3 Ergebnisse
3.6 GDS(L)-Lipase
3.6.2 Bioinforma sche Analyse der cDNA-Sequenz
Die klonierte cDNA-Sequenz umfasst 954 Basenpaare (Abb. 3.73) und codiert ein Protein mit einer Länge von 317 Aminosäuren. Die Sequenz wurde unter der Zugriffsnummer LN830263 bei EBI-EMBL veröffentlicht. Das Protein hat ein berechnetes Molekulargewicht von 33,3 kDa (ExPASy ProtParam, Tab. 2.12). Der pI wurde zu 4,86 berechnet. In der Sequenz wurden die konservierten StrukturmotiveGDSL(Leucin ist durch Tryptophan ersetzt) undGxSxGidenti iziert.
Die bei Sekretomuntersuchungen des PilzesPleurotus sapidusermittelten Peptidsequenzen (Tab.
3.1) sind in der abgeleiteten Aminosäuresequenz enthalten (Abb. 3.73).
Anhand von Datenbankrecherchen (BlastN, NCBI , InterProScan 4) wurde eine Homologie der Aminosäuresequenz zu Enzymen der SGNH-Hydrolase Superfamilie festgestellt (Abb. 3.74).
Durch bioinformatische Untersuchungen (Pfam HMM, NCBI CDD) wurde das Enzym eindeutig als Mitglied der GDS(L)-Lipase/Acylhydrolase-Familie (PF00657; CD01846) identi iziert, die zu dieser Superfamilie gehören.
SignalP-NN (euk)
unintegrated noIPR
signal-peptide InterPro Match
317
1 Query Sequence
3.40.50.1110
SGNH hydrolase-type esterase domain IPR013831
SSF52266 PF00657
GDSL lipase/esterase IPR001087
PS01098
Lipase, GDSL, acitve site IPR008265
SIGNALP
GENE3D PROSITE SUPERFAMILY TMHMM
Abbildung 3.74: Funk onelle Analyse der übersetzten Aminosäuresequenz mi els InterProScan
Bei den weiteren bioinformatischen Untersuchungen wurde in der aus der cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz mittels SignalP 4.1 (Petersenet al. 2011) eine potentielle Schnittstelle für eine Signalpeptidase zwischen den Aminosäuren 16 und 17 ermittelt. Demnach besteht das reife Protein aus 438 Aminosäuren und hat ein berechnetes Molekulargewicht von 31,6 kDa.
Mit Hilfe der Programme NetNGly1.0 (Gupta et al. 2004) und NetOGly 3.1 (Julenius et al.
2005) wurde die Sequenz auf potentielle Glykosylierungsstellen untersucht und keine potentielle N-Glykosylierungsstelle, jedoch fünf potentielle O-Glykosylierungsstellen ermittelt.
Weiterhin wurde untersucht, ob eine Cellulose-Bindungsdomäne (CBD), die ein Indiz für eine Beteiligung am Abbau von Lignocellulosen ist, vorhanden ist. Mittels Datenbankrecherche wurde keine bekannte CBD in der Aminosäuresequenz gefunden.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenz mit Datenbanken (NCBI, BlastP; EMBL-EBI Blast+) zeigte, dass das Enzym nur sehr geringe Homologien zu bereits charakterisierten Lipasen/Esterasen aufweist. Die Identität zur Feruloylesterase (NCBI: CBE71381) bzw. zur Xanthophyllesterase (NCBI: CAH17527) ausPleurotus sapidus war jeweils kleiner als 10%. Die Sequenz zeigte die höchste Homologie zu einem lipolytischen Protein aus der GDS(L)-Familie ausMoniliophthora roreri3(EMBL: ESK93427; Identität 51%).
Ein Vergleich der Nukleotidsequenz der isolierten Lipase mit dem Genom vonPleurotus ostreatus (Joint Genome Institute JGI, PC 15 v.2, BlastN) ergab eine Ubereinstimmung von 92% zu einer Nukleotidsequenz (estExt_fgenesh1_pg.C_030854), die eine Identität von 81% zu einem als Phospholipase/Lecithinase/Hämolysin annotiertem Protein ausBurkholderia dolosazeigt. Die übersetzten Aminosäurensequenzen zeigen eine Ubereinstimmung von 96% (Abb. 3.75).
