2 Material und Methoden
2.6 Photometrische Enzymassays
2.6.4 Op mierung der Assaybedingungen
2.6.4.1 Bes mmung des op malen Puffers und des pH-Op mums
Das pH-Optimum der AAO*wurde mit Veratrylalkohol als Substrat und verschiedenen Puffern bestimmt. Mit McIlvaine-Puffer (Tab. 2.28) wurde ein Bereich von pH 2,0-8,0 und mit Natrium-acetat-Puffer (50 mM) ein Bereich von pH 3,0-6,0 untersucht. Zusätzlich wurde die Aktivität der rekombinanten AAO*in Natriumphosphat-Puffer (100 mM) pH 6,0 bestimmt, der in der Literatur häu ig verwendet wird.
Zur Bestimmung des optimalen Reaktionspuffers für die DyP-Typ Peroxidase wurde die Aktivität bei 30 °C in einer Auswahl verschiedener Pufferlösungen (s. 2.6.1) untersucht. Dabei wurde der Umsatz in Abhängigkeit des verwendeten Puffers in einem pH-Bereich von 2,0 bis 6,0 untersucht.
Für den Umsatz von ABTS wurde beispielsweise ein pH-Bereich von 3,0 bis 5,5 und für den Umsatz vonβ-Carotin ein Bereich von 3,0 bis 6,0 untersucht.
2.6.4.2 Bes mmung der op malen Pufferkonzentra on
Die Bestimmung der optimalen Pufferkonzentration erfolgte über einen Konzentrationsbereich von 20 bis 350 mM, mit dem pH-Wert, bei dem für das Enzym in dem jeweiligen Puffer die höchste Aktivität ermittelt wurde. Die Enzymaktivität wurde photometrisch bestimmt.
2.6.4.3 Temperaturop mum
Die Umsetzung des Substrates wurde am Photometer (Tab. 2.1) mit temperierbarem Küvetten-schlitten bestimmt. Das Volumen des Assays wurde an die verwendeten Küvetten angepasst. Für jede Messung wurde die Enzymlösung 5 min vortemperiert und anschließend eine 10 minütige Messung durchgeführt. Die Umsatzgeschwindigkeit war bei allen Messungen über mindestens 5 min stabil.
Die Bestimmung der optimalen Temperatur für die rekombinante AAO*wurde unter Verwendung des AAO-Assays in einem Temperaturbereich von 20 bis 80 °C in 10 °C-Schritten durchgeführt.
Tabelle 2.34: Pipe erschema für den AAO-Assay zur Bes mmung des Temperaturop mums der Arylalkoholoxidase
AAO-Assay
Probe 50 μL
Puffer 750 μL
50 mM Veratrylalkohol in Puffer ( inal 5 mM) 100 μL Katalase in H2O ( inal 36 U) 100 μL
Das Temperaturoptimum für die rPsaDyP wurde für die Umsetzung der Substrate ABTS und β-Carotin in einem Temperaturbereich von 15 bis 75 °C in 5 °C Schritten untersucht.
Tabelle 2.35: Pipe erschema für die Reak onsansätze zur Bes mmung des Temperaturop mums der DyP-Typ Peroxidase
ABTS-Assay β-Carotin-Assay
Probe 25 μL 100 μL
Puffer 100 μL 720 μL
Substrat 75 μL 100 μL
H2O2 50 μL 80 μL
Gesamtvolumen 250 μL 1 000 μL
Der vortemperierte Puffer bzw. Reaktionsansatz wurde in eine Küvette in den entsprechend temperierten Schlitten gegeben und die Umsetzung durch Zugabe des Substrates gestartet.
2.6.4.4 Enzymak vität in Abhängigkeit der Wasserstoffperoxidkonzentra on
Die Aktivität der rPsaDyP für die Umsetzung der untersuchten Substrate wurde in Abhängigkeit der verwendeten Cosubstratkonzentration (H2O2, Endkonzentration: 0 bis 1,25 mM) untersucht.
Dazu wurden H2O2-Stocklösungen mit Konzentrationen von 0 bis 5 mM angesetzt. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von H2O2 gestartet und die Enzymaktivität am Mikroplattenleser verfolgt.
2.6.4.5 Sauersto onzentra on im Puffer
Der Ein luss der Sauerstof konzentration im Puffer auf die Reaktionsgeschwindigkeit der gerei-nigten rPsaDyP wurde mit 100 mM Natriumacetat-Puffer pH 3,8 untersucht. Dafür wurde der Puffer mit Sauerstoff an- bzw. abgereichert. Für die Anreicherung des Puffers mit Sauerstoff wurde das Gas mit einer Kerzenfritte (Porengröße 3, ⌀ 16 bis 40 μm) durch den Puffer geleitet (2× 15 min). Die Abreicherung des Puffers erfolgte durch Entgasung von 100 mL Puffer im Ultraschallbad für 1 h. Anschließend wurde der Kopfraum mit Stickstoff gesättigt. Die an- bzw.
abgereicherten Puffer wurden sofort für die Umsetzung von ABTS bzw.β-Carotin ohne Zusatz von H2O2verwendet. Als Kontrolle wurde Puffer verwendet, bei dem die gelösten Gase nicht künstlich variiert wurden.
