2 Material und Methoden
2.4 Elektrophoresen
2.4.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Polyacrylamid-Gelelektrophoresen (PAGE) wurden unter nativen, halbnativen und denaturie-renden Bedingungen durchgeführt (Creighton und Chasman 1997, Laemmli 1970). Für die Elek-trophorese wurden die folgenden Gelkammern verwendet: Das PerfectBlue® Doppelgelsystem Twin S von Peqlab bzw. das Mini-Protean®TetraSystem von BioRad (Tab. 2.1).
2.4.2.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE 10×SDS-Elektrophoresepuffer
Tris-Base 250 mM
Glycin 1,9 M
SDS 1 % (w/v)
Der Puffer wurde vor der Verwendung 1:10 mit VE-Wasser verdünnt (1× SDS-Elektrophorese-puffer).
4×Lower-Tris
Tris-HCl 1,5 M
SDS 0,4 % (w/v)
Der pH-Wert des Puffers wurde mit 1 M Natronlauge auf 8,8 eingestellt.
4×Upper-Tris
Tris-Base 0,5 M
SDS 0,4 % (w/v)
pH-Wert des Puffers wurde mit 1 M Natronlauge auf 6,8 eingestellt.
2,5×Probenauftragspuffer
1 M Tris-HCl pH 6,8 125 mM
SDS 5 % (w/v)
Bromphenolblau 0,25 % (w/v)
Glycerol 25 % (v/v)
Der SDS-Gelladepuffer wurde aliquotiert und bei −20 °C gelagert.
DTT-Stocklösung
DTT 1 M
Das DTT wurde in Reinstwasser gelöst und die Stocklösung bei −20 °C gelagert.
APS-Stocklösung
APS 40 % (w/v)
Die Stocklösung wurde aliquotiert und bei −20 °C gelagert.
Durchführung
Zur Analyse von Proteinen wurde die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendet. Dieses Verfahren nutzt die Tatsache, dass die meisten Proteine SDS binden und mit diesem negativ geladene SDS-Protein-Komplexe bilden (Laemmli 1970). Bei der Probenvorbe-reitung wurden die Proben (15 μL) mit einem Uberschuss an SDS (12 μL Probenauftragspuf-fer) versetzt und 5 min auf 95 °C erhitzt. Dabei wurde die Tertiär- und Sekundärstrukturen durch Aufspaltung der Wasserstof brücken sowie durch Streckung der Moleküle gelöst. Die Proben wurden danach sofort auf Eis abgekühlt und mit 3 μL Dithiothreitol (DTT) versetzt.
Als Molekulargewichtsstandard wurde der Größenstandard Page Ruler™ Unstained Protein Ladder (Tab. 2.4) von Fermentas verwendet. Die Gele bestanden aus einem Trenngel (pH 8,8) und einem Sammelgel (pH 6,8) mit einer Gesamtkonzentration von Acrylamid/Bisacrylamid (T) von 12% bzw. 6% (siehe Tab. 2.19). Die Konzentration des Crosslinkers (Bisacrylamid) in der Gesamtkonzentration betrug bei den Gelen 2,6% (C).
Tabelle 2.19: Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel
Trenngel (12%) Sammelgel (6%)
Reinstwasser 2,7 mL 1,8 mL
Lower-Tris 1,5 mL
Upper-Tris 750 μL
Rothiphorese Gel 40 (37,5:1)a 1,8 mL 450 μL
APS-Lösung 15 μL 10 μL
TEMED 7,5 μL 4,0 μL
Die fertigen Gele wurden in die Gelkammer eingesetzt und mit 1×Laufpuffer überschichtet. Von jeder Probe wurden abhängig vom Proteingehalt 5 bis 30 μL (5 μg pro Tasche) und zusätzlich auf eine Spur 5 μL des Größenstandards (Tab. 2.4) aufgetragen. Der Lauf erfolgte bei konstant 10 mA pro Gel während die Proben sich im Sammelgel befanden. Sobald die Proben in das Trenngel einliefen, wurde die Stromstärke auf 20 mA pro Gel erhöht. Der Lauf wurde beendet, wenn die Lauffront von Bromphenolblau den unteren Rand des Gels erreichte. Im Anschluss wurden die Gele zum Nachweis von Proteinen entweder mit colloidalem Coomassie (s. 2.4.3.1) gefärbt oder für den Western-Blot (s. 2.4.2.6) verwendet.
Bestimmung des Molekulargewichts
Die Bestimmung des Molekulargewichtes mittels SDS-PAGE erfolgte anhand eines Proteinstan-dards. Die Logarithmen der Molekulargewichte der Standardproteine wurden gegen den Rf-Wert ihrer Laufstrecke aufgetragen. Anhand der Regressionsgeraden wurde das Molekulargewicht der Zielproteine ermittelt.
