3 Ergebnisse
3.5 Entwicklung eines Zwei-Enzym-Systems
Bei der Charakterisierung der DyP-Typ Peroxidase wurde gezeigt, dass diese – abhängig vom Substrat – bestimmte H2O2-Konzentrationen benötigt bzw. toleriert und das Substrat umsetzt.
Im Zwei-Enzym-System wurde der Ein luss der H2O2-Konzentration auf die Peroxidase-Aktivität ebenfalls untersucht. Hierzu wurden verschiedene AAO-Konzentrationen in den Assay eingesetzt und die Aktivität der Peroxidase in Abhängigkeit der AAO-Konzentration bzw. des gebildeten H2O2bestimmt (Abb. 3.66 A). Eine Steigerung der AAO-Konzentration führte zunächst zu einer Steigerung der H2O2-Bildung und parallel dazu zu einer Erhöhung der DyP-Aktivität. Wurde so viel AAO* in den Assay eingesetzt, dass 18 μM min−1 H2O2 gebildet wurde, führte dies zu einer Verminderung der Umsatzgeschwindigkeit der rPsaDyP. Wurde die AAO-Konzentration weiter gesteigert, sank die Bildung von H2O2und die Aktivität der rPsaDyP stieg wieder. In Abhängigkeit von der spezi ischen Aktivität der verwendeten AAO* trat dieser Effekt in unterschiedlichen Konzentrationsbereichen auf. Die Aktivität der rPsaDyP wurde früher inhibiert, als anhand der Positivkontrolle mit H2O2zu erwarten war (Abb. 3.66 B).
AAO-Konzentration in nM
13 22 44 61 79
0 2 4 6 8
0 5 10 15 20 A
0 2 4 6 8
0 50 100 150 200 250 B
Reaktionsgeschwindigkeit in µM min-1 H2O2-Bildung in µM min-1 H2O2-Konzentration in µM
Reaktionsgeschwindigkeit in µM min-1
Abbildung 3.66: DyP-Ak vität für den Umsatz von DMP (n) in Abhängigkeit von
A– der Arylalkoholoxidase-Konzentra on bzw. der durch die Arylalkoholoxidase produzierten H2O2-Menge2(n) und
B– der hinzugefügten H2O2-Menge (n)
2Die Produktion von H2O2pro Minute wurde aus dem Umsatz von Veratrylalkohol errechnet
3.5.2 Oxida on von DMP mit Hilfe des Zwei-Enzym-Systems
Die höchste Aktivität der rPsaDyP für den Umsatz von DMP liegt bei pH 4,5 (Tab. 3.7). Die Arylalkoholoxidase hat bei diesem pH-Wert eine Aktivität von 90%. Eine Umsetzung von DMP durch die rPsaDyP bei pH 6,0 wurde nicht nachgewiesen. Daher wurde das Zwei-Enzym-System bei pH 4,5 etabliert. Die höchste Enzymaktivität zeigt die rPsaDyP bei einer Temperatur zwischen 20 °C und 30 °C (s. 3.4.8.4). Außerhalb dieses Temperaturbereiches sinkt die Aktivität deutlich ab. Da die Aktivität der Arylalkoholoxidase bei 30 °C noch größer als 55% ist, wurde das Zwei-Enzym-System bei 30 °C etabliert (Tab. 3.10). Abbildung 3.67 zeigt den Umsatz des Lignin-modellsubstrates 2,6-Dimethoxyphenol im Zwei-Enzym-System sowie im Vergleich Positiv- und Negativkontrolle. Parallel zum Umsatz des DyP-Substrates wurde der Umsatz von Veratrylalkohol kontrolliert (Abb. 3.68). Nur im Zwei-Enzym-System wurde Veratrylalkohol oxidiert und H2O2im Assay produziert. In der Positivkontrolle – bestehend aus der Peroxidase und dem benötigtem Cofaktor H2O2– erfolgte der Umsatz von DMP nicht kontinuierlich und wurde bereits nach 6 min deutlich verringert. Bei der Negativkontrolle (mit rPsaDyP, ohne Zusatz von H2O2 und ohne AAO) erfolgte kein Umsatz des Modellsubstrates. Im Zwei-Enzym-System wurde im Vergleich zur Positivkontrolle DMP kontinuierlich über einen Zeitraum von 15 min oxidiert (Abb. 3.67). Dabei wurde H2O2kontinuierlich von der Arylalkoholoxidase zur Verfügung gestellt, welches von der rPsaDyP verbraucht wurde.
