2 Material und Methoden
2.5 Proteinbiochemische Arbeiten
2.5.1 Heterologe Expression
2.5.1.1 Heterologe Expression inEscherichia coli
Vor der rekombinanten Produktion von Proteinen im 100 mL-Maßstab wurde die Expression in einem Miniexpressionstest (3 mL-Expressionskultur) überprüft.
Für die Proteinexpression wurden zunächst 3 mL-Ubernachtkulturen (s. 2.2.3.8) vorbereitet.
Nach dem Animpfen des Mediums wurde zusätzlich eine Agarplatte angeimpft, um von dem-selben Klon erneut Proteine gewinnen zu können. Mit 30 μL (1% (v/v)) der Ubernachtkultur wurden 3 mL LB-Medium (mit Antibiotika) in einem 15 mL-Falcon Tube inokuliert. Die Kultur wurde bei 37 °C und 225 U min−1im Luftschüttler inkubiert, bis eine Zelldichte (OD600) von 0,5-0,8 erreicht wurde. Anschließend erfolgte die Induktion der Expression und die Kulturen wurden wie unter A–C beschrieben weitergeführt. Vor der Induktion (VI) und am Ende der Kultivierung (NI) wurde jeweils ein 500 μL-Aliquot entnommen, bei 14 000 U min−1(18 000 ×g) für eine 1 min pelletiert, der Uberstand verworfen und das Zellpellet in 50 μL Auftragspuffer resuspendiert.
Anschließend wurden die Proben für 5 min bei 95 °C erhitzt und nach dem Abkühlen 5 μL DTT zugefügt. Zur Kontrolle der Expression wurden 10 μL der Proben mittels SDS-PAGE analysiert.
Als Negativkontrolle wurde jeweils der entsprechende Vektor ohne Insert im verwendeten Expressionsstamm mitgeführt.
Die Produktion im 100 mL-Maßstab erfolgte analog zur Miniexpression. Dafür wurden 100 mL LB Medium (mit Antibiotika) in einem 250 mL-Erlenmeyerkolben mit 1 mL (1% (v/v)) der Ubernachtkultur inokuliert.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zur Steuerung der Expression verschiedene Operons und Induktionsmechanismen verwendet (siehe A–C).
A — Expression mit pMAL
Für die Expressionsversuche wurden die Klone pMAL-c4x AAO # c7 und pMAL-c4x AAO # c10 sowie die Klone pMAL-p4x AAO # p1 und pMAL-p4x AAO # p3 verwendet. Die Expression wurde durch Zugabe von IPTG ( inal 0,3 mM) induziert. Dem Expressionsmedium wurde zusätzlich 0,2% (w/v) Glucose zugefügt, um dasE. coli eigene Maltose-System zu reprimieren. Dadurch wird die Expression von Amylasen unterdrückt, die zu Problemen bei der Reinigung des Fusi-onsproteins über die Amylosesäule führen können. Diese Enzyme können die Maltose aus dem Säulenmaterial freisetzen und so die Bindung des Fusionsproteins an die Säule verhindern bzw.
das Protein von der Säule eluieren (Handbuch pMAL Proteinfusions- und Reinigungssystem). Die Expression erfolgte für 3 h bei 37 °C bzw. für 16 h bei 20 °C.
B — Expression mit pET 15b
Für die Expression wurden die Klone pET 15b AAO # 1(3) und pET 15b AAO # 1(5) verwendet.
Die Induktion der Expression des Fusionsproteins erfolgte durch Zugabe von IPTG ( inal 0,3 mM).
Anschließend wurden die Kulturen 3 h bei 37 °C inkubiert.
C — Expression pCold-System und Chaperon-Koexpression
Die Koexpression der Arylalkoholoxidase mit Chaperonen erfolgte unter Verwendung des pCold-Systems und des Chaperon Plasmid Sets der Firma TaKaRa Bio Inc.. pCold I wurde als Expressionsplasmid aus der pCold-Serie ausgewählt. Für die ef iziente Expression bei niedrigen Temperaturen nutzen die Plasmide dieser Serie den durch einen Kälteschock induzierbaren cspA-Promotor (Qinget al. 2004). Weiterhin unterstützen sie die Koexpression von Chaperonen.
Für die Expression wurde Vektor der pColdI-AAO (Tab. 2.18) konstruiert. Das Chaperon Plasmid Set stellt eine Auswahl an Plasmiden mit verschiedenen Chaperongenen zur Verfügung (Tab.
2.10).
Die optimalen Chaperone und die optimalen Bedingungen für die Koexpression sind laut Her-steller für jedes Protein sehr unterschiedlich und müssen daher experimentell bestimmt werden.
Daher wurden für die Koexpression der Arylalkoholoxidase drei verschiedene Chaperonkom-binationen ausgewählt, um mögliche Effekte auf das Produktionslevel und die Löslichkeit der Arylalkoholoxidase zu untersuchen. Die Koexpression erfolgte mit den cytoplasmatischen Chape-ronen GroEL/GroES (pGro7) oder dem Triggerfaktor (pTf16). Weiterhin wurden diese Chaperone gemeinsam (pG-Tf2) mit der Arylalkoholoxidase koexprimiert. Daneben wurden der Zeitpunkt der Induktion, die Konzentration der Induktoren, die Kultivierungstemperatur und –dauer opti-miert. Als Negativkontrollen dienten entweder Zellen mit einem leeren Expressionsvektor bzw.
