Stammhintergrund der Rattenstämme

Im Folgenden soll auf den Hintergrund der Laborratte allgemein und der drei verwendeten Rattenstämme im Speziellen eingegangen werden. Als Informationsquelle dienten LINDSEY u. BAKER. (2006) und die von der Fa. Charles River zur Verfügung gestellten Daten.

Ratten werden weit verbreitet in verschiedenen Fragestellungen im Labor eingesetzt. Die norwegische Ratte (Rattus norvegicus) ist die erste Säugetiersspezies, die speziell für wissenschaftliche Zwecke domestiziert wurde. Sporadisch wurde sie wahrscheinlich schon vor 1850 für Ernährungsexperimente in Europa benutzt. Die erste Arbeit allerdings, die große Beachtung fand und die die Ratte als experimentelles Modell benutzt, wurde in Frankreich von PHILIPEAUX (1856) publiziert und beschäftigt sich mit den Effekten der Adrenalektomie bei Albino-Ratten. Die ersten Zuchtexperimente wurden mit Albinos und auch Wildtieren in Deutschland von 1877 bis 1885 von CRAMPE durchgeführt (CRAMPE 1877, CRAMPE 1883, CRAMPE 1884, CRAMPE 1885). Ab 1906 begann Henry H.

Donaldson seine Bemühungen, als wissenschaftlicher Leiter am Wistar-Institut in Philadelphia die Albino-Ratte zu standardisieren, welche er zuvor in vielen Forschungsprojekten in seinem Department der Neurochirurgie an der Universität von Chicago verwendet hatte. Er wiederum hatte die Albino-Ratten wahrscheinlich von der Universität Genf von Adolf Meyer erhalten, einem emigriertem Schweizer Neuropathologen, der sich um 1890 der Fakultät von Donaldson anschloss. Die Hauptabsicht war, verlässliche Stämme für Wachstums- und Entwicklungsstudien des Nervensystems zu bekommen. In Wirklichkeit war dieses jedoch die Grundlage für die Nutzung der Ratte in den Bereichen Ernährung, Biochemie, Endokrinologie, Genetik, Verhaltensforschung und indirekt in vielen anderen Forschungsbereichen (LINDSEY u. BAKER 2006).

Wistar (WIS)

Der Stamm kam 1947 vom Wistar-Institut in Philadelphia zu Scientific Products Farm Ltd.;

diese Firma wurde später zu Charles River Laboratories United Kingdom (CRUK). Zu Charles River Laboratories USA kam der Stamm im Jahre 1975. Diese spezielle Kolonie wurde wegen der niedrigen Inzidenz von Hydronephrose gewählt. Die Tiere sind Albinos. Sie

ALLGEMEINER TEIL

werden als generelles Modell für vielfältige Zwecke, besonders bei infektiösen Erkrankungen, in der Sicherheits- und Effizienztestung und Alterungsforschung eingesetzt.

Die Kolonie wird als Auszucht-Stamm geführt (http://www.criver.com/SiteCollection Documents/Wistar%20rat.pdf).

Lewis (LEW)

Der Ursprung dieses Stammes liegt im Wistar Institut. Er wurde aus Tieren entwickelt, die von Margaret Reed Lewis am Wistar Institut ausgewählt und ingezüchtet wurden. 1956 erreicht der Stamm die achte Generation der Inzucht (LINDSEY u. BAKER 2006).

Zu Charles River kam der Stamm aus Tulane, USA im Jahre 1970 in der F34-Generation.

Auch diese Ratten sind Albinos. Sie werden in der Transplantationsforschung, für induzierte Arthritis/Inflammation, experimentelle allergische Enzephalitis, und Streptozotocin-induzierte Diabetes eingesetzt. Dieser Stamm ist ein klassischer Inzucht-Stamm (http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/Lewis%20Rat.pdf).