Psa MLRSFVVLTS VCAAYAAVLP RDAPNGVHLA VDPKCGVAGG RFGDVNIGLK PLTSYEHIVA 60 Pos MLRSFVVLTS VCAAYAAVLP RDALNGVHLA VDPKCGVAGG RFGDVNIGLK SLTSYEHIVA 60
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Psa FGDSWTDGGA HNGEPLPPPV LTPPNPRAGG RASNGPVWVE KLASAAGATL LDFAEIGAVT 120 Pos FGDSWTDGGA HDGEPLPPPI LTPPNPRAGG RASDGPVWVE RLASAAGATL LDFAEIGAVT 120
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Psa DKNIWPSSLL PTTASSANDF VGQAHNYINQ RNGFDPETTL YTIFLGVGDF DLSQQTGTDN 180 Pos DKNIWPKTLL PTTSSGANDF VGQAHNYINQ RNGFDPETTL YTIFLGVGDF DLSQQTGTDN 180
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Psa LYTVAGAIVY TILELTSYPT YAKNIIVVDN YGRGIYETPS GDAFKEGIYA GLNTLHTRYG 240 Pos LYTVAGAIVY TILELTSYPT YAKNIIVVDN YGRGIYETPS GDAFKEGIYA GLNTLHTRYG 240
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Psa TSVGFVDLKT LWDGVLGSSP GYEAFGYTSK AACLPSSTST SGACANPEST FYWLPGIPSA 300 Pos TNVGFVDLKT LWDGVLGSSP GYEAFGYTSK GACLPSSTST SGACANPEST FYWLPGIPSA 300
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Psa ATHGLIADYV EKVLTTC 317
Pos ATHGLIADYV EKVLTTC 317
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Abbildung 3.75: Vergleich der Aminosäuresequenz der GDS(L)-Lipase aus Pleurotus sapidus (Psa) mit einer poten ellen GDS(L)-Lipase vonPleurotus ostreatus (Pos), deren Sequenz aus dem Genom abgeleitet wurde (JGI).
Hervorgehoben sind dasGDS(L)-Mo v und dasGxSxG-Mo v. Konservierte Aminosäuren sind mit einem Stern gekennzeichnet
Das aktive Zentrum lipolytischer Enzyme bildet die sogenannte katalytische Triade aus den konservierten Aminosäuren Ser, Asp oder Glu und His. Mit Ausnahme des Serins, das im namensgebenden GDSL-Motiv lokalisiert ist, wurden die anderen Reste der katalytischen Triade bei beiden Sequenzen nicht zugeordnet.
Mittels SWISS-MODEL wurde versucht, eine 3D-Struktur für die GDS(L)–Lipase zu erstellen.
Als Template wurden die Esterase estA aus Pseudomonas aeruginosa (PDB-ID: 3KVN) sowie Xylanesterasen (PDB-ID: 4JJ6 und 2WAA) bzw. eine Lipase (PDB-ID: 1YZF) verwendet. Die Sequenzen zeigten allerdings lediglich eine Ubereinstimmung von 18% bis 21%. Die Homologie der Strukturen war zu gering, um ein aussagekräftiges Modell erstellen zu können.
3.6.3 Heterologe Expression
Die codierende Sequenz der GDS(L)-Lipase ausPleurotus sapiduswurde zur heterologen Expres-sion inTrichoderma reeseian die Firma AB Enzymes weitergeleitet. Für die Expression der Lipa-se-DNA wurden drei Expressionsvektoren konstruiert (s. 7.2.3). In allen Konstrukten stand das Lipase-Gen unter der Kontrolle des cbhI-Promotors (Cellobiohydolase I) und cbhI-Terminators vonT. reesei:
• pAB500-LipPS: Lipase-Gen mit seiner Signalsequenz;
• pAB510-LipPS: Lipase-Gen ohne mittels SignalP vorhergesagte Signalsequenz; die Sekretion wird durch die cbhI-Signalsequenz vermittelt;
• pAB600-LipPS: Lipase-Gen ohne berechnete Signalsequenz mit einem cbhII (Cellobiohydrolase II) Carrier fusioniert. Die cbhII-Signalsequenz dient der Sekretion des cbhII-KexII-Lipase Fusionspro-teins. Die proteolytische Spaltung des Fusionsproteins durch die Erkennungsstelle für die KexII Protease (Lys-Arg) innerhalb des Konstrukts führt zur Bildung von aktiver Lipase.
