Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung der stamm- und geschlechtsspezifischen Faktoren der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung
(NAFLD) an der Ratte
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Sandra Stöppeler
aus Münster
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung: 1. Univ.-Prof. Dr. med. vet. Michael Fehr Klinik für Kleintiere
2. Prof. Dr. med. Dipl. Ing. Hans-Ullrich Spiegel Abt. Chirurgische Forschung
Klinik und Poliklinik für Allgemein- & Viszeralchirurgie
Universitätsklinikum Münster
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Michael Fehr 2. Gutachter: Jun.-Prof. Dr. Andreas Beineke
Tag der mündlichen Prüfung: 12.11.2009
Für meine Eltern
Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgender Tagung vorgestellt und ausgezeichnet:
S. Stöppeler, A. Zibert, D. Palmes, E. Minin, H. Schmidt, H.-U. Spiegel
Stammspezifische Unterschiede bei der Fettleberinduktion mittels High Fat-Diät bei der Ratte - Histologische Untersuchungen -
18. Workshop für experimentelle und klinische Lebertransplantation und Hepatologie Wilsede, 14. bis 16. Juni 2007
ausgezeichnet mit dem 2. Posterpreis
INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung ...9
2. Allgemeiner Teil ...11
2.1 Obesitas/Adipositas...11
2.2 Nicht-alkoholische Fettlebererkrankungen (NAFLD) ...16
2.3 Tiermodelle zur Fettleberinduktion...23
2.4 Stammhintergrund der Rattenstämme...26
2.5 Unterschiede im Geschlecht und in der ethnischen/stammspezifischen Zugehörigkeit bei Lebererkrankungen -Mensch und Tier- ...28
2.6 Adipozytokine (Leptin, Adiponektin) ...30
2.7 Ziel der Studie ...33
3. Material und Methoden ...34
3.1 Versuchstiere und Studiendesign ...34
3.2 Versuchsgruppen...34
3.3 Versuchsdurchführung ...36
3.4 Futter ...36
3.5 Narkose...36
3.6 Blutuntersuchungen...37
3.7 Leberuntersuchungen ...42
3.8 Statistik...50
4. Ergebnisse ...51
4.1 Gewichtsverlauf ...51
4.2 Morphologische Unterschiede...52
4.3 Elektronenmikroskopie ...55
4.4 Klinische Chemie ...56
4.5 ELISA...64
4.6 Molekularbiologie ...67
5. Diskussion ...84
5.1 Wissenschaftlicher und klinischer Hintergrund ...84
5.2 Experimentelle Methoden zur Fettleberinduktion...84
5.3 Gewichtsbeeinflussung...87
5.4 Histomorphologische Veränderungen...87
5.5 Stoffwechselbeeinflussungen ...90
5.6 Regulationsmechanismen der Adipozytokine...94
5.7 Unterschiede in der Genexpression...96
5.8 Klinische/Veterinärmedizinische Relevanz und Perspektiven...101
6. Schlussfolgerung ...103
7. Zusammenfassung...105
8. Summary ...106
9. Literaturverzeichnis...107
10. Anhang ...123
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ADN Adiponektin
ADN-R Adiponektin Receptor 2 ALT Alaninaminotransferase Ang1 Angiopoietin-1
AP Alkalische Phosphatase Aqua dest. Aqua destilata
AST Aspartataminotransferase BMI Body Mass Index
bp Basenpaare Ct cycle threshold CycD3 Cyclin D3
ELISA enzyme linked immunosorbent assay EPO Erythropoetin
FLK-1 kinase insert domain protein receptor FLT-1 FMS-like tyrosine kinase 1
G6P glucose-6-phosphatase
GK glucokinase
HCC Hepatozelluläres Karzinom HDL high density lipoprotein H.E. Hämatoxilin-Eosin-Färbung HGF hepatocyte growth factor
HOX-1 heme oxygenase
ICAM intercellular adhesion molecule-1 LDL low density lipoprotein
LDH Laktatdehydrogenase Lepr leptin receptor LEW Lewis-Ratte
MCD methionin-cholin-defiziente Diät NAFL Nicht-alkoholische Fettleber
NAFLD Nicht-alkoholische Fettlebererkrankung NASH Nicht-alkoholische Steatohepatitis
p21 cyclin-dependent kinase inhibitor P21 PBS phosphate buffered saline
PCHE Pseudocholesterinesterase PDGFB platelet-derived growth factor B
PDGFBR platelet derived growth factor B receptor
PPARa peroxisome proliferator activated receptor alpha PPARg peroxisome proliferator-activated receptor gamma rpm rotations per minute
SCF stem cell growth factor SD Sprague Dawley-Ratte SMA smooth muscle alpha-actin
SREPB sterol regulatory element-binding protein-1c
TIE2 Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase TIMP1 tissue inhibitor of metalloproteinase 1
VCAM1 vascular cell adhesion molecule 1
VEGFA endothelial-specific receptor tyrosine kinase WIS Wistar-Ratte
ZTE Zentrale Tierexperimentelle Einrichtung
EINLEITUNG
1. Einleitung
Die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung des Menschen (NAFLD) umfasst ein weites Spektrum an pathologischen Läsionen wie eine blande Fettleber, Steatohepatitis, progressive Fibrose und Zirrhose. Eine mögliche Komplikation ist das hepatozelluläre Karzinom. Diese Schädigungen sind typisch für eine alkoholische Pathogenese der Leberschädigung. Erstmals wurde diese Erkrankung ohne den Abusus von Alkohol 1962 beschrieben. 1980 wurde der Begriff NASH (nicht-alkoholische Steatohepatitis) von LUDWIG et al. geprägt.