Sprague Dawley (SD)

Der genaue Ursprung der Sprague Dawley-Ratte ist ungewiss. Der ursprüngliche Bestand wurde etwa 1925 von Robert Worthington Dawley (1897-1949), einem Physikochemiker an der Universität von Wisconsin, etabliert. Bei der Stammbenennung kombinierte er den Mädchennamen seiner ersten Frau mit seinem eigenen Namen und erhielt so den Stamm-Namen Sprague Dawley. Danach etablierte er eine kommerzielle Firma, bekannt als Sprague-Dawley Inc., in Madison, Wisconsin, welche sich ausschließlich mit der Bewerbung und dem Verkauf seiner Ratten beschäftigte. Nach seinem Tod 1949 wurde die Originalfirma zu ARS/Sprague-Dawley Company, welche heutzutage als Harlan Sprague Dawley weiterexistiert (LINDSEY u. BAKER 2006). Zu SASCO kommen die Sprague Dawley Ratten 1979 von ASR/Sprague Dawley in 1979, zu Charles River 1996. Die Fellfarbe bei diesen Ratten ist weiß, die Tiere sind Albinos. Sie werden als generelles Modell für vielfältige Zwecke, zur Sicherheits- und Effizienztestung, im Bereich der Alterung und Ernährung, für diät-induzierte Obesitas und in der Onkologie eingesetzt. Sie werden als Auszucht-Stamm geführt(http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/CD-RAT23.04.07.pdf).

ALLGEMEINER TEIL

2.5 Unterschiede im Geschlecht und in der ethnischen/stammspezifischen Zugehörigkeit bei Lebererkrankungen -Mensch und Tier-

Geschlechtsabhängige Unterschiede bei Lebererkrankungen werden häufig beschrieben, so z.B. bei viralen Hepatitiden, alkoholischen Lebererkrankungen, NAFLD, Autoimmun-hepatitis, primärer biliärer Zirrhose, primärer sklerosierender Cholangitis und dem hepatozellulärem Karzinom (HCC) (NAGOSHI 2008).

Die Prävalenz des Hepatitis B Oberflächen Antigens (HBsAG) ist bei Männer weltweit größer als bei Frauen (BLUMBERG et al. 1972).

Alkoholische Lebererkrankungen entwickeln sich hingegen bei Frauen schneller als bei Männern. Auch die Grenze derjenigen wöchentlich zu sich genommenen Alkoholmenge, die zur Entwicklung einer Lebererkrankung beitrug, liegt bei Männern höher (168-324 g) als bei Frauen (84-156 g). Bei gleicher aufgenommener Alkoholmenge im Bezug zum Körpergewicht kommt es bei weiblichen Individuen zu einer höheren Ethanolkonzentration im Blut. Dieser Zusammenhang wird auf einen geringeren Alkohol-Dehydrogenase-Spiegel im weiblichen Magen und einer damit verbundenen niedrigeren Aktivität dieses wichtigen Enzyms im gastrischen First-Pass-Ethanolmetabolismus zurückgeführt, was letztendlich in einer höheren Blutkonzentration resultiert (NAGOSHI 2008).

Die ethnische Zugehörigkeit und das Geschlecht wirken sich auch bei NAFLD aus. WESTON et al. (2005) zeigen in einer repräsentativen Studie innerhalb der U.S.-Bevölkerung, dass sowohl der ethnische Hintergrund als auch das Geschlecht Einfluss auf die Erkrankung haben. Dieser Unterschied ist schon aus ähnlichen Erkrankungen wie der Hepatitis C-Erkrankung bekannt. So reagieren Afroamerikaner schlechter auf eine antivirale Therapie als Weiße/Kaukasier (MUIR et al. 2004). In Asien wurde gezeigt, dass die Prävalenz der NAFLD bei Männern höher ist als bei Frauen (CHITTURI et al. 2007).

Die Prävalenz von NASH ist bei morbid fettleibigen Männern größer im Vergleich zu morbid fettleibigen Frauen (ARUN et al. 2006). Auch in Asien konnte eine höhere Prävalenz von NAFLD bei Männern gezeigt werden. Es gibt allerdings bei manchen Studien auch einen Alterstrend. In einer japanischen Studie ist die Prävalenz 25-30 % in allen Altersgruppen bei

ALLGEMEINER TEIL

von 30-39 Jahren betrug und schrittweise mit dem Alter der Frauen anstieg, so dass bei Frauen über 70 Jahre die Fettleber stärker prävalent war. Der Anteil der Frauen bei Patienten mit einer schweren Fibrose bei NAFLD scheint höher zu sein als bei Patienten mit einer milderen Fibrose (NAGOSHI 2008).