Tabelle 3.10: Zweienzymassay für den Umsatz von DMP
Zwei-Enzym-System Positivkontrolle Negativkontrolle
AAO*(16,2 U mg−1)1 25 μL – –
rPsaDyP (33,5 U mg−1)2 20 μL 20 μL 20 μL
Puffer3 85 μL 85 μL 85 μL
DMP4 10 μL 10 μL 10 μL
H2O25 – 50 μL –
H2O 50 μL – 50 μL
Veratrylalkohol6 10 μL 10 μL 10 μL
Rückfaltungspuffer – 25 μL 25 μL
Gesamtvolumen 200 μL
1 inal 5 mU •2 inal 3 mU •3Natriumacetat-Puffer (50 mM, pH 4,5) •4100 mM gelöst in 30% Ethanol •50,125 mM •
6100 mM in Puffer
Zeit in min
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0,2 0,4 0,6 0,8
0,0 1,0
Extinktion469nm
Abbildung 3.67: Umsatz von DMP durch das AAO-DyP-Zwei-Enzym-System (•) im Vergleich zur Umsetzung des Substrates in einem einfachen Enzymsystem aus DyP mit H2O2(•) bzw. ohne H2O2(•) (50 mM Natriumacetat-Puffer pH 4,5 bei 30 °C)
Zeit in min
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8
Extinktion310nm
Abbildung 3.68: Parallel zum DMP-Umsatz gemessene Oxida on von Veratrylalkohol im AAO-DyP-Zwei-Enzym-System (•) bzw. rPsaDyP mit H2O2 (•) bzw. ohne H2O2(•) im Vergleich (50 mM Natriumacetat-Puffer pH 4,5 bei 30 °C)
3.5.3 Oxida on von ABTS mit Hilfe des Zwei-Enzym-Systems
Für die Umsetzung von ABTS wurde ebenfalls Natriumacetat-Puffer pH 4,5 und 30 °C verwendet.
ABTS wird von der rPsaDyP optimal bei pH 3,8 umgesetzt (s. 3.4.8.2). Zur Optimierung des Assays wurde ein pH in der Mitte der pH-Optima beider Enzyme gewählt. Der Assay wurde hinsichtlich des ABTS-Umsatzes optimiert (Tab. 3.11). Die Substratkonzentration wurde so gewählt, dass sie im Sättigungsbereich für die DyP-Typ Peroxidase lag. Für den Umsatz von ABTS wurde im Vergleich zu DMP als Substrat nur eine niedrige Konzentration H2O2 benötigt, daher wurde eine AAO*mit niedrigerer spezi ischer Aktivität eingesetzt. Im Zwei-Enzym-System konnte die Oxidation von Veratrylalkohol aufgrund der Absorption von ABTS nicht nachvollzogen werden.
Tabelle 3.11: Zweienzymassay für den Umsatz von ABTS
Zwei-Enzym-System Positivkontrolle Negativkontrolle
AAO*(4,2 U mg−1)1 35 μL – –
rPsaDyP (209,5 U mg−1)2 40 μL 40 μL 40 μL
Puffer3 70 μL 70 μL 70 μL
ABTS4 20 μL 20 μL 20 μL
H2O25 – 25 μL –
H2O 25 μL – 25 μL
Veratrylalkohol6 10 μL 10 μL 10 μL
Rückfaltungspuffer – 35 μL 35 μL
Gesamtvolumen 200 μL
1 inal 1,3 mU •2 inal 24 mU •3 Natriumacetat-Puffer (50 mM, pH 4,5) •4 4 mM gelöst in Wasser •5 0,25 mM •
6100 mM in Puffer
Zeit in min
0 5 10 15 20 25 30 35 40
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Extinktion420nm
2,5
Im optimierten Zwei-Enzym-System war zunächst eine vergleichbare Umsatzgeschwindigkeit zur Positivkontrolle zu beobachten (Abb. 3.69). Nach etwa 15 min jedoch wurde der Umsatz von ABTS bei der Positivkontrolle verlangsamt und stagnierte nach ca. 20 min annähernd, während der Umsatz im Zwei-Enzym-System über einen Zeitraum von 40 min kontinuierlich erfolgte. Im Vergleich zur Positivkontrolle wurde das Substrat beim Zwei-Enzym-System trotz einer nahezu gleichen Anfangsgeschwindigkeit länger andauernd umgesetzt und somit mehr Produkt gebildet.
H2O2wurde kontinuierlich über den Zeitraum von 40 min bereitgestellt. Bei der Negativkontrolle war ein minimaler Umsatz zu beobachten, der jedoch nach ca. 2 min bereits stagnierte.