Dabei sollte die Verfettung (Steatose) der Leber nicht als gutartig betrachtet werden, sondern als prämorbider Zustand und wichtige Phase in fortschreitenden Lebererkrankungen wie Steatohepatitis, Fibrose, Zirrhose bis hin zum hepatozellulären Karzinom (HCC).
NAFLD ist in den meisten Fällen mit Adipositas assoziiert und in Analogie zum sich stetig erhöhenden Prozentsatz adipöser Menschen steigt auch die Inzidenz/Prävalenz der NAFLD.
Die Adipositas stellt in den westlichen Industrieländern ein wachsendes Problem dar.
Aber auch im asiatischen Bereich, der mehr und mehr industrialisiert wird, ist ein vermehrtes Auftreten solcher Erkrankungen zu verzeichnen.
Neben Hunden und Katzen werden auch Heimtiere, wie z. B. Kaninchen und Ratten in zunehmender Anzahl mit einer Adipositas vorgestellt. Damit sind auch bei unseren Haustieren Krankheitsbilder wie z. B. eine Fettleber und damit assoziierte Erkrankungen häufiger anzutreffen.
Neben den direkten gesundheitlichen Folgen der NAFLD ist die Fettleber bei der Transplantation von Bedeutung, da in Deutschland ein eklatanter Spendermangel herrscht. So werden verfettete Lebern, die normalerweise nicht zur Transplantation geeignet sind, dennoch unter dem Begriff „erweiterte Spenderkriterien“ zur Transplantation herangezogen.
Bei der Etablierung eines Fettlebermodells in unserer Arbeitsgruppe fiel auf, dass nicht alle ausgewählten Versuchstierstämme in gleicher Weise auf die fettreiche Diät ansprachen.
Daraus erwuchs das Interesse, diese Beobachtungen systematischer zu untersuchen. Für die vorliegende Studie wurden drei häufig in der Literatur zu findenden und in unserer Arbeitsgruppe gebräuchliche Rattenstämme ausgewählt und dabei gleichzeitig sowohl männliche als auch weibliche Versuchstiere untersucht.
EINLEITUNG
Ziel dieser Untersuchung ist deshalb, im High Fat-Modell bei der Ratte vorhandene stamm- und geschlechtsspezifische Unterschiede in der Fettleberinduktion zu untersuchen. Mit einem besseren Verständnis der Pathogenese sowie einer genaueren Kenntnis der Unterschiede zwischen bestimmten Individuen können neue Therapiemöglichkeiten aufgezeigt und somit das Risiko der Progression der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung vorhergesagt oder sogar vermindert werden.
ALLGEMEINER TEIL
2. Allgemeiner Teil
Zur Literaturrecherche wurde überwiegend das Medline-Informationssystem genutzt. Bei dieser Datenbank handelt es sich um die weltweit größte Online-Bibliothek.
2.1 Obesitas/Adipositas
Übergewicht und Fettleibigkeit stellen ein allgemeines und wachsendes Problem der Weltbevölkerung dar. Fettleibigkeit, also Obesitas (lat. obesus = dick) gewinnt immer mehr als Hauptursache von allgemeinen Erkrankungen der Weltbevölkerung an Bedeutung. Sie ersetzt damit die krankhaften Folgen der Unternährung und der infektiöse Erkrankungen (KOPELMAN 2000).
Die Gründe für die Entwicklung von Adipositas sind vielfältig (Abb. 1). Es gibt Erkrankungen wie z.B. Hypothyreoidismus, Pharmazeutika oder auch seltene Gendefekte, die Fettleibigkeit hervorrufen können.
Allgemein lässt sich aber sagen, dass der Hauptgrund für die Entwicklung der Fettleibigkeit ein positives Mismatch (Unausgeglichenheit) zwischen Energieaufnahme und Energieverbrauch ist. Dementsprechend können eine übermäßige Energieaufnahme oder ein inadäquater Energieverbrauch zu einer positiven Energiebilanz führen.
Abb. 1: Verschiedene Gründe für Obesitas (KOPELMAN 2000).