Das Immunsystem der Frau unterscheidet sich von dem des Mannes durch eine höhere Zahl von CD4+-T-Lymphozyten und ein höheres CD4+/CD8+-Verhältnis. In der Zellkultur zeigt sich, dass die Sekretion von IFN-γ und IL-10 nach der Zugabe von Östrogen in das Medium der Zellkultur aus T-Zell-Klonen einer Frau stieg. Die Sekretion von IFN-γ, IL-4 und IL-5 wird in murinen Zellen durch Androgen inhibiert. Die Immunantwort bei Östrogen in niedrigen Konzentrationen ist verstärkt, bei höheren Konzentrationen supprimiert. Dieses könnten Hinweise darauf sein, dass Östrogen oder Androgen das Immunsystem modulieren können und so in das Geschehen von Autoimmunerkrankungen wie einer Autoimmunhepatitis eingreifen (NAGOSHI 2008).

Betrachtet man das HCC, zeigt sich bei Männern eine höhere Inzidenz als bei Frauen, das Verhältnis liegt zwischen 2:1 und 4:1. Klinisch kann man allgemein bei Männern eine schnellere Progression einer chronischen Lebererkrankung hin zu einer Zirrhose beobachten.

Eine Zirrhose kann zu einem HCC führen. Der Mechanismus der Beeinflussung der HCC-Entstehung durch Östrogen und Androgen ist noch nicht vollständig verstanden (KALRA et al. 2008).

Induziert man bei Mäusen NASH mittels cholindefizienter Diät, dann ist kein Unterschied des Leberschadens bezüglich der Geschlechter nachzuweisen (KASIREDDY u. RAO 2004).

Bei Aromatase-defizienten Mäusen, denen die intrinsische Östrogen-Produktion fehlt, kommt es zu einer hepatischen Steatose, die durch Behandlung der Mäuse mit 17-β-Östradiol deutlich verbessert werden kann (NEMOTO et al. 2000). Auch beim Ischämie/Reperfusionsschaden sind weibliche Mäuse in größerem Maß geschützt. Dieses basiert auf einem 17β-estradiol-Mechanismus, der allerdings noch nicht genau identifiziert worden ist. Als potentieller Ansatz wird eine Aktivierung der hepatischen eNOS Aktivität und verstärkter NO-Produktion vorgeschlagen (HARADA et al. 2003).

ALLGEMEINER TEIL

Östrogen und seine Derivate sind starke endogene Antioxidantien, welche Lipidperoxid-Spiegel in der Leber und dem Blut senken. Sie verhindern myofibroblastische Transformationen von Sternzellen in der Ratten-Zellkultur (CODES et al. 2007).

2.6 Adipozytokine (Leptin, Adiponektin)

Fettgewebe partizipiert an der Regulation der Energiehomöostase, indem es selbst als endokrines Organ fungiert und diverse biologisch aktive Adipokine wie z.B. Freie Fettsäuren, Leptin und Adiponektin sezerniert.

Adiponektin wurde ursprünglich von vier Forschungsgruppen unabhängig voneinander in unterschiedlichen Herangehensweisen identifiziert. Strukturell gehört es zur Complement 1q-Familie. Das humane Adiponektin ist ein 244 Aminosäuren-Protein mit ca. 28 kDa und besitzt ein amino-terminales Signalpeptid (WHITEHEAD et al. 2006).

Es existiert als full-length oder nach proteolytischem Abbau z.B. durch Leukozyten als kleineres, globuläres Fragment, wobei allerdings nahezu das ganze Adiponektin im Plasma als full-length vorzuliegen scheint (KADOWAKI et al. 2006, VUPPALAMCHI et al. 2005).

