3 Ergebnisse
3.4 DyP-Typ Peroxidase
3.4.8 Op mierung der Reak onsbedingungen
Die Enzymaktivität zeigt für den Umsatz von ABTS bei allen verwendeten Puffern ein signi ikantes Maximum bei pH 4,0. Oberhalb bzw. unterhalb dieses pH-Wertes sank die Enzymaktivität stark ab.
Das Enzym ist somit nur in einem engen pH-Bereich, abhängig vom verwendeten Puffer, zwischen pH 3,5 und pH 4,5 aktiv. Die größte Aktivität der DyP-Typ Peroxidase wurde im Natrium- bzw.
Kaliumacetat-Puffer bestimmt (Abb. 3.50). Bei Verwendung des McIlvaine-Puffers pH 4,0 wurden lediglich 5̃0% der im Natrium- bzw. Kaliumacetat-Puffer bestimmten Aktivität nachgewiesen.
Als Reaktionspuffer für den Umsatz von ABTS wurde für die weiteren Aktivitätsbestimmungen ein Natriumacetat-Puffer pH 4,0 verwendet.
pH-Wert
relativeEnzymaktivitätin%
2 3 4 5 6 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6 0
20 40 60 80 100
n Natriumacetat-Puffer n K-McIlvaine-Puffer n HCl/Glycin-Puffer n McIlvaine-Puffer n Natriumtartrat-Puffer
Abbildung 3.51: Rela ve Enzymak vität der DyP-Typ Peroxidase gegenüberβ-Caro n in Abhängigkeit vom verwendeten Puffer und pH-Wert
Die höchste Enzymaktivität für den Abbau vonβ-Carotin wurde bei den verwendeten Puffern zwischen pH 3,0 und 3,5 gezeigt. Bei pH-Werten zwischen 2,0–2,5 und 4,0–6,0 betrug die Enzymaktivität noch zwischen 60% und 80%. Die Enzymaktivität blieb somit über einen breiten pH-Bereich relativ konstant. Die höchste Aktivität der DyP-Typ Peroxidase wurde im Natriumacetat-Puffer pH 3,5 beobachtet (Abb. 3.51). Daher wurden alle weiteren Umsetzungen vonβ-Carotin mit Natriumacetat-Puffer bei diesem pH-Wert durchgeführt.
3.4.8.2 Bes mmung des pH-Op mums
Die Bestimmung des optimalen Reaktionspuffers hat gezeigt, dass für den Umsatz von ABTS die Aktivität bei pH 4,0 am höchsten war. Für die Bestimmung des exakten pH-Optimums wurde die Enzymaktivität in einem pH-Bereich von 3,5 bis 4,2 in 0,1er-Schritten im Natriumacetat-Puffer (50 mM) überprüft (s. 2.6.4.1). Die Enzymaktivität war bei pH 3,8 maximal (Abb. 3.52). Für die weitere Charakterisierung der DyP-Typ Peroxidase wurde daher ein Natriumacetat-Puffer pH 3,8 verwendet.
pH-Wert
relativeEnzymaktivitätin%
3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 4,0 4,1 4,2 0
20 40 60 80 100
Abbildung 3.52: Rela ve Enzymak vität der DyP-Typ Peroxidase für den Umsatz von ABTS in Abhängigkeit vom pH-Wert
Für β-Carotin wurde das pH-Optimum nicht genauer bestimmt, da die Aktivität bei allen verwendeten Puffersystemen gegenüber diesem Substrat über einen breiten pH-Bereich relativ konstant blieb.
3.4.8.3 Bes mmung der op malen Pufferkonzentra on
Die Ermittlung der optimalen Konzentration des Natriumacetat-Puffers erfolgte bei einem pH-Wert von 3,8 für den Umsatz von ABTS und 3,5 für den Abbau vonβ-Carotin (s. 2.6.4.2).
relativeEnzymaktivitätin%
0 20 40 60 80 100
40 50 60 80 100 150 200 250 300 350
20
n ABTS n β-Caro n
Abbildung 3.53: Rela ve Enzymak vität der DyP-Typ Peroxidase in Abhängigkeit von der Konzentra on des verwendeten Natriumacetat-Puffers
Die Enzymaktivität für den Abbau von ABTS war in einem 100 mM Natriumacetat-Puffer am höchsten (Abb. 3.53). Bei einer Konzentration von 50 mM lag die relative Enzymaktivität noch bei ca. 75%. Für alle weiteren Messungen mit ABTS wurde daher ein 100 mM Natriumacetat-Puffer pH 3,8 verwendet.