Zellen, die nicht mit IPTG induziert wurden. Die Effekte der unterschiedlichen Kombinationen und Variationen wurden zunächst in 3 mL-Kulturen untersucht.
I. Optimierung der Induktion
Die Induktion der Expression der Arylalkoholoxidase wurde zu verschiedenen Zeitpunkten von der frühen (OD6000,3–0,4) bis zur späten exponentiellen Phase (OD600 ≥0,6) durchgeführt.
Dafür wurde die Kultur für 15 bis 30 min auf Eis abgekühlt (Kälteschock-Induktion, pColdI) und anschließend 15 bis 30 min bei 15 °C ohne Schütteln inkubiert. Außerdem wurde der Induktor IPTG (pColdI) über einen Konzentrationsbereich von 0,25 bis 1 mM eingesetzt. Der Zeitpunkt der Induktion der Chaperonexpression wurde ebenfalls variiert und zum Beginn der Kultivierung, jedoch spätestens parallel zum Kälteschock, durchgeführt. Weiterhin wurde untersucht, welchen Ein luss das Konzentrationsverhältnis der verwendeten Induktoren auf die Produktmengen von Zielprotein und Chaperonen hat. Dafür wurde zunächst bei konstanter IPTG-Konzentration (0,5 mM) die Konzentration der Chaperoninduktoren variiert. Die Kon-zentration des Induktors -Arabinose (pTf16 und pGro7) wurde in einem Bereich von 0,25 bis 1 mg mL−1 und die Konzentration von Tetracyclin (pG-Tf2) im Bereich von 1 ng mL−1 bis 10 ng mL−1 variiert. Die Kultivierungstemperatur von 37 °C wurde erniedrigt und in einem
II. Expressionsprotokoll für die Arylalkoholoxidase
Für die Expression wurde eine 3 mL-Ubernachtkultur vorbereitet (s. 2.2.3.8). Die Proteinex-pression erfolgte im 10 mL- bzw. 100 mL-Maßstab. Dafür wurden 10 mL LB-Medium (mit Antibiotika) in einem 50 mL-Falcon Tube bzw. 100 mL LB-Medium (mit Antibiotika) in einem 250 mL-Erlenmeyerkolben mit 1% (v/v) der Vorkultur inokuliert. Die Kultur wurde im Luft-schüttler bei 37 °C und 225 U min−1 inkubiert. Nach 1 h wurden die Induktoren für die Cha-peronexpression hinzugefügt. Abhängig vom verwendeten Plasmid wurde die Expression der Chaperone mit 0,25 mg mL−1 -Arabinose bzw. 5 ng mL−1Tetracyclin induziert. Nach Erreichen einer Zelldichte (OD600) von 0,3 wurde die Expression der Arylalkoholoxidase durch einen Kälteschock und IPTG induziert. Die Kultur wurde dazu in einem Eiswasserbad für 15 min abgekühlt und anschließend für 30 min bei 15 °C ohne Schütteln inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 0,5 mM IPTG. Nach der Induktion wurden die Kulturen bei 10 °C für 36 h bei 225 U min−1unter Schütteln inkubiert.
Für eine regelmäßige Inokulation von Flüssigkulturen wurden Stammplatten mit transfor-mierten Zellen bei 4 °C gelagert. Da unter diesen Lagerbedingungen der cspA-Promotor des pCold-Vektors aktiv ist, wurde überprüft, ob die Zellen den Vektor ausschleusen. Dafür wurde das Expressionslevel von Bakterienkulturen, deren Vorkultur mit Zellen einer Stammplatte angeimpft wurde, mit Kulturen verglichen, deren Vorkultur mit Zellen eines Glycerolstocks angeimpft wurde.
Kulturernte
Im Anschluss an die Expression wurden die Zellen geerntet. Dazu wurden die Kulturen bei 4 200 U min−1 (4 100 ×g), 4 °C für 10 min zentrifugiert und der Uberstand verworfen. Das Pellet wurde bei −20 °C gelagert oder direkt für den Zellaufschluss weiter verwendet.
2.5.1.2 Heterologe Expression inHansenula polymorpha
Für die Expression der Esterase wurde die HefeHansenula polymorphaRB11 mit den Vektoren pFPMT-mEPS-H6 #15-3 bzw. pFPMT-mEPS-H6 #15-4 transformiert. Als Negativkontrollstamm diente der Stamm pFPMT/RB11, bei dem Vektor pFPMT121 ohne Insert genomisch integriert wurde (Artes Biotechnology).
Die Kultivierung der Stämme zwecks Produktbildung erfolgte im 12 mL-Maßstab bei 37 °C und 180 U min−1. Zunächst wurden die Stämme für 16 h als YPD-Kulturen inkubiert. Unter dieser Bedingung liegt der die Fremdgene steuernde FMD-Promotor Glucose-reprimiert vor. 800 μL der dichtgewachsenen YPD-Kultur wurden in 12 mL YNB mit 2% Glycerol überführt. Die Inkubation erfolgte für 68 h, bis eine Zelldichte von OD600≥2,5 erreicht wurde. Während dieser sogenannten Derepressionsphase ist der FMD-Promotor aktiv, da die Glucoserepression aufgehoben ist. Für Folgeexperimente wurden Gesamtzellextrakte aus solchen Kultivierungen eingesetzt.