Adiponektin bindet an zwei Rezeptoren, die Isoformen 1 und 2, die durch zwei Gene codiert werden: AdipoR1 und AdipoR2. Der AdipoR1-Rezeptor besitzt eine hohe Affinität für das globuläre Adiponektin, während der AdipoR2-Rezeptor beide Adiponektin-Formen mit einer mittleren Affinität erkennt (VUPPALAMCHI et al. 2005).

Die Rezeptoren für Adiponektin sind in allen Geweben zu finden; der Rezeptortyp 1 vor allem in Muskelgewebe und Typ 2 in der Leber. Die Konzentration des Adiponektins ist reduziert bei systemischer Insulinsensitivität sowie Steatosis. Es wird angenommen, dass Adiponektin die Hepatozyten vor Triglyceridakkumulation schützt, in dem es an seinen Rezeptor Typ 2 bindet und so die AMP-Kinase durch Phosphorylation aktiviert. Diese hat eine Vielzahl von Effekten, eingeschlossen einer Reduktion von pro-oxidativen Produkten wie reaktiven Sauerstoffspezies (ANANIA 2005).

Neben seinen metabolischen Effekten besitzt Adiponektin ebenfalls antiinflammatorische Wirkung und wirkt antidiabetisch und antiatherogen (DANCYGIER 2006).

ALLGEMEINER TEIL

Niedrige Adiponektinspiegel sind assoziiert mit dem Ausmaß an hepatischer Steatose, Necroinflammation und Fibrose in NAFLD (ADACHI u. BRENNER 2007).

Ein weiteres Adipozytenhormon mit großer Bedeutung ist das Leptin. Dieses 16kDa große Protein wurde nach dem griechischen Wort λεπτοσ, welches „dünn“ bedeutet, benannt. 1994 wurde es von Friedman et al. entdeckt (ARORA u. ARORA 2008). Es besitzt auffällige Ähnlichkeit mit Mitgliedern der langkettigen, helikalen Zytokin-Familie, zu der auch IL-6, IL-11 und IL-12 gehören. Die dreidimensionale Struktur des 167-Animosäuren-Moleküls Leptin basiert auf vier antiparallelen α-Helices, die durch zwei lange Querverbindungen und einer kurzen Schleife verbunden und in einem linksgängigen Bündel arrangiert sind, welches zweischichtig gepackt ist (FRÜHBECK 2006) (Abb. 3).

Abb. 3: Ribbondiagramm von Leptin ( ZHANG et al. 1997) .

Es wird von dem ob-Gen codiert und hauptsächlich im weißen Fettgewebe von den Adipozyten synthetisiert. Leptin dient in Abhängigkeit zur Fettmasse des Körpers als hypothalamisches Signal für die Überfüllung der Körperenergiespeicher (BATRA et al. 2004, ARORA u. ARORA 2008, FRÜHBECK 2006). Unter besonderen Unständen kann es allerdings auch in geringen Mengen in der Plazenta, gastrischen Mukosa, im Knochenmark, Mammaepithel, Skelettmuskel, Hypothalamus, in der Hypophyse und Knochen produziert werden (FRÜHBECK 2006).

ALLGEMEINER TEIL

Des Weiteren spielt Leptin eine wichtige Rolle bei der Regulation der Nahrungsaufnahme, des Energieverbrauchs und der Adipositas (Abb. 4).

Abb. 4: Regulation des Energiehaushaltes durch Leptin (GAO u. HORVATH 2008).

Bisher sind sechs Varianten des Leptin-Rezeptors identifiziert, welche sich in der COOH-Gruppe der Proteine unterscheiden (QIAN u. FAN 2008). Die Rezeptoren sind im Zentralnervensystem hauptsächlich in den afferenten Zentren des Hypothalamus und in peripheren Organen (Fettgewebe, Muskel, Pankreas, Leber) zu finden. Dieses zeigt die auto- und parakrine Rolle des Leptins in der Energieregulation. Neben seinen physiologischen Aufgaben kann Leptin auch pathologische Zustände beeinflussen wie z.B.

adipositas-ALLGEMEINER TEIL

assoziierte Arteriosklerose, oxidativen Stress und Krebs (ARORA 2008). Ebenfalls wird ihm eine pro-fibrotische Wirkung zugesprochen (KISSELEVA u. BRENNER 2007).