Für den Abbau von β-Carotin lag die Enzymaktivität über den gesamten Konzentrationsbe-reich zwischen 80% und 100% (Abb. 3.53). Für die folgenden Untersuchungen wurde ein 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 3,5 verwendet.
3.4.8.4 Bes mmung des Temperaturop mums
Temperatur in °C
relativeEnzymaktivitätin%
0 20 40 60 80 100
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 75
n ABTS n β-Caro n
Abbildung 3.54: Rela ve Enzymak vität der DyP-Typ Peroxidase in Abhängigkeit der Temperatur
Das Temperaturoptimum wurde mit 100 mM Natriumacetat-Puffer pH 3,8 (ABTS) bzw. 50 mM Natriumacetat-Puffer pH 3,5 (β-Carotin) bestimmt (s. 3.4.8.2, 3.4.8.3). Das Temperaturoptimum wurde in einem Bereich von 15 bis 75 °C untersucht (s. 2.6.4.3). Die Aktivität der DyP-Typ Peroxidase war bei beiden Substraten bei Temperaturen von 15 bis 30 °C maximal (Abb. 3.54).
Das Enzym behielt bis 45 °C eine hohe Aktivität. Deshalb wurden alle weiteren Messungen mit ABTS bei 25 °C und mitβ-Carotin bei 30 °C durchgeführt.
3.4.8.5 Einfluss der Wasserstoffperoxidkonzentra on
Die Enzymaktivität wurde sowohl ohne H2O2- als auch mit H2O2-Zusatz bestimmt. Hierbei wurden Wasserstoffperoxidkonzentrationen in einem Bereich von 12,5 bis 1 250 μM (im Assay) verwendet (s. 2.6.4.4). Die Enzymaktivität wurde durch die Erhöhung der H2O2-Konzentration signi ikant gesteigert (Abb. 3.55). Die Aktivität der DyP-Typ Peroxidase war bei der Wasserstoff-peroxidkonzentration von 125 μM für beide Substrate maximal. Für den Umsatz von ABTS wurde eine Steigerung der Aktivität um 96% und für den Umsatz vonβ-Carotin um 40% erreicht. Eine weitere Erhöhung der H2O2-Konzentration führte schließlich zu einer Hemmung der Enzymakti-vität. Bei 1 250 μM betrug die Aktivität gegenüberβ-Carotin noch 66% der maximalen Aktivität, während die Aktivität gegenüber ABTS nur noch 5% der maximalen Aktivität betrug. Daher
Die Umsetzung des Substratesβ-Carotin erfolgte auch ohne die Zugabe von H2O2. Die Aktivität des Enzyms gegenüberβ-Carotin betrug ohne H2O2bereits 60% der maximalen Aktivität.
H2O2-Konzentra on in µM
relativeEnzymaktivitätin%
0,0 12,5 62,5 125,0 350,0 625,0 1250,0
0 20 40 60 80 100
n ABTS (500 μM ABTS, 0,27 nM rPsaDyP) n β-Caro n (24 mMβ-Caro n, 54 nM rPsaDyP)
Abbildung 3.55: Rela ve Enzymak vität in Abhängigkeit von der H2O2-Konzentra on
Die optimale Konzentration an H2O2ist sowohl von der Substrat- als auch von der Enzymkonzen-tration abhängig. Daher wurde bei Anderung eines Parameters stets die optimale H2O2 -Konzen-tration ermittelt. Bei der Messung der kinetischen Parameter wurden die Aktivitäten stets bei unterschiedlichen H2O2-Konzentrationen gemessen und die Konzentration gewählt, die keinen limitierenden Effekt auf die Aktivität hatte (s. 2.6.6.2, 3.4.10.2).