ALLGEMEINER TEIL
Die Industrialisierung brachte nicht nur einen Wandel in das Arbeitsleben der Menschen des 20. Jahrhunderts, sondern nahm auch indirekt Einfluss auf die Ernährungsgewohnheiten des Menschen. Das Tätigkeitsgebiet vieler Menschen hat sich verändert. Es steht nicht mehr die körperliche Arbeit im Vordergrund, sondern oftmals wird die Arbeit am Schreibtisch verrichtet. Damit ist eine ausreichende sportliche Aktivität nicht mehr gegeben. Allein dieses fördert bereits eine schlechtere körperliche Konstitution des Einzelnen.
Zusätzlich ist aber auch die Zusammensetzung des Essens einem Wandel unterlegen. Es werden mehr tierische Fette verzehrt und Ballaststoffe treten in den Hintergrund.
Sowohl Zubereitung als auch Aufnahme der Nahrung soll heutzutage schnell und komplikationslos erfolgen. Die sog. Fast Food-Restaurants bedienen eben diese Anforderung.
Allerdings beschränkt sich das Angebot solcher Restaurants meistens aber auf kalorien- und fettreiche Menüs, die nicht zu einem Lebensstil ohne ausreichende körperliche Arbeit passen und der Gesundheit nicht zuträglich sind.
Infolgedessen kann man eine Zunahme der Inzidenz von Adipositas und deren Begleiterscheinungen bemerken. Ein gutes Beispiel der negativen Effekte dieser
„Westernization“ sind die Pima-Indianer in Arizona und Mexiko. Dieser Indianer-Stamm besteht aus zwei Gruppen, die entweder in Mexiko oder Arizona leben. Die Gruppe in Arizona hat sich von der traditionellen Ernährung abgewendet und sich einer „westlichen“
Ernährung und Lebensweise angepasst. Die mexikanische Gruppe ernährt sich jedoch noch traditionell, was weniger tierisches Fett und mehr komplexe Kohlenhydrate beinhaltet bei gleichzeitiger körperlicher Arbeit. Es zeigt sich, dass gleichzeitig mit einem höheren Body- Mass-Index (BMI) das Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen und Diabetes melitus in der Arizona-Gruppe deutlich erhöht ist (RAVUSSIN et al. 1994).
Übergewicht und Fettleibigkeit weiten sich zu einem weltweiten Problem mit epidemischem Charakter aus. Schätzungen gehen davon aus, dass nahezu zwei Drittel der Erwachsenen in den USA übergewichtig oder fettleibig sind (KOPELMAN 2000, FLEGAL et al. 2002). Die Prognose für die Zukunft ist ebenso unerfreulich und die Tendenz bleibt steigend (Abb. 2).
ALLGEMEINER TEIL
Abb. 2: Prognose für den BMI bis 2030 (mod. nach KOPELMAN 2000).
Auch bei unseren Haustieren, vor allem bei Hund und Katze, tritt das Problem des Übergewichtes und der Obesitas immer häufiger auf. Studien aus unterschiedlichen Teilen der Welt schätzen die Inzidenz der Obesitas in der Hundepopulation auf 22 - 40 % (GERMAN 2006). Eine wichtige Publikation zu diesem Thema stammt aus Australien. In dieser Studie kam der Autor zu dem Schluss, dass 33,5 % der Hunde als übergewichtig einzustufen sind und 7,6 % als fettleibig. Dabei scheinen die Besitzer fettleibiger Hunde ebenso selbst oft fettleibig zu sein (KIENZLE et al. 1998).
Unabhängig oder in Assoziation mit anderen Erkrankungen können Übergewicht und Fettleibigkeit Gesundheitsprobleme auslösen oder verschlimmern (KOPELMAN 2000). Diese assoziierten Erkrankungen sind z.B. Diabetes mellitus, koronare Herzerkrankungen oder Prädispositionen für bestimmte Krebsformen (Kolon, weibliche Brust, Endometrium, Niere, Ösophagus) (CALLE u. KAAKS 2004), respiratorische Komplikationen (obstruktive Schlafapnoe) oder Osteoarthritis.
Auch bei Haustieren wird von Krankheiten berichtet, welche in Zusammenhang mit Obesitas stehen (Tab. 1).
Prozentsatz der Population mit einem BMI > 30 kg/m2
ALLGEMEINER TEIL
Tab. 1: Obesitas-assoziierte Erkrankungen bei Haustieren (mod. nach GERMAN 2006).
