2 Material und Methoden
2.3 Molekularbiologische Methoden
2.3.6 Klonierung und Modifika on von DNA
Gen-spezi ischen Primer kombiniert. Der vektorspezi ische Primer bindet auf dem Vektor außer-halb des Inserts, während der andere Primer am gegenüberliegenden Ende im Insert bindet. So entsteht ein Fragment, welches ca. 200 bp größer ist als das Insert.
Kolonie-PCR-Ansatz
template Zellen vonE. coli
10×CoralLoad PCR-Puffer 1 × 2,0 μL
dNTP-Mixa(je 10 mM) 200 μM 0,4 μL
Primer fwd (10 μM) 0,1-0,5 μM 1,0 μL
Primer rev (10 μM) 0,1-0,5 μM 1,0 μL
HotStar Taq (5 U μL−1) 0,025 U μL−1 0,1 μL
Reinstwasser ad 20 μL
aDer dNTP-Mix wurde selbst hergestellt. Dafür wurden die lyophilisierten Desoxyribonukleosidtriphosphate so gelöst, dass eine 100 mM-Stammlösung erhalten wurde. Anschließend wurden je 10 μL der dNTPs zu 60 μL Reinstwasser gegeben und der Mix bei −20 °C gelagert.
Das Cyclerprogramm wurde entsprechend der Größe des Inserts für die Kolonie-PCR angepasst.
TOPO-Vektor (Invitrogen) besitzt an seinen 5'-Enden einzelne Desoxythymidinreste, die kova-lent mit einer Vaccina Topoisomerase-I verknüpft sind und somit eine noch ef izientere Ligation mit PCR-Produkten ermöglichen. Die Vaccina Topoisomerase-I besitzt eine hochspezi ische Endo-nukleaseaktivität und schneidet DNA am Konsenus-Pentapyrimidin-Element5'(T/C)CCTT↓und bleibt anschließend mit dem3'-Phosphat kovalent verbunden (Shuman 1994). Die Topoisome-rase kann die ursprüngliche Bindung im DNA-Strang wieder herstellen (wie bei der Entspannung von DNA) oder eine heterologe Akzeptor-DNA ligieren. Bei beiden verwendeten Systemen ist die Selektion Insert-positiver Transformanten mittels Blau/Weiß-Screening (s. 2.2.5) möglich.
Für die Ligation wurden die PCR-Produkte im Verhältnis zum Vektor in einem dreifach molaren Uberschuss eingesetzt.
Ligationsansatz
TA-Klonierung TOPO-TA-Klonierung
frisches PCR-Produkt X μL frisches PCR-Produkt X μL
10×Ligationspuffer 1 μL Salzlösung 1 μL
pCR™ 2.1-Vektor (25 ng μL−1) 2 μL pCR®II TOPO Vektor (10 ng μL−1) 1 μL
T4-DNA-Ligase 1 μL
H2O (steril) ad 10 μL H2O (steril) ad 6 μL
Ligation über Nacht bei 16 °C Ligation 30 min bei RT
Die verschiedenen Ligationsansätze sind in Tabelle 2.17 zusammengefasst. 2 μL jedes Ligations-ansatzes wurden inE. coliTop10-Zellen transformiert (2.2.4) und Insert-positive Transformaten mittels Blau/Weiß-Screening (s. 2.2.5) identi iziert. Je 10 Insert-positive Einzelklone wurden bezüglich ihrer Plasmid-DNA analysiert (s. 2.3.5.2). Von Transformanten, die einen Insert mit der erwarteten Größe hatten, wurden Ubernachtkulturen angesetzt und die Plasmide isoliert (s.
2.3.7). Die Plasmide von je zwei bis sechs Insertpositiven Klonen wurde zum Sequenzieren an die Firma Euro ins MWG Operon gesendet (s. 2.3.7.1). In Tabelle 2.17 ist jeweils der Plasmidklon angegeben, der für die Konstruktion der Expressionsvektoren (s. 2.3.6.4) verwendet wurde.