Sechs Transformanten, die die Lipase exprimierten, wurden von der Firma AB Enzymes in 0,5 L Fermentern im fed-batch- und batch-Verfahren kultiviert und der Kulturüberstand für weitere Untersuchungen zur Verfügung gestellt. Die Enzymaktivität wurde nach 88 h, 116 h, 137 h und 161 h anhand des p-Nitrophenylpalmitat-Assays (pNPP-Assays; 2.6.9.1) untersucht (Abb.
3.76). Die Aktivitäten nachbatch-Kultivierung (Medium D5) waren stets deutlich höher als nach fed-batch-Kultivierung. Der Stamm RH32919, dessen Expressionskassette das Konstrukt mit der Lipasesignalsequenz (pAB500) enthält, erreichte die höchste Aktivität mit 370 U L−1nach 161 h.
Der Stamm RH32929 mit dem Konstrukt pAB600 erreichte das Aktivitätsmaximum mit 350 U L−1 nach 137 h. Das Aktivitätsmaximum des Stammes RH32924 (pAB510) lag bei 280 U L−1 nach 137 h. Die drei weiteren Stämme zeigten geringere Aktivitäten.
EnzymaktivitätinUL-1
RH32919 D5 RH32924 D5 RH32929 D5 0
50 100 150 200 250 300 350 400
n 88 h n 116 h n 137 h n 161 h
Abbildung 3.76: Ak vität der GDS(L)-Lipase in Kulturüberständen der Stämme RH32919, RH32924, RH32929 (batch-Kul vierung)
3.6.4 Proteinbiochemische Charakterisierung der rekombinanten GDS(L)-Lipase aus Pleurotus sapidus
Der Kulturüberstand wurde mittels SDS-PAGE sowie mittels halbnativer PAGE analysiert. Im Anschluss an die Elektrophorese wurde das SDS-Gel mit colloidalem Coomassie gefärbt (Abb. 3.77 A). Das halbnative Gel wurde geteilt, eine Hälfte wurde mit colloidalem Coomassie gefärbt, mit der anderen Hälfte wurde eine Aktivitätsfärbung mitα-Naphthylacetat durchgeführt (s. 2.4.3.6, Abb.
3.77 B). Der Nachweis der heterologen Expression sowie die Identi izierung der Lipase im Gel erfolgte über die Aktivitätsfärbung.
1 2
200150 12010085 7060 50 40 30 25 20
kDa M 1
A B
Abbildung 3.77: Elektrophore sche Analyse des Kulturüberstandes mit exprimierter GDS(L)-Lipase und Ak vi-tätsfärbung mitα-Naphtylacetat
A– SDS-PAGE,B– halbna ve SDS-PAGE, 12%igM– Proteinstandard 1– colloidal Coomassiefärbung
2– Ak vitätsfärbung mitα-Naphthylacetat
Mittels SDS-PAGE wurde für die GDS(L)-Lipase ein apparentes Molekulargewicht von 34 kDa bestimmt (Abb. 3.77 A), das mit dem anhand der cDNA kalkulierten Molekulargewicht der GDS(L)-Lipase mit Signalsequenz von 33,3 kDa gut übereinstimmt.
Für die Bestimmung des pI wurde mit dem Kulturüberstand eine isoelektrische Fokussierung durchgeführt (s. 2.4.2.5). Das IEF-Gel wurde nach der Fokussierung geteilt und eine Hälfte mit colloidalem Coomassie gefärbt, mit der anderen wurde eine Aktivitätsfärbung durchgeführt (s. 2.4.3.6). Anhand der Aktivitätsfärbung wurde ein apparenter isoelektrischer Punkt zu 5,0 ermittelt (Abb. 3.78), der mit dem berechneten pI von 4,9 gut übereinstimmt.