Metabolische Abnormalitäten Hyperlipidämie/Dyslipidämie Insulinresistenz
Metabolisches Syndrom Hepatische Lipidose (Katze) Endokrinopathien
Hyperadrenocortizismus Hypothyreoidismus Diabetes mellitus
Orthopädische Erkrankungen Osteoarthritis
Frakturen des Condylus humeri Kreuzbandrisse (kraniales Kreuzband) Kardiorespiratorische Erkrankungen Trachealkollaps
Brachiocephales Luftwegs-Obstruktionssyndrom Larynxparalyse
Urogenitalsystem
Urolithiasis (Kalziumoxalat) Dystokie
Übergangsepithelkarzinom Neoplasien
Mamma
Übergangsepithelkarzinom Funktionale Veränderungen Hypertension
Verminderte Immunfunktion Erhöhtes Anästhesierisiko Verminderte Lebensdauer
ALLGEMEINER TEIL
Neben den direkt assoziierten Erkrankungen kommt der Fettlebigkeit bei den Heimtieren eine zusätzliche Bedeutung zu. Bei tierischen Patienten, welche uns im Gegensatz zum Menschen ihre Symptome nicht direkt mitteilen können, erschwert eine Obesitas die klinische Evaluation. Thorakale Auskultationen, abdominale Palpationen oder auch bildgebende Verfahren wie Ultraschall sind erschwert. Bei Operationen droht ein erhöhtes Anästhesierisiko (CLUTTON 1988), welches auch darauf zurückzuführen ist, die richtige Medikamentendosierung gerade bei Injektionsnarkosen zu finden.
Body Mass Index (BMI)
Die Einstufung des Körpergewichts kann unterschiedlich erfolgen. Der sog. Body Mass Index (BMI) errechnet sich aus dem Körpergewicht in kg geteilt durch die Körpergröße zum Quadrat (WILLETT et al. 1999). Gemäß folgender Tabelle kann somit beim Menschen die Einstufung in übergewichtig oder fettleibig bzw. morbid fettleibig erfolgen.
Tab. 2: Cut-off-Werte, welche vom WHO-Experten-Komittee für die Klassifikation von Übergewicht vorgeschlagen wurden (mod. nach KOPELMAN 2000).
BMI (kg/m2) WHO-Klassifikation Gängige Beschreibung
< 18,5 Untergewicht dünn
18,5 – 24,9 - gesund, normal, akzeptabel
25,0 – 29,9 Übergewicht Grad 1 Übergewicht
30,0 – 39,9 Übergewicht Grad 2 Obesitas
> 40 Übergewicht Grad 3 Morbide Obesitas
Der BMI unterscheidet jedoch nicht zwischen Fett- und Muskelmasse.
Auch der Hüftumfang und die Hüft-Taillen-Relation kann zur Einstufung des Gewichtszustandes herangezogen werden, wobei allerdings das intraabdominale (viszerale) Fett nicht genau geschätzt werden kann. Die Hautdickenmessung und die Messung der Bioimpedanz stellen weitere Mittel zur Beurteilung des Körpergewichtes dar.
ALLGEMEINER TEIL
Canine Patienten werden als klinisch fettleibig betrachtet, wenn ihr Körpergewicht mindestens 15 % über dem Idealgewicht liegt (GOSSELLIN et al. 2007).
2.2 Nicht-alkoholische Fettlebererkrankungen (NAFLD)
Definition
Bei den nicht-alkoholischen Fettlebererkrankungen (non alcoholic fatty liver diseases, NAFLD) handelt es sich um eine Gruppe von Lebererkrankungen, die die typischen Charakteristika von alkoholinduzierten hepatischen Schädigungen aufweisen, ohne dass ein Alkoholabusus vorliegt. Erstmalig wurde dieses Krankheitsbild 1962 beschrieben. 1980 prägten LUDWIG et al. den Begriff „Nicht-alkoholische Steatohepatitis (NASH)“. Es existieren aber auch synonyme Begriffe wie beispielsweise pseudoalkoholische Hepatitis, Fettleberhepatitis, diabetische Hepatitis etc. Diese Synonyme beziehen sich dabei meist auf die Ätiologie der Erkrankung (BLECHACZ u. STREMMEL 2003).
Die NAFLD reichen von einer blanden Steatosis zu Steatohepatitis, Fibrose und Zirrhose und können letztendlich auch zu Leberversagen oder hepatozellulärem Karzinom führen.
Die Nomenklatur ist allerdings schwierig. NAFLD/NASH sind „non“-Krankheiten. Das heißt sie definieren sich durch einen nicht bzw. mäßig vorhandenen Alkoholkonsum. Dabei werden viele andere Gründe für eine Fettleber zusammengefasst. Die Liste ist lang, eine kurze Übersicht gibt folgende Tabelle:
ALLGEMEINER TEIL
Tab. 3: Ursachen für eine Fettleber (mod. nach CASSIMAN u. JAEKEN 2008).