2.6.4.6 Einfluss der Pipe erreihenfolge
Wie bereits beschrieben, wurde die Reaktion in der Regel durch Zugabe des Substrates bzw. des Cosubstrates gestartet. Da es vor allem bei der Zugabe von H2O2zu lokalen Inhibierungseffekten
kommen kann, wurde untersucht, welchen Ein luss die Pipettierreihenfolge auf die Enzymaktivi-tät hat. Dabei wurde die Reaktion gestartet durch:
• Enzym
• Substrat
• Cosubstrat
• Cosubstrat vorgelegt im Reaktionspuffer 2.6.5 Untersuchung der Enzymstabilität
Die Stabilität der gereinigten rPsaDyP wurde für verschiedene Faktoren untersucht. Dafür wurde die Ausgangsaktivität (100%) nach 1 min unter diesen Bedingungen ermittelt und die Restaktivität zu den unterschiedlichen Messzeiten in Relation dazu gesetzt. Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte bei den Untersuchungen mittels ABTS-Assay.
2.6.5.1 Salztoleranz
Für die Bestimmung der Salztoleranz wurde Natriumacetat-Puffer pH 4,0 verwendet, der 0 bis 1 M NaCl bzw. (NH4)2SO4enthielt. Der Puffer mit dem entsprechenden Salzgehalt wurde direkt für den Assay verwendet. Außerdem wurde die Aktivität der rPsaDyP nach Umpuffern und Lagerung (1 h, 4 °C) in Puffer mit 1 M Salz und nach erneutem Umpuffern in Puffer ohne Salz getestet.
2.6.5.2 Lagerstabilität
Die Stabilität des Enzyms wurde für die Lagerung bei −80 °C, −20 °C und 4 °C über einen Zeitraum von 6 Tagen untersucht. Für die Lagerung bei −20 °C und −80 °C wurde das Enzym mit lüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Kontrolle der Aktivität erfolgte an den Tagen 1, 2, und 6. Hierbei wurde untersucht, ob die Aktivität des Enzyms durch mehrfaches Auftauen bzw. Einfrieren beein lusst wird, indem eine Probe aufgetaut, die Aktivität bestimmt und die Probe erneut eingefroren wurde. Im Vergleich dazu wurde jeweils die Aktivität einer Probe bestimmt, die zuvor nicht aufgetaut wurde.
2.6.5.3 Stabilität unter Assaybedingungen
Stabilität des reinen Enzyms nach Verdünnen in Lösungen
Das Enzym wurde für den Einsatz im Assay abhängig vom verwendeten Substrat aus der Stocklösung bis 1:100 000 verdünnt. Dafür wurde das Enzym zunächst in Wasser oder Puffer vorverdünnt und anschließend in den Assay weiter verdünnt. Daher wurde die Stabilität des Enzyms nach Verdünnen untersucht, indem das verdünnte Enzym 24 h bei 4 °C gelagert und die Aktivität nach 0,5 h, 1 h, 2 h und 24 h gegenüber ABTS bestimmt wurde.
pH-Stabilität und Lösungsmitteltoleranz
Zur Untersuchung der pH-Stabilität wurde die DyP-Typ Peroxidase in Natriumacetat-Puffer im pH-Bereich von 3,0 bis 6,0 (0,5er Schritte) bzw. in McIlvaine-Puffer im pH-Bereich von 3,0 bis 5,5 (0,5 er Schritte) verdünnt. Direkt vor der Messung wurde die Probe nochmals 1:10 mit 100 mM Natriumacetat-Puffer pH 3,8 (Messpuffer) verdünnt, um den pH-Wert für die Messung nicht zu stark zu verändern. Nach 0,5 h, 1 h, 2 h und 24 h wurde die Aktivität bestimmt und mit der Ausgangsaktivität verglichen.
Für die Bestimmung der Lösungsmitteltoleranz wurde die Dyp-Typ Peroxidase in einer 30%igen Ethanol-Lösung in 100 mM Natriumacetat-Puffer pH 3,8 bzw. in Wasser bei 4 °C gelagert. Die Aktivität der Probe wurde nach 0,5 h, 1 h, 2 h und 24 h bestimmt.
Temperaturstabilität
Die Bestimmung der Temperaturstabilität erfolgte mit Vorverdünnungen in 50 mM Natrium-acetat-Puffer pH 4,5 über einen Zeitraum von 24 h bei 0 °C, 25 °C und 35 °C. Im Anschluss an die Lagerung wurde die Aktivität des Enzyms mit der Ausgangsaktivität verglichen.