8,38,0 7,8
6,9 / 7,4 5,2 / 5,36,0
4,2 / 4,5 3,5
M 1 2
pI 9,5
Abbildung 3.78: Isoelektrische Fokussierung zur Bes mmung des pI der rekombinanten GDS(L)-Lipase
M– Proteinstandard,1– colloidal Coomassiefärbung, 2– Ak vitätsfärbung mit α-Naphthyl-acetat
3.6.5 Bes mmung des op malen Puffers
Zunächst wurde die Aktivität des Enzyms mit dem Esterase-Assay (s. 2.6.10) nach Purdy und Kolattukudy (1973) in folgenden Puffern (s. 2.6.1) untersucht:
Sørensen-Phosphat-Puffer pH 8,0 Kaliumphosphat-Puffer pH 7,0 Natriumacetat-Puffer pH 6,0 MOPS-Puffer pH 6,0
Bernsteinsäuretartrat-Puffer pH 6,0
Eine hohe Aktivität wurde bei der Verwendung von Kaliumphosphat-Puffer pH 7,0 bzw. Sørensen-Phosphat-Puffer pH 8,0 ermittelt. Im Vergleich dazu lag die Aktivität bei der Verwendung von Puffern mit pH 6,0 zwischen 20% und 30% der in Kaliumphosphat-Puffer pH 7,0 ermittelten Aktivität. Um einige Substrate in Lösung zu bringen, wurde DMSO verwendet. Daher wurde die Aktivität des Enzyms untersucht, nachdem den Puffern 3% (v/v) DMSO zugesetzt wurde. Durch diesen Zusatz wurde die Aktivität der Lipase nicht beein lusst.
3.6.6 Untersuchung der Substratspezifität
Das Protein wurde hinsichtlich seiner biokatalytischen Eigenschaften gegenüber p-Nitrophenyl-estern untersucht (s. 2.6.10).
Tabelle 3.13: Ak vität der GDS(L)-Lipase gegenüberp-Nitrophenylestern p-Nitrophenylester Aktivität in U L−1 p-Nitrophenyloctanoat 825 p-Nitrophenylvalerat 264 p-Nitrophenylbutyrat 516 p-Nitrophenylacetat 455
Die Aktivität der GDS(L)-Lipase steigt mit zunehmender Kettenlänge der Ester und einer geraden Anzahl an C-Atomen (s. 3.13). Die Aktivität gegenüber p-Nitrophenylpalmitat wurde mittels NPP-Assay nach Winkler und Stuckmann (1979) bestimmt, da diese mit dem verwendeten Assay nicht valide bestimmt werden konnte. Dabei zeigte das untersuchte Enzym eine hohe Aktivität (368 U L−1), was auf eine Lipaseaktivität hindeutet.
3.6.7 Untersuchung auf Feruloylesteraseak vität
Die Aktivität des Enzyms gegenüber dem Substrat Ferulasäuremethylester wurde untersucht, um zu überprüfen, ob das Enzym Feruloylesteraseaktivität aufweist (s. 2.6.10.1). Die Differenz der Absorptionsmaxima von freier Ferulasäure und Ferulasäuremethylester unter den gegebenen Bedingungen ermöglichen es, die Hydrolyse des Esters spektroskopisch zu messen (Raletet al.
1994). Der Ferulasäuremethylester wurde für 72 h bei 37 °C mit dem Enzym bzw. als Kontrolle mit hitzeinaktiviertem Enzym inkubiert. Anschließend wurde ein Spektrum von 280 bis 340 nm aufgenommen (Abb. 3.79).
λin nm 1,45
1,40 1,35 1,30 1,25 1,20 1,15
Extinktion
280 290 300 310 320 330 340
nach 72 h Inkuba on in 0,1 M MOPS-Puffer pH 6,0 Kontrolle, Reak onsansatz mit hitzeinak viertem Enzym
Abbildung 3.79: Veränderung des Absorp onsspektrums vor und nach der Hydrolyse des Ferulasäuremethyl-esters
Das Spektrum verschob sich nach 72 h in Richtung des Spektrums der freien Ferulasäure. Zu Beginn der Messung war eine Bande bei 322 nm sichtbar, welche auf die veresterte Ferulasäure zurückzuführen ist. Die Absorption bei 322 nm nahm mit der Reaktionszeit ab, während die Absorption bei 293 nm zunahm.
Weiterhin wurde die Aktivität des Enzyms gegenüber dem Modellsubstrat 5-O-trans-feruloyl-L-arabinofuranose (F-A) nach Linkeet al. (2013) untersucht und die Hydrolyse mittels HPLC analysiert (s. 2.6.11). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.14 zusammengefasst.
Tabelle 3.14: Umsetzung von 5-O-transferuloyl- -Arabinofuranose durch die GDS(L)-Lipase F-A in FEa freie Ferulasäure in FE 5-O-transferuloyl- -Arabinofuranose (F-A) 4483005 33309
Negativkontrolle (hitzeinaktiviertes Enzym) 4880842 33215
Umsetzung mit GDS(L)-Lipase 5306896 73608
aFE - Flächeneinheiten
Mittels HPLC war im Vergleich zur Negativkontrolle eine nicht signi ikante Umsetzung des Substrates nachzuweisen.