Toxische Ursachen Alkohol
Toxine wie z.B. Pestizide, Dimethylformamide Kokain
Pharmazeutika wie z.B. Kortikosteroide, Tamoxifen
Nutritive Ursachen Totale parenterale Ernährung
Hungern, Kachexie, schneller Gewichtsverlust Chirurgische Ursachen Bypass-Chirurgie z.B. bariatrische Chirurgie
Whipple-Prozedere Andere Ursachen
Mit Insulinresistenz Prader-Willi-Syndrom Lipodystrophie-Syndrome Insulinrezeptor-Defekte Ohne Insulinresistenz Infektiös: HCV, HBV, HDV
Endokrin: Schilddrüsenerkrankungen Entzündliche Darmerkrankungen Angeborene Stoffwechsel-
Erkrankungen
Gallensäuresynthese-Defekte
Kohlenhydraterkrankungen wie z.B. Galaktosämie Morbus Wilson
Zellweger-Syndrom
Nichts desto trotz bezieht sich der Begriff NAFLD/NASH in den meisten Fällen auf die nutritive Verfettung bzw. die Zufuhr von zu vielen Kalorien mit der Nahrung. Damit ist auch die Assoziation mit Adipositas gegeben.
ALLGEMEINER TEIL
Epidemiologie
Aus den epidemiologischen Zahlen bezüglich Obesitas lässt sich ableiten, dass die Prävalenz der NAFLD - in Analogie mit dem sog. „metabolischen Syndrom“ (Übergewicht, Fettstoffwechselstörungen, Störungen des Zuckerstoffwechsels bis hin zum Diabetes sowie Bluthochdruck) - in den westlichen Industrieländern und ebenfalls in Asien zunehmend ist.
Dieses bestätigt sich ebenfalls auch in statistischen Untersuchungen. In Deutschland beträgt die Prävalenz bei 45- bis 55-jährigen Patienten mit einem BMI > 30 kg/m² circa 20 % und bei 55- 75-jährigen etwa 27 %. 75 % dieser adipösen Patienten haben eine Steatose der Leber.
Etwa 50 bis 80 % der Altersdiabetiker sind übergewichtig und bei jedem zweiten Typ-2- Diabetiker ist die Leber verfettet. Die Inzidenz der nicht-alkoholischen Fettleber liegt bei 2 % Neuerkrankungen pro Jahr. Die Prävalenz der NAFLD in der Bevölkerung wird auf 20 % geschätzt, die der Steatohepatitis auf 2 bis 3 %. Etwa 5 bis 10 % aller übergewichtigen Menschen und 20 % derjenigen mit Adipositas permagna sollen eine nicht-alkoholische Steatohepatitis aufweisen (DANCYGIER 2006).
Folgende Tabelle, aufgearbeitet von BELLENTANI et al. (2004) gibt Aufschluss über die Prävalenz von NAFLD und NASH in unterschiedlichen Ländern:
Tab. 4: Prävalenz von NASH/NAFLD in verschiedenen Ländern (mod. nach BELLENTANI et al. 2004).
Prävalenz (%) Studienpopulation, Screening-Methode,
Erstautor, Publikationsjahr Land Anzahl der
Untersuchten NAFLD NASH
Autopsy random series, liver biopsy, Hilden (1977) Sweden 503 24 ND Hospital series, liver biopsie, Hultcrantz (1986) Sweden 149 39 ND Outpatient series, ultrasound, Lonardo (1997) Italy 363 20 ND Hospital series, liver biopsy, Berasain (2000) Spain 1075 ND 16 Population Study, ultrasound, Bellentani (2000) Italy 257 16 ND Autopsy random series, liver biopsy, Ground (1982) USA 423 16 ND
Hospital series, liver biopsy, Lee (1989) USA 543 ND 9 Hospital series, liver biopsy, Probst (1995) USA 35 15 5
ALLGEMEINER TEIL
Hospital series, liver biopsy, Daniel (1999) USA 81 * 51 32 Autopsy series, liver biopsy, Wanless (1990) Canada 207 ** 29 6 Population study, ultrasound, Nomura (1988) Japan 2574 14 ND Hospital series, liver biopsy, Nonomura (1992) Japan 561 ND 1 Outpatient series, ultrasound, Omagari (2002) Japan 3432 9 *** ND Outpatient series, ultrasound, Araujo (1998) Brazil 217 + 33,5 ND Outpatient series, ultrasound and CT scan, El-Hassan
(1992)
Saudi Arabia
1425 10 ND
* Patienten mit nicht-alkoholischer und alkoholischer Fettleber, deswegen ist die Prävalenz relativ zur Fettleber
** Fettleibige Patienten
*** Die Autoren berichten von einer Prävalenz von der Fettleber von 21,8 % + weibliche, fettleibige Patientinnen
ND nicht untersucht
Schon Anfang der 90er Jahre ergaben Autopsiestudien von amerikanischen Erwachsenen, dass annähernd 20 % bzw. 3 % dieser Erwachsenen eine hepatische Steatose bzw. NASH hatten. Dabei stellt die Obesitas den größten Risikofaktor da. Schätzungsweise haben 70-80 % der Menschen mit Obesitas eine Fettleber und 15-30 % NASH (WANLESS u. LENTZ 1990, SANYAL 2002). Die Obesitas zeigt einen epidemischen Anstieg und es wird geschätzt, dass 50 % der Erwachsenen im Jahre 2025 darunter leiden werden. Wenn man die Prävalenz der NASH in Individuen mit Obesitas betrachtet, ist es demnach wahrscheinlich, dass 25 Millionen Amerikaner in den nächsten 20 Jahren NASH haben (LALL et al. 2008).