3.4.8.5.1 Einfluss der Pipe erreihenfolge
Prinzipiell kann eine Reaktion durch die Zugabe des Substrates (auch des Cosubstrates) oder des Enzyms gestartet werden. Daher wurde der Ein luss der Startkomponente (rPsaDyP bzw. H2O2) auf die Aktivität des Enzyms untersucht (s. 2.6.4.6).
relativeEnzymaktivitätin%
0 20 40 60 80 100
nEnzym nH2O2 nH2O2/Puffer nSubstrat
Abbildung 3.56: Bes mmung Enzymak vität in Abhängigkeit der Komponente, mit der der ABTS-Assay gestartet wurde unter Sä gungsbedingungen (2,5 mM ABTS)
Durch Starten der Reaktion mit Enzym im Vergleich zum Start mit H2O2 war die ermittelte Aktivität um den Faktor 1,7 höher (Abb. 3.56). Wurde die Reaktion mit einem Gemisch aus Puffer und H2O2gestartet, wurde eine vergleichbare Aktivität zum Start mit Enzym ermittelt, und die Messungen erbrachten stabilere Werte.
Das Starten der Reaktion mit dem Substrat führte bei der Umsetzung von ABTS ebenso wie das Starten der Reaktion mit H2O2 zu einer Erniedrigung der Enzymaktivität (62% im Vergleich zu Start mit H2O2/Puffer). Bei der Oxidation von Guajakol betrug die Aktivität beim Start der Reaktion mit Substrat im Vergleich zu der mit H2O2/Puffer gestarteten Reaktion nur noch etwa 10%. Daneben wurde bei der Umsetzung von Guajakol zu Beginn eine kurze lag-Phase nachgewiesen, die bei der Umsetzung von ABTS nicht beobachtet wurde. Daher wurden die folgenden Messungen durch die Zugabe von H2O2/Puffer gestartet.
3.4.8.6 H2O2-Gehalt derβ-Caro n-Stammlösung
Für die Herstellung der β-Carotin-Stammlösung (s. 2.6.3.1) wurde kommerziell erhältliches Tween®80 als Emulgator verwendet, das geringe Mengen Peroxide enthalten kann. Daher kann die Substrat-Stammlösung ebenfalls Spuren von Peroxiden enthalten. Da H2O2das Cosubstrat der Peroxidasen ist, wurde untersucht, welche Menge an Peroxiden durch die Substratlösung in den Assay eingebracht wurde.
Der H2O2-Gehalt derβ-Carotin-Stammlösung wurde mit Hilfe des PEROXsay™-Assays (s. 2.1.5) bestimmt. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte nach Herstellerangaben. Die ermittelte
Kon-von β-Carotin nach dem unter 2.6.3.2 beschrieben Assay wird durch die Substratlösung eine H2O2-Konzentration von 8,9±0,5 μM pro Ansatz erreicht. Diese Konzentration entspricht 7%
der unter 3.4.8.5 ermittelten optimalen H2O2-Konzentration.
Wurde Kulturüberstand als Probe in den Assay eingesetzt, wurde eine Umsetzung vonβ-Carotin nur durch die Zugabe von H2O2erreicht. Die durch die Substratlösung eingebrachte H2O2-Menge musste durch Zugabe von mindestens 12,5 μM H2O2 erhöht werden, um eine Umsetzung des Substrats zu erreichen.
3.4.8.7 Einfluss von O2
Die Umsetzung des Substratesβ-Carotin ohne die Zugabe von H2O2 wies darauf hin, dass die Peroxidase noch eine andere katalytische Funktion hat. Daher wurde überprüft, ob die im Puffer gelösten Gase die Umsetzung von β-Carotin durch das Enzym beein lussen. Dafür wurde der Reaktionspuffer frisch hergestellt und für den Assay unterschiedlich vorbereitet (s. 2.6.4.5). Die Anreicherung des Reaktionspuffers mit Sauerstoff führte zu einer Erhöhung der Reaktionsge-schwindigkeit um den Faktor 2,3 im Vergleich zur Umsetzung unter Standardbedingungen (Abb.
3.57). Die Entgasung des Puffers führte hingegen dazu, dass die Umsetzung vonβ-Carotin durch das Enzym fast vollständig zum Erliegen kam.
ReaktionsgeschwindigkeitinµMmin-1
0,0 0,5 1,0 1,5
nentgaster Puffer nPuffer (Standardbedingungen) nmit Sauerstoff angereicherter Puffer Abbildung 3.57: Reak onsgeschwindigkeit der Umsetzung vonβ-Caro n in Abhägigkeit des Sauerstoffgehalts
des Puffers