2.4.2.2 Halbna ve SDS-PAGE
Die halbnative SDS-PAGE wurde analog zur SDS-PAGE durchgeführt, wobei ein Lauf- und ein Probenauftragspuffer mit halber SDS-Konzentration verwendet wurden. Die Probe wurde nativ – Probenvorbereitung ohne Kochen und Zugabe von DTT-Lösung – auf das Gel aufgetragen. Die
Elektrophorese wurde bei 4 °C durchgeführt.
2.4.2.3 Blue na veGelelektrophorese
Die blue native Gelelektrophorese beruht auf der Bindung des Farbstoffes SERVA Blue G an die Proteine. Dieser Farbstoff ersetzt das denaturierende Detergenz SDS im Laufpuffer und bildet negativ geladene Farbstoff-Protein-Komplexe, die mit nativer Struktur zur Anode wandern (Wittig und Schägger 2008). Die Wanderung der Komplexe erfolgt bei physiologischem pH unabhängig von ihrem pI. Der Farbstoff wurde mit einer Endkonzentration von 0,02‰ (w/v) zum 1× Kathodenpuffer gegeben. Für die Elektrophorese wurden Gradientengele von Serva® (Acrylamidkonzentration 3-12% (T), Quervernetzerkonzentration 2,6% (C), Schichtdicke 1 mm) verwendet und die Elektrophorese nach Herstellerangaben (10 min 50 V, 120 min 200 V) bei 4 °C durchgeführt. Die Proben wurden 1:2 mit blue nativeProbenauftragspuffer gemischt und pro Tasche 5 bis 30 μL Probe (5 μg bzw. 15 mU Aktivität) aufgetragen. Zusätzlich wurden 7,5 μL nativer Proteinstandard (Tab. 2.4) aufgetragen.
2.4.2.4 Clear na veGelelektrophorese
Für die clear nativeGelelektrophorese wurden dieselben Gele wie für die blue native Gelelek-trophorese verwendet, wobei jedoch auf die Verwendung des Farbstoffes verzichtet wurde. Die Elektrophorese wurde nach Herstellerangaben durchgeführt.
2.4.2.5 Isoelektrische Fokussierung
Für die isoelektrische Fokussierung wurden Polyacrylamidgele mit immobilisierten Ampholinen (pH-Gradient pH 3-10) und einer Schichtdicke von 1 mm verwendet (Serva®). Die Vorbereitung der IEF-Gele erfolgte gemäß Herstellerangaben. Die Proben wurden 1:2 mit Probenauftragspuffer gemischt und pro Tasche 10 bis 30 μL Probe (5 μg bzw. 15 mU Aktivität) aufgetragen. Zur Bestimmung des isoelektrischen Punkts wurden 5 μL eines IEF-Standards (Tab. 2.4) aufgetragen.
Die Elektrophorese wurde bei 4 °C unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
60 min U = 50 V 60 min U = 200 V 30 min U = 500 V
Die isoelektrischen Punkte der Standardproteine wurden gegen ihre Laufstrecke aufgetragen. Die isoelektrischen Punkte der Zielproteine wurden anhand der Regressionsgeraden ermittelt.
2.4.2.6 Western Blot
Zum Nachweis spezi ischer Proteine mit Antikörpern wurden diese aus einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch auf eine Membran übertragen. Dadurch liegen die Proteine exponiert an einer Ober läche vor und können direkt und ungehindert mit anderen Stoffen (wie Antikörpern oder Farbstoffen) reagieren.
Lösungen für den Western Blot 10× Wet-Blot Laufpuffer
Glycin 1,9 M
Tris-Base 0,25 M
1× Wet-Blot Laufpuffer
10× Wet-Blot Laufpuffer 100 mL
Methanol 50 mL
VE-Wasser ad 1 L
10× TBS-Puffer
Tris-HCl 0,5 M
Natriumchlorid 1,5 M
Der pH-Wert des Puffers wurde mit 1 M Natronlauge auf pH 7,5 eingestellt.
1× TBST-Puffer
10× TBS-Puffer 100 mL
Tween®20 1 mL
Reinstwasser ad 1 L
5%iges Milchpulver in TBST-Puffer
Milchpulver 50 g
1× TBST-Puffer ad 1 L
Strip-Lösung
Glycin 25 mM
SDS 1 %
Der pH-Wert wurde mit Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt.