Mit zunehmender Urbanisation und Änderungen im Verhalten bezogen auf physische Inaktivität und hochkalorischer bzw. fettreicher Nahrung wird aber auch in der Asia-Pazifik- Region dieses Erkrankungsspektrum inklusive Diabetes Typ 2 zu einem Problem mit wachsender Bedeutung. In den letzten 20 Jahren war z.B. in einem Land wie Japan ein 3 – 20facher Anstieg (abhängig vom Alter) zu beobachten (FARRELL 2003). In einer Schätzung von ZIMMET et al. (2001) gehen diese davon aus, dass im Jahre 2020 100 Millionen Menschen mit einem Typ 2 Diabetes leben werden, 60 % davon in Asien.
ALLGEMEINER TEIL
Pathogenese
Der Triglyzeridgehalt der Leber reflektiert die Balance eines komplexen Prozesses, nämlich des In- und Output, der Synthese und des Abbaus von Fettsäuren. Dieses Gleichgewicht verschiebt sich bei Obesitas und Insulinresistenz hin zu einer Triglyzeridansammlung und Fettleber. Bei einem erhöhten Serumspiegel an freien Fettsäuren z.B. durch eine erhöhte Aufnahme von Nahrungsfetten oder bei einer Erschöpfung der Aufnahmekapazität der Adipozyten, lagert die Leber Fette ein. Hyperinsulinämie und geringgradige Entzündungserscheinungen stimulieren die De Novo-Lipogenese. Zusammen mit dem verringerten intrahepatischen Fettabbau kommt es zu einer Fettleber (LECLERCQ 2007).
Die blande Fettleber an sich ist benigne, und es tritt in den meisten Fällen keine Progression zu NASH auf. Für den Fall der Progression allerdings wird die „2-hit-Theorie“
vorgeschlagen. Als „first hit“ gilt dabei die Einlagerung von Fetten in die Leber. Die Hepatozyten sind dann für eine Schädigung durch eine zusätzliche Noxe („second hit“) empfänglicher. Für die darauf folgende Leberzellschädigung und Inflammation wird oxidativer Stress als direkte Folge der hepatischen Lipidakkumulation verantwortlich gemacht. Vieles spricht aber auch für eine Entwicklung einer Steatohepatitis unter dem Einfluss von proinflammatorischen Zytokinen wie z.B. TNF-α (KLUWE u. LOHSE 2005).
Zahlreiche Faktoren wie u.a. Insulinresistenz, Leberzellverfettung, Endotoxine, proinflammatorische Zytokine, oxidativer Stress, Alteration der Mitochondrien sowie genetische Faktoren triggern dann den Progress von einer „blanden“ Steatosis über eine Steatohepatitis bis hin zur Steatofibrose/-zirrhose (DANCYGIER 2006).
Eine Hyperinsulinämie führt zu einer verminderten Lipolyse und zu einer Erhöhung der Serumkonzentration der freien Fettsäuren. Diese werden von der Leber aufgenommen und treiben die Triglycerid-Produktion und somit die Verfettung der Leber voran (MCCULLOUGH 2006). Gleichzeitig vermindert die chronische Hyperinsulinämie die Synthese von Apolipoprotein B 100 und damit den VLDL-assoziierten Lipidtransport aus den Hepatozyten. Im Ergebnis führt die Hyperinsulinämie zu einer Zunahme der hepatischen Triglycerid-Synthese bei gleichzeitiger Hemmung der Triglyceridsekretion als VLDL. Freie Fettsäuren verstärken weiterhin in der Leber die Lipidperoxidation. Sie generieren hochreaktive Sauerstoffspezies (ROS), stimulieren die Expression von TNF-α, schädigen die
ALLGEMEINER TEIL
Vorgänge. Eine Schädigung der Mitochondrien führt zu einer gestörten ATP-Synthese und somit zu einer gestörten Energiehomöostase, was ebenfalls zur Leberschädigung beiträgt (DANCYGIER 2006).