In der aktuellen Diskussion um eine „hormonzentrierte“ Sichtweise bei der Pathogenese der NAFDL (LONARDO et al. 2006) ist es von entscheidender Bedeutung, für das Verständnis der beteiligten molekularen Mechanismen sowie für die Entwicklung optimierter Therapieverfahren ein den häufigsten Ursachen nahe stehendes, kliniknahes Tiermodell zu charakterisieren.

2.7 Ziel der Studie

Die Pathogenese der NAFLD, insbesondere der Mechanismus der Progression der Steatose zur Steatohepatitis und Fibrose, ist bislang in ihren molekularen Abfolgen noch unzureichend erforscht. Die unterschiedliche Ausprägung, Progression und Reversibilität der Fettleber in den bisher verfügbaren tierexperimentellen Modellen lassen stamm- und geschlechts-spezifische Unterschiede in der Pathogenese der NAFLD vermuten, die durch eine unterschiedliche Adipozytenhormonregulation und Mikrozirkulationsstörung ausgelöst werden könnten.

Hypothese

Es gibt eine unterschiedliche Verfettung in Abhängigkeit des Stammes bei der Induktion der Fettleber mittels High Fat-Diät.

Darüber hinaus wird die Verfettung bzw. der Verfettungsmodus geschlechtsabhängig geprägt.

Ziel der Studie ist der Vergleich unterschiedlicher Rattenstämme und beider Geschlechter, um die Forschungsergebnisse bezüglich der Fettleber besser in Verbindung miteinander zu setzen. Damit lassen sich Ergebnisse hinsichtlich ihrer Aussagekraft besser und exakter interpretieren. Die Ergebnisse dieser Studie tragen einerseits zur Standardisierung der Tiermodelle bei, andererseits stellen sie die Grundlage für Folgeprojekte mit therapeutischer Beeinflussung der NAFLD, z. B. durch Manipulation der Expression des Adipozytenhormons Adiponektin in verschiedenenen pathophysiologischen Szenarien (Spenderkonditionierung vor Lebertransplantation, Ischämie/Reperfusionsschaden, Lebertransplantation) dar.

MATERIAL UND METHODEN

3. Material und Methoden

3.1 Versuchstiere und Studiendesign

Sämtliche Versuche wurden in der Abteilung Chirurgische Forschung der Klinik und Poliklinik für Allgemein- und Viszeralchirurgie des Universitätsklinikums Münster durchgeführt.

Insgesamt wurden für diese Versuche 72 Ratten im Alter von fünf Wochen eingesetzt. Dabei wurden zu gleichen Teilen die Rattenstämme Sprague Dawley, Lewis und Wistar verwendet.

Pro Stamm war jeweils die Hälfte der Tiere weiblichen Geschlechts. Alle Versuchstiere wurden von der Fa. Charles River Laboratories, Sulzfeld bezogen.

Die Versuchstiere wurden im Alter von vier Wochen geliefert. Sie wurden dann eine Woche zur Akklimatisierung in der Zentralen Tierexperimentellen Einrichtung (ZTE) der Medizinischen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität gehalten. Im Alter von fünf Wochen begann die Fütterung gemäß dem Studiendesign. Während der gesamten Haltungszeit in der ZTE wurden sie in Makrolon-Käfigen der Größe 4 gehalten. Sie unterlagen einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Rhythmus. Die Raumtemperatur betrug konstant 24 ° C. Sie erhielten Wasser und das entsprechende Futter ad libitum.

3.2 Versuchsgruppen

Die Versuchstiere wurden innerhalb des jeweiligen Geschlechtes und Stammes randomisiert und auf die unterschiedlichen Versuchsgruppen verteilt. Diese unterschieden sich in der Art des Futtermittels. Die Hälfte der Versuchstiere erhielt eine High Fat-Diät (Fa. Altromin, Lage), die andere Hälfte eine Standard-Diät (Haltungsdiät Mäuse-Ratten, Fa. Altromin, Lage) (Tab. 5).

MATERIAL UND METHODEN

Proben-entnahme Tab. 5 : Einteilung der Versuchsgruppen.