Tabelle 2.17: Zusammenfassung der Liga onen für die Herstellung der verschiedenen Klonierungsvektoren Ligierte Fragmente Plasmidklon mit sequenziertem Insert pCR2.1-TOPO 3931 kb +
pCR2.1-TOPO-AAO # TOPO4K3(2) cDNA AAO 1782 kb
pCR2.1-TOPO 3931 kb +
pCR2.1-TOPO-GDS(L)-Lipase # Taq 9.1.2 cDNA GDS(L)-Lipase 954 kb
pCR2.1-TOPO 3931 kb +
pCR2.1-TOPO-DyP # Dyp-Typ_K10 cDNA DyP-TyP Peroxidase 1551 kb
2.3.6.3 Gensynthese
Für die Arylalkoholoxidase ausPleurotus sapiduswurde ein synthetisches Gen bei der Firma MWG Operon generiert und in den Vektor pBS II SK(+) kloniert. Dabei wurde diecodon usagefür eine Expression inE. coliB optimiert (s. 7.1) und die Sequenz mit den lankierenden Restriktions-schnittstellen NdeI/XhoI versehen, die eine Klonierung in das pColdI-Plasmid erlauben.
2.3.6.4 Konstruk on von Expressionsvektoren
Für die heterolge Expression der Zielenzyme wurde die cDNA mit und ohne Signalsequenz in verschiedene Expressionsvektoren (Tab. 2.9) kloniert. Dafür wurde das Insert aus den Klonie-rungsvektoren (Tab. 2.17) zunächst mittels PCR ampli iziert, wobei mit Hilfe der Primer Restrik-tionsschnittstellen an den Enden der Fragmente angefügt wurden (Scharf et al. 1986). Nach der Reinigung wurden die PCR-Produkte asymmetrisch mit Restriktionsenzymen geschnitten.
In gleicher Weise wurde der Zielvektor asymmetrisch linearisiert. Die Verwendung von zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen verhindert eine Rezirkularisierung des Zielvektors und ermöglicht die Einführung des Inserts in Leserichtung.
2.3.6.5 DNA-Verdau mi els Restrik onsenzymen
Restriktionsendonukleasen sind eine Gruppe an Enzymen, die die Phosphordiesterbindung der DNA an spezi ischen Stellen hydrolysieren. Für jede Restriktionsendonuklease gibt es spezi ische Inkubationstemperaturen und Reaktionspuffer. Werden diese nicht optimal gewählt, kann es zu einer veränderten Aktivität kommen, die als
”star activity“ bezeichnet wird. Diese tritt vor allem bei zu hoher Enzymaktivität (eingesetzte Units) oder falschen Salzbedingungen auf.
Die Restriktionsspaltungen wurden verwendet, um DNA-Fragmente mit kompatiblen Enden für die Klonierung herzustellen. Dafür wurden Ansätze mit einem Volumen von 20 μL bzw.
30 μL gewählt und 0,5 μg PCR-Produkt bzw. 1 μg Plasmid-DNA eingesetzt. In der Regel wurden Restriktionsspaltungen direkt mit zwei Enzymen durchgeführt. Ausnahme waren Enzyme, die auf Grund der Position der Schnittstellen nicht kompatibel waren. Der Verdau erfolgte bei 37 °C im vom Hersteller empfohlenen Puffer. Die Erkennungssequenzen und die Schnittstellen der verwendeten Enzyme sind in Tabelle 2.7 dargestellt. Die Inkubationszeit variierte zwischen 1 und 4 h. Von jedem Restriktionsenzym wurden 10 bis 20 U verwendet.