Das Krankheitsgeschehen der NAFLD beginnt mit einer blanden Steatosis. Bei dieser kann zwischen mikrovesikulären und makrovesikulären Fettvakuolen unterschieden werden. Eine klinische Relevanz wird allerdings nur der makrovesikulären Verfettung zugewiesen (SELZNER et al. 2006). Von einer reinen Steatose aus kann ein progressiver Verlauf auftreten. Bei der sog. nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) treten neben den Fettvakuolen auch Entzündungserscheinungen auf. Bei weiterer Progression der nicht- alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) tritt eine zunehmende Fibrose auf, die bis zur Zirrhose führen kann. Sowohl Obesitas als auch Diabetes sind signifikant assoziiert mit der Entwicklung des hepatozellulären Karzinoms (HCC) (SMEDILE u. BUGIANESI 2005).
Klinische Bedeutung
Die NAFLD steht in Zusammenhang mit dem sog. metabolischen Syndrom und gilt als dessen hepatische Manifestation. Das metabolische Syndrom (auch „Syndrom X“ genannt) umfasst eine Reihe von Stoffwechselstörungen wie Obesitas, Diabetes mellitus, Dyslipidämie, Arteriosklerose, Hypertension und Insulinresistenz als allgemeine Kennzeichen (TE SLIGTE et al. 2004).
Die klinische Bedeutung der NAFLD liegt vor allem in dem bislang nicht abschätzbaren Risiko, sich zu einer terminalen Lebererkrankung zu entwickeln. In Abhängigkeit von dem Patientenalter, der Aktivität der Steatohepatitis so wie einer eventuell bestehenden Leberfibrose bzw. –zirrhose liegt die 10-Jahres-Mortalität der NAFLD bei bis zu 25 % (FARRELL u. LARTER 2006). Darüber hinaus wird angenommen, dass viele Patienten mit einer sog. „kryptogenen“ Leberzirrhose im Endstadium der NAFLD verstorben sind.
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist die fünfthäufigste Neoplasie, der Haupttodesgrund bei humanen Patienten mit Leberzirrhose und der dritthäufigste Grund des Krebstodes in der Welt (LODATO et al. 2006). Der Hauptgrund für die Entwicklung des HCC sind Infektionen mit Hepatitis B oder C, Alkohol oder Aflatoxin B1 (QIAN u. FAN 2005). Aber auch Obesitas wird bei dieser Neoplasie immer wieder erwähnt und als Risikofaktor für das HCC gesehen,
ALLGEMEINER TEIL
obwohl eine schlüssige Verbindung von NAFLD zum HCC fehlt und auch unklar ist, ob ein HCC auch aus einer Fettleber in Abwesenheit von einer Zirrhose entstehen kann (CALDWELL et al. 2004, SMEDILE u. BUGIANESI 2005).
Letztendlich muss die hepatische Steatose als prämaligner Status gesehen und gewertet werden, da eine Progression über Steatohepatitis und Fibrose/Zirrhose zum HCC möglich ist und dieses Risiko nicht abgeschätzt werden kann.
Auch hinsichtlich der Transplantation von Lebern spielt die hohe Inzidenz von Fettlebern bzw. Fettlebererkrankungen bei potentiellen Spendern eine wachsende Bedeutung. In Anbetracht eines vorherrschenden Organmangels müssen immer mehr Organspender mit erweiterten Spenderkriterien für Transplantationen in Betracht gezogen werden. Bei diesen erweiterten Spenderkriterien handelt es sich z.B. um Organe, die geringgradige pathologische Veränderungen aufweisen. Dabei spielt die Steatosis der Leber eine bedeutende Rolle als erweitertes Spenderkriterium, da sie mit ihrer hohen Inzidenz häufig bei potentiellen Spendern anzutreffen ist. Die Transplantation von steatotischen Lebern (30-60 % Verfettung) führt allerdings zu einer erhöhten primären Nonfunktion des Transplantats und damit auch zu einer reduzierten Überlebenszeit des Empfängers. Spenderlebern mit einer Verfettung von über 60 % werden typischerweise nicht transplantiert. Untersuchungen zeigen eine Prozentzahl von 13-28 % verfettete Organe bei Spendern (cadaveric). Damit ist mehr als eine von vier Lebern nicht optimal zur Transplantation geeignet, was die ohnehin schon angespannte Situation bezüglich der Verfügbarkeit der Spenderorgane verschärft (PERKINS 2006).
Bei der Pharmakinetik ist zu beachten, dass eine Fettleber Bedeutung in der Elimination von Medikamenten haben kann, da die hepatische Clearance beeinträchtigt sein kann (CASATI u.
PUTZU 2005).
ALLGEMEINER TEIL
2.3 Tiermodelle zur Fettleberinduktion
Wie schon aus der Pathogenese ersichtlich, gibt es die unterschiedlichsten Gründe für eine Fettleber. Dieses spiegelt sich auch in den publizierten Versuchstiermodellen der Fettleber wider. Die bekannten Fettlebermodelle basieren auf unterschiedlichen Ansätzen und zeichnen sich durch eine unterschiedliche Ausprägung, Reversibilität und Funktionsstörung der Fettleber aus.