3.5.4 Abbau von Anna o mit Hilfe des Zwei-Enzym-Systems
Anschließend wurde die Oxidation des industrierelevanten Farbstoffs Annatto durchgeführt (Tab.
3.12). Der Abbau von Annatto erfolgte ebenfalls bei pH 4,5. Der pH-Wert wurde gewählt, da dieser dem pH-Wert der Molke entspricht. Die für den Abbau von Annatto benötigte H2O2-Menge ist vergleichbar mit der Menge für den Abbau von ABTS. Daher musste auch für den Umsatz dieses Substrates die AAO-Konzentration niedrig gehalten werden, um eine Hemmung der rPsaDyP durch eine zu rasche H2O2-Produktion zu verhindern.
Tabelle 3.12: Zweienzymassay für den Umsatz von Anna o
Zwei-Enzym-System Positivkontrolle Negativkontrolle
AAO*(6,2 U mg−1)1 10 μL – –
rPsaDyP (0,04 U mg−1)2 20 μL 20 μL 20 μL
Puffer3bzw. Molke 110 μL 110 μL 110 μL
H2O24 – 50 μL –
H2O 50 μL – 50 μL
Veratrylalkohol5 10 μL 10 μL 10 μL
Rückfaltungspuffer – 10 μL 10 μL
Gesamtvolumen 200 μL
1 inal 0,5 mU •2 inal 0,2 mU •3Natriumacetat-Puffer (50 mM, pH 4,5) mit Annatto (0,3% (v/v)) •40,25 mM •
5100 mM in Puffer
Zeit in min
0 2 4 6 8 10
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Extinktion452nm
Abbildung 3.70: Abbau des Farbstoffs Anna o bei pH 4,5 durch das AAO-DyP-Zwei-Enzym-System (•) im Vergleich zum Abbau durch die rPsaDyP mit H2O2(•)
Zeit in min
0 2 4 6 8 10
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Extinktion310nm
Abbildung 3.71: Parallel zum Anna o-Abbau gemessene Oxida on von Veratrylalkohol im AAO-DyP-Zwei-Enzym-System (•) bzw. rPsaDyP mit H2O2(•) im Vergleich
Im Vergleich zur Positivkontrolle wurde Annatto im optimierten Zwei-Enzym-System ef izienter und schneller abgebaut (Abb. 3.70). Bei der kontinuierlichen Zuführung von H2O2 durch die
Abbau von Annatto wurde der Umsatz von Veratrylalkohol kontrolliert (Abb. 3.71). Nur im Zwei-Enzym-System wurde Veratrylalkohol oxidiert und H2O2im Assay produziert.
3.5.5 Bleichung von Molke mit Hilfe des Zwei-Enzym-Systems
Das hinsichtlich der Umsetzung von Annatto optimierte Zwei-Enzym-System wurde zur Blei-chung von Annatto-gefärbter Molke eingesetzt. Die verwendete Molke (Strothmann reine Molke;
pH 4,5) wurde pur bzw. mit Annatto versetzt eingesetzt. Die Assayzusammensetzung wurde auf 1 mL hochskaliert (s. 2.6.8.1). Anstelle des Puffers wurde Molke eingesetzt. Eine Bleichung der gefärbten Molke war mit dem Zwei-Enzym-System aus Arylalkoholoxidase und rPsaDyP möglich (Abb. 3.72). Beide Enzyme waren auch unter den in der Molke gegebenen Bedingungen aktiv.
Gegenüber der Positivkontrolle wurde der Umsatz durch das optimierte Zwei-Enzym-System gesteigert. Bei der ungefärbten Molke war innerhalb von 12 h keine Bleichung erkennbar.
Bei der Molkebleichung wurde der Vorteil des Zwei-Enzym-Systems besonders deutlich. Im Vergleich zur Positivkontrolle mit H2O2ist die Bleichung mit dem Zwei-Enzym-System deutlich effektiver (Abb. 3.72). Eine Negativkontrolle wurde stets mitgeführt, aber weder der Einsatz der Arylalkoholoxidase alleine noch der Einsatz der DyP-Typ Peroxidase alleine führte zu einer Farbveränderung der Probe.
Abbildung 3.72: Bleichung der mit Anna o gefärbten Molke bzw. des gefärbten Puffers (50 mM Natriumacetat-Puffer pH 4,5) über 12 h mi els Zwei-Enzym-System und Vergleich mit der Posi vkontrolle (Zugabe von H2O2) sowie der ungefärbten Molke