2.3.6.6 Sequen eller Verdau
Der sequentielle Verdau erfolgte anlog zu 2.3.6.5. Zunächst wurde die Restrikiton mit dem ersten Enzym für 4 h bei 37 °C durchgeführt. Anschließend wurde dem Restriktionsverdau das zweite Restriktionsenzym (1 μL, 10 U μL−1) zugefügt und die Proben für weitere 60 min bei 37 °C inkubiert. Nach dem Restriktionsverdau erfolgte die Hitzeinaktivierung der Enzyme (80 °C, 15 min).
2.3.6.7 Restrik on mit FastDigest™ Enzymen
Teilweise wurden FastDigest™ Enzyme verwendet. Diese Enzyme sind in der Lage 1 μg DNA in 5 min und somit deutlich schneller als andere handelsübliche Restriktionsenzyme zu verdauen.
Außerdem können alle Restriktionsenzyme in einem Reaktionspuffer verwendet werden. Die Restriktion erfolgte unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen (37 °C in 1× FastDigest Puffer). Die Inkubationszeit wurde abweichend von den Herstellerangaben auf 30 min erhöht.
Nach dem Restriktionsverdau erfolgte die Hitzeinaktivierung der Enzyme und die Fragmente wurden mittels Agarosegelelektrophorese getrennt. Die relevanten DNA-Fragmente wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem PCRclean upGel ExtractionKit von Macherey-Nagel aus dem Gel isoliert. Die Elution der DNA erfolgte mit 30 μL nukleasefreiem Wasser. Anschließend wurde die Konzentration photometrisch (NanoPhotometer®) bestimmt.
Zusammensetzung des Restriktionsverdaus
PCR-Produkt Vektor
DNA 0,5 μg 1 μg
10×Fast Digest Puffer 3 μL 2 μL
Restriktionsenzym1 (10 U μL−1) 2 μL 1 μL Restriktionsenzym2 (10 U μL−1) 2 μL 1 μL
H2O ad 30 μL 20 μL
2.3.6.8 Liga on
Für die Ligation der Inserts in die Expressionsvektoren wurden 50 bis 100 ng des restriktions-verdauten Vektors und die dreifache molare Menge an Insert zusammen mit der vom Hersteller empfohlenen Menge an T4-DNA-Ligase in Ligasepuffer inkubiert. Das Ansatzvolumen entsprach 20 μL. Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur (RT) für 2 h oder über Nacht bei 8 °C.
Ligationsansatz
PCR-Produkt, geschnitten X μL
5×Ligationspuffer 4 μL
Vektor, linearisiert X μL
T4-DNA-Ligase 2 μL
H2O (steril) ad 20 μL
Die unterschiedlichen Ligationen sind in Tabelle 2.18 zusammengefasst. Verschiedene chemisch kompetenteE. coli-Stämme wurden mit den Ligationsansätzen transformiert und ampicillinresis-tente Einzelklone bezüglich ihrer Plasmid-DNA mittels Kolonie-PCR analysiert. Die Insertsequenz wurde bei je zwei bis sechs positiven Plasmidklonen sequenziert (Firma Euro ins MWG Operon).
Plasmidklone mit einer korrekten Insertsequenz wurden zur Stammgenerierung verwendet.
Tabelle 2.18: Zusammenfassung der Konstrukte der verschiedenen Expressionsplasmide
Fusionsprotein Klonierungselemente Restriktionsenzyme Plasmidklon mit sequenziertem Insert
His6-AAO pET 15b
NdeI/XhoI pET 15b AAO #1(3), 1(5) PCR-Produkt AAO
His6-AAO
a pColdI
NdeI/XhoI pColdI-AAO #K1(+), K3(+)
PCR-Produkt AAO pColdI-AAO #K5(–) K3 (–)
MBP-AAO pMal-c4x
XbaI/SalI pMAL-c4x AAO # c7, c10 PCR-Produkt AAO
MBP-AAO pMal-p4x
XbaI/SalI pMAL-p4x AAO # p1, p3 PCR-Produkt AAO
His6-GDS(L) pET 15b
NdeI/BamHI pET 15b GDS(L) #3 PCR-Produkt GDS(L)
aSynthetisches Gen