Gruppe Stamm Fütterung Geschlecht Anzahl High Fat Männlich

Weiblich

6

I Lewis 6

Standard Männlich Weiblich

6 6 High Fat Männlich

Weiblich

6 II Sprague 6

Dawley

Standard Männlich Weiblich

6 6 High Fat Männlich

Weiblich

6

III Wistar 6

Standard Männlich Weiblich

6 6

Σ 72

Abb. 5: Zeitlicher Versuchsablauf.

Tag 0 7 14 21

Fütterungsbeginn

• Standarddiät

• High Fat Diät

MATERIAL UND METHODEN

3.3 Versuchsdurchführung

Alle Versuchstiere erhielten entsprechend ihrer Versuchsgruppenzugehörigkeit die ihnen zugeteilte Diät für drei Wochen und wurden alle drei Tage gewogen. Nach Ablauf der Fütterungszeit erfolgten die Probenentnahme und anschließend die Opferung der Versuchstiere (Abb. 5).

3.4 Futter

Sowohl die Standardhaltungsdiät als auch die High Fat-Diät wurden von der Firma Altromin (Lage, Deutschland) bezogen. Die Inhaltsangaben der beiden Diäten sind im Anhang zu finden. Eine Woche nach Lieferung der Versuchstiere begann die Fütterung entsprechend der Studieneinteilung. Die Tiere mit der Standardhaltungsdiät erhielten ihr Futter ad libitum als Pellets. Die breiartige High Fat-Diät wurde zu kleinen Bällchen geformt und ebenfalls ad libitum gefüttert.

3.5 Narkose

Die Blut- und Gewebegewinnung zum Ende der Fütterungsperiode erfolgte unter Narkose.

Diese wurde mit Forene^® (Hersteller: Abbott, Wiesbaden; Wirkstoff: Isofluran) durchgeführt.

Als Trägergas wurden Lachgas und Sauerstoff im Verhältnis von 2:1 verwendet. Lachgas besitzt einen analgetischen Effekt und führt zu einer Reduktion des Isofluran-Einsatzes (Second-Gas-Effekt). Zur Narkoseeinleitung wurden die Tiere in eine Narkosekammer aus Kunststoff verbracht, welche mit dem Isofuran-Lachgas-Sauerstoffgemisch (2,5 Vol%

Isofluran, N2O:O2 = 2:1) geflutet wurde. Nachdem das Versuchstier den Verlust der Stellreflexe zeigt, was durch einfaches Drehen der Narkosekammer zu prüfen war, wurde es aus der Narkosekammer genommen. Die Narkose wurde anschließend in einem halboffenen System mit einer Gesichtsmaske bei 1,5 Vol% Isofluran aufrechterhalten. Als Nasenmaske diente eine 50 ml-Spritze, in der das Versuchstier mit der Nase platziert wurde.

MATERIAL UND METHODEN

3.6 Blutuntersuchungen

Zur Blutentnahme wurden die Tiere in Narkose gelegt. Zur Bestimmung der Narkosetiefe wurde die Tiefensensibilität der Ratte mittels Zwischenzehenreflex geprüft. Bei einem negativen Zwischenzehenreflex wurde das Tier seitlich gelagert, der Hals zur Stauung der Venen ein wenig komprimiert, die Augenlider zwischen Daumen und Zeigefinger des Probennehmers aufgespannt und am nasalen Augenwinkel eine Hämatokritkapillare (4 µl NH4-Heparin-End-zu-End-Kapillare, Fa. Sarstedt, Nümbrecht) mit drehend-schiebenden Bewegungen unter Schonung des Bulbus bis zum retrobulbären Venengeflecht vorgeschoben.

Das Blut wurde in einem mit Lithium-Heparin-beschichteten Microtainer (Fa. Becton Dickinson Microtainer Brand Tube, Franklin Lakes, USA) aufgefangen. Insgesamt wurden 3 ml Blut entnommen. Anschließend wurde die Probe innerhalb von zwei Minuten nach Entnahme in einer Zentrifuge (Centrifuge 5417 R, Fa. Eppendorf, Hamburg) bei 3000 rpm und einer Temperatur von 4 ° C für zehn Minuten zentrifugiert.