Durchführung
Die SDS-PAGE wurde wie beschrieben vorbereitet und durchgeführt. Als Marker wurden 5 μL Page Ruler Prestained Protein Ladder von Fermentas (Tab. 2.4) verwendet. Nach Beendigung des Laufs wurden die aufgetrennten Proteine mittels Tank-Elektroblotter auf eine Polyvinyliden luo-rid-Membran (Roti®-PVDF-Membran, Roth) übertragen.
Für das Blotten wurden die Membran und das Blottingpapier (Whatman®, Dassel) auf Gelgröße zugeschnitten. Die Membran wurde 5 min mit Methanol aktiviert und anschließend zusammen mit dem Blottingpapier und Schwämmen in 1× Wet-Blot Laufpuffer equilibriert. Das Blotten erfolgte für 1 h bei einer Spannung von 100 V. Anschließend wurde die Membran vom Gel getrennt und mit 30 mL 5%iger Milchpulver-Lösung überschichtet. Die überschichtete Membran wurde über Nacht im Kühlschrank gelagert, um freie Bindestellen auf der Membran zu blockieren und eine Hintergrundfärbung zu verhindern (Blocken).
2.4.2.7 Immunodetek on
Für den indirekten Nachweis von Proteinen wurden als Primärantikörper verschiedene Anti-körper nach dem Blocken zur Milchpulverlösung auf die Membran gegeben und für 2 h bei Raumtemperatur auf einem Taumelschüttler inkubiert.
MBP-tag
Für den Nachweis von Proteinen mit einem MBP-tagwurde ein Anti-MBP-Antiserum (aus Kaninchen) verwendet, das mit dem pMAL™ Protein Fusion and Puri ication System (Tab. 2.5) bezogen wurde. Das Antiserum wurde 1:10 000 mit 5% (w/v) Milchpulver in TBST-Puffer verdünnt.
His-tag
Für den Nachweis von Proteinen mit einem His-tagwurde ein polyklonaler Anti-His-Antikörper (pAB aus Kaninchen, AK-online; # ABIN 195461) verwendet (1:5 000 mit 5% (w/v) Milchpulver in TBST-Puffer verdünnt).
AAO
Für den Nachweis der Arylalkoholoxidase wurde ein Antiserum aus Kaninchen verwendet, das gegen die AminosäuresequenzNQSFDNLFRDSSEFNAgerichtet ist. Das Serum wurde 1:2 500 mit 5% (w/v) Milchpulver in TBST-Puffer verdünnt.
Anschließend wurde die Membran 3× je 10 min mit TBST-Puffer gewaschen. Als sekundärer Antikörper wurde ein Peroxidase-konjugierter Ziege-anti-Kaninchen (H+L) Antikörper verwen-det. Der Antikörper wurde 1:15 000 mit TBST-Puffer verdünnt und die Membran für 1 h mit der Lösung auf dem Taumelschüttler inkubiert. Danach wurde die Membran 3× je 10 min mit TBST-Puffer gewaschen. Nach dem Waschen erfolgte der Nachweis der Proteine entweder durch eine Chemolumineszenz-Reaktion oder durch eine kolorimetrisch-enzymatische Reaktion.
Variante A:
Eine Substrat-Lösung wurde durch Mischen von 0,7 mL Luminol und 0,7 mL Peroxidlösung (Immobilon, Tab. 2.5) hergestellt und vorsichtig über die Membran pipettiert. Anschließend wurde die Membran in Frischhaltefolie eingeschlagen und in eine Entwicklungsbox geklebt.
Innerhalb von 30 min nach dem Start der Reaktion wurde ein Röntgen ilm (Kodak BioMax XAR) 5 bis 120 s belichtet und anschließend entwickelt (Entwicklermaschine von Canon Deutschland GmbH, Krefeld). Alternativ wurde die Chemolumineszenz mit dem VersaDOC™ MP 4000 Imaging System dokumentiert.
Variante B:
Das kolorimetrische Färbereagenz wurde durch Mischen von 9 mL destilliertem Wasser, 1 mL Opti-4CN-Diluent und 0,2 mL des Substrates 4-Chlor-1-naphthol hergestellt. Die Lösung wurde gründlich gemischt und vorsichtig über die Membran pipettiert. Die Membran wurde für maximal 30 min inkubiert und anschließend eingescannt. Die Visualisierung der Proteinbanden erfolgte durch die Entstehung von dunkel gefärbten Präzipitaten.
2.4.2.8 Strippen und Rehybridisieren von Western Blots
Zur erneuten Verwendung bereits hybridisierter Membranen wurden die gebundenen Antikör-per entfernt. Dafür wurde der Blot 45 min bei RT auf dem Taumelschüttler mit der Strip-Lösung gewaschen. Anschließend wurden Reste der Strip-Lösung mit TBST entfernt und die Membran neu geblockt (5%iges Milchpulver in TBST-Puffer).