-Konzentration der unterschiedlichen Proben mit einem Fluorometer (s. Kap. B-5.2.8) bestimmt.
Nr. Probe Messung pg Konz. (ng/µl)
1 Mais (konv.) in C1-Puffer 107 5
2 3 4 5
Mais (konv.) in ZR-Extraktions-Puffer Mais (GVO) in C1-Puffer
Mais (GVO) in ZR-Extraktions-Puffer Mais (konv.) - gekocht - in C1-Puffer
101 115 117 79
5 6 6 4 6
7
Mais (konv.) - gekocht - in ZR-Extraktions-Puffer Mais (GVO) - gekocht - in C1-Puffer
72 116
4 6 8
9
Mais (GVO) - gekocht - in ZR-Extraktions-Puffer Mais (konv.) - Öl - in C1/Ex-Puffer
85 5
4 0,3
10 Mais (GVO) - Öl - in C1/Ex-Puffer 1 0,1
Tab. 19 Konzentrationsbestimmung von DNA-Isolaten, die mit Hilfe unterschiedlicher Extraktionspuffer aus gekochtem bzw. mit heißem Fett behandeltemn gentechnisch verändertem (LL-T25) und konventionellem Mais isoliert wurden.
Die Bestimmung der isolierten DNA-Menge mit Hilfe des Fluorometers zeigte keinen signifikanten Einfluß des verwendeten Extraktionspuffers auf die Ausbeutemenge. Das Kochen führte zu einer ca. 20%igen Reduktion der Ausbeute. Nach der Behandlung mit heißem Fett konnte keine DNA mehr nachgewiesen werden.
5.3.5.3 PCR
Die unterschiedliche gewonnenen DNA-Proben wurden mit Hilfe der PCR analysiert. Die Menge DNA wurde so gewählt, daß ca. 80 ng DNA / Ansatz verwendet wurden. Die Annealing-Temperatur betrug 55° C. Die Primerkonzentration betrug 1 µM.
Die Verwendung eines unterschiedlichen Extraktionspuffers bei der Aufarbeitung (C1-Puffer und alternativ ZR-Puffer) zeigte keinen Einfluß auf die Nachweisempfindlichkeit der PCR (Spuren 3/4 und 7/8 in Abb. 21).
Während die DNA nach dem Kochvorgang durchaus noch nachgewiesen werden konnte (Spuren 5/6 und 7/8), war dies bei den Proben, die aus dem mit heißem Öl behandelten Mais isoliert wurden (Spuren 9/ 10), nicht der Fall.