3.6.1 Plasma

Das Plasma wurde nach der Zentrifugation in Eppendorf-Gefäße mit einem Fassungsvermögen von 2 ml (Fa. Eppendorf, Hamburg) abpipettiert. 0,5 ml der Probe wurde innerhalb von einer Minute bezüglich der biochemischen Parameter im Labor untersucht. Die restliche Probe wurde innerhalb von fünf Minuten nach Zentrifugation in 200 μl-Aliquots aufgeteilt, in Eppendorf-Gefäße abgefüllt und für weitere Untersuchungen (ELISA) bei -80°

C asserviert.

Klinische Chemie

Die Bestimmung der Parameter der klinischen Chemie erfolgte im Vitros 250-Automaten der Fa. Ortho-Clinical Diagnostics (Neckargemünd) bei 37° C.

Es wurden folgende Parameter bestimmt: Kalium, Bilirubin, Alkalische Phosphatase, ALT, AST, PCHE, Lipase, Albumin, HDL, LDL, Triglyceride, Cholesterin (Tab. 6).

MATERIAL UND METHODEN

Tab. 6 : Reaktionsprinzipien der unterschiedlichen Parameter in der klinischen Chemie Parameter Reaktionsprinzip

Albumin • Albumin + Bromcresolgrün (BCG) → BCG-Albumin-Komplex

• 37 °C, 630 nm

• Aspartat + α-Ketoglutarat (+ AST, P-5-P) → Oxalacetat + Glutamat

• Oxalacetat (+ Oxalacetat-Decarboxylase) → Pyruvat + CO₂

• Pyruvat + Phosphat + O2 (+ Pyruvatoxidase) → H2O2 + Acetylphosphat

• Wasserstoffperoxid + Leukofarbstoff (+ Peroxidase) → Farbstoff

• 37 °C, 670 nm

Gesamt-Bilirubin • Gesamt-Bilirubin (+ Dyphyllin) → Azobilirubin-Chromophoren

• 37 °C, 540 und 460 nm Kalium • direkte Potentiometrie

Lipase

• 1-Oleoyl-diacetylglycerin (+ Lipase, Cholinlipase, pH 8) → 2,3-Diaceytlglycerin + Ölsäure

• 2,3-Diaceytlglycerin (+ Diacetinase) → Glycerin + Ölsäure

• Glycerin + ATP (+ Glycerinkinase, MgCl₂) → L-α-Glycerophosphatoxidase + ADP

• L-α-Glycerophosphatoxidase + O2 (+L-α-Glycerophosphatoxidase) → Dihydroxiacetonphosphat + H2O2

• H2O2 + Leukofarbstoff (+ Peroxidase) → Farbstoff + 2 H2O

• 37 °C, 540 nm

High Density Lipoprotein (HDL)

• Lipoproteine hoher Dichte (+ TX100) → Cholesterin + Cholesterinester+

Proteine

• Cholesterinester + H2O (+ Cholesterinesterhydrolase) → Cholesterin + Fettsäuren

• Cholesterin + O2 (+ Cholesterinoxidase) → Cholest-4-en-3-on + H2O2

•

MATERIAL UND METHODEN

Low Density Lipoprotein (LDL)

• LDL-Cholesterinester + H2O (+ Detergenz, Cholinesterase) → Cholesterin + freie Fettsäuren

• LDL-Cholesterin + O2 (+ Cholesterinoxidase) → Δ⁴-Cholestenon + H2O2

• 2 H₂O₂ + 4-Aminoantipyrin (+ Peroxidase) → Violettblaues Pigment + 5 H₂O

• 37 °C, 585 nm

Triglyzeride

• Lipoproteine (+ Tensid) → Triglyzeride + Proteine

• Triglyzeride + H2O (+ Lipase) → Glyzerin + Fettsäuren

• Glyzerin + ATP (+ Glyzerinkinase, MgCl₂ → L-α-Glyzerophosphat + ADP

• L-α-Glyzerophosphat + O2 (+ L-α-Glyzerinphosphatoxidase) → Dihydroxyacetonphosphat + H₂O₂

• H₂O₂ + Leukofarbstoff (+ Peroxidase) → Farbstoff + 2 H₂O

• 37 °C, 540 nm

Pseudocholin-esterase (PCHE)

• Butyrylthiocholin + H2O (+ PCHE) → Thiocholin + Butyrat

• 2 Thiocholin + 2 Kaliumferricyanid → Dithiobis(cholin) + 2 Kaliumferrocyanid

• 37 °C, 400 nm

Cholesterin

• Lipoprotein (+ TX100) → Cholesterin +Cholesterinester + Proteine

• Cholesterinester + H₂O (+ Cholesterinesterhydrolase) → Cholesterin + Fettsäuren

• Cholesterin + O2 (+ Cholesterinoxidase) → Cholest-4-en-3-on + H2O2

• H₂O₂ + Leukofarbstoff (+ Peroxidase) → Farbstoff + 2 H₂O

• 37 °C, 540 nm

Enzyme linked immunosorbent assay (ADN und Leptin)

Mittels enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) wurden die Parameter Leptin, Adiponektin untersucht. Als Probenmaterial wurden hierfür die bei -80°C gelagerten Plasmaaliquots herangezogen.

Zur Leptinbestimmung diente ein mouse Leptin-ELISA-Test-Kit (Fa. R&D, Katalognummer:

DY 498, Minneapolis, USA). Im ersten Schritt wurden die entsprechenden Stoffe rekonstituiert und in die benötigte Arbeitskonzentration überführt. Der erste Antikörper (Capture Antibody, goat anti mouse Leptin) wurde mit 1 ml PBS rekonstituiert. Daraus resultierte eine Konzentration von 360 µg/ml. Diese Lösung wurde mit PBS zu einer

MATERIAL UND METHODEN

Arbeitskonzentration von 2 µg/ml verdünnt. Der zweite Antikörper (Detection Antibody, bionylated goat anti mouse Leptin) wurde in 1 ml Reagent Diluent (0,05 % Tween^® 20 in PBS) gelöst. Die entstandene Lösung enthielt eine Konzentration von 36 µg/ml und wurde in einem zweiten Schritt mit Reagent Diluent zu einer Arbeitskonzentration von 200 ng/ml verdünnt. Die Rekonstitution des Standards erfolgt mit 0,5 ml Reagent Diluent. Damit erhielt man eine Lösung mit 95 ng/ml. Die benötigte Konzentration von 8000 pg/ml wurde mit Reagent Diluent hergestellt und im Anschluss eine zweifache Serienverdünnung mit Reagent Diluent durchgeführt, die zu einer Konzentrationsreihe von 8000, 4000, 2000, 1000, 500, 250 pg/ml führte. Danach erfolgte die Plattenpräparation. Dazu wurden 100 µl des 1. Antikörpers auf die 96-Well-Platte (MaxiSorp, Fa. NUNC) aufgetragen und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Am darauf folgenden Tag wurden alle Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht. Die Mikroplatte wurde mit Waschpuffer dreimal gewaschen und dann mit einer Blocklösung (Fetales Kälberserum 5 %, verdünnt mit PBS) 60 min bei Raumtemperatur geblockt. Nach dem erneuten Waschvorgang wurden pro Well 100 µl Standardlösung, die 1:

3 mit PBS verdünnte Probe oder PBS als Negativkontrolle aufgetragen und für 120 min inkubiert. Nach dem Waschen der Platte wurden pro Well 100 µl vom zweiten Antikörper zugefügt und 120 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Platte erneut gewaschen wie oben beschrieben und mit 100 µl Streptavidin-HRP (strepavidin conjugated

3 mit PBS verdünnte Probe oder PBS als Negativkontrolle aufgetragen und für 120 min inkubiert. Nach dem Waschen der Platte wurden pro Well 100 µl vom zweiten Antikörper zugefügt und 120 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Platte erneut gewaschen wie oben beschrieben und mit 100 µl Streptavidin-HRP (strepavidin conjugated

Im Dokument Untersuchung der stamm- und geschlechtsspezifischen Faktoren der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) an der Ratte (Seite 26-0)