Gemäß dem humanen, ätiologischen Hintergrund lässt sich auch bei den Tiermodellen zur Fettleberinduktion eine Unterscheidung in alkoholische und nicht alkoholische Modelle treffen. Im Weiteren soll ein kurzer Überblick über die Bandbreite der nicht-alkoholischen Fettleberinduktion gegeben werden. Der ätiologische Hintergrund dieser nicht-alkoholischen Modelle variiert von genetischen Auslösern bis zu einer alimentär bedingten Fettleber.
Ein genetisches Modell stellt die sog. Zucker-Ratte dar. In den 60er Jahren des 20.
Jahrhunderts wurde dieses Rattenmodell von ZUCKER et al. beschrieben. Diese Ratten zeichnen sich durch eine Hyperphagie, Hyperlipidämie und eine milden Glukoseintoleranz aus (BRAY u. YORK 1972, ZUCKER u. ZUCKER 1961, IONESCU et al. 1985). Diese pathologische Veränderung ist primär Folge der rezessiven Vererbung einer Punktmutation (CAG → CCG) im Leptinrezeptorgen (Fa) auf Chromosom 5. Diese Mutation führt zu einer Gln269 → Pro-Substitution in der extrazellulären Domäne des Leptinrezeptors und seinem Funktionsverlust (PHILLIPS et al. 1996, IIDA et al. 1996).
Leptin ist ein Peptidhormon und wird im Körper von Adipozyten synthetisiert. Es dient als afferentes Sättigungssignal im Hypothalamus (ARORA u. ARORA 2008). Bei den Ratten mit einer Leptinrezeptor-Dysfunktion fehlt das Sättigungssignal. Diese Ratten werden phänotypisch normal geboren. Sie entwickeln dann nach und nach ein höheres Körpergewicht, so dass sie ungefähr im Alter von 5 Wochen von heterozygoten, dünnen Littermates unterschieden werden können (ZUCKER u. ZUCKER 1961).
ALLGEMEINER TEIL
Auch auf alimentärer Basis ist eine Fettleberinduktion möglich. Dabei werden spezielle Diäten verwendet. Im Folgenden werden die am häufigsten verbreiteten Diäten kurz vorgestellt.
Die sog. MCD-Diät (Methionin-Cholin-defizient) enthält, wie der Name schon sagt, kein Methionin und Cholin. Beide Substanzen sind im Körper potente Antioxidantien. Cholin und seine Derivate sind wichtig für die strukturelle Integrität der Zellmembranen, den Methylmetabolismus, die cholinerge Neurotransmission, den transmembranen Signalweg und für den Lipid-Cholesterol-Transport und Metabolismus (REID 2001). Cholin ist ebenfalls ein essentielles Substrat für die Phosphatidylcholin-Synthese. Phosphatidylcholin (PC) ist das Phospholipid mit dem größten Vorkommen in Leber und Galle. Da die täglichen Sekretion von PC gleichgroß mit der absoluten Menge von PC in der Leber ist, muss PC täglich in großen Mengen synthetisiert werden. Wenn Nager mit einer Diät gefüttert werden, die nur einen Mangel an Cholin besitzen, entwickeln die Tiere ausschließlich eine Steatose. Erst bei einem gleichzeitigen Mangel an Methionin zeigen sich die pathologischen Veränderungen einer Steatohepatitis (NANJI 2004 a).
Bei einem Mangel der hepatischen Antioxidantien ist der oxidative Verteidigungs- mechanismus reduziert und in den Zellen entsteht ein oxidativer Stress aufgrund der Entstehung sog. Reactive Oxygen Species (ROS). Diese Situation induziert TNFα und pro- inflammatorische Zytokine (KOTEISH u. DIEHL 2003, KIRSCH et al. 2003). Die Zellen und auch die Zellorganellen wie Mitochondrien werden geschädigt und in ihrer normalen Funktion beeinträchtigt. Bezüglich dieser Diät konnte eine Studie von KIRSCH et al. (2003) zeigen, dass bei einer vierwöchigen Fütterung der MCD-Diät im Vergleich männlicher und weiblicher Wistar, Long Evans und Sprague Dawley-Ratten der größte Grad an Steatose bei männlichen Wistar-Ratten zu finden war.
Ein weiteres Modell für eine akute Steatose ist die so genannte „Fasting and Refeeding“- Methode (DELZENNE et al. 1997). Dabei werden die Ratten über 48 Stunden genüchtert und erhalten anschließend ad libitum eine kohlenhydratreiche, fettfreie Diät. Sechs Stunden nach Wiederfütterung kann man histologisch an H.E.-gefärbten Leberschnitten mikrovesikuläre
ALLGEMEINER TEIL
positiv sind und so als mikrovesikuläre Steatose angesprochen werden können. 24 Stunden nach Wiederaufnahme der Fütterung ist diese Alteration über alle Zonen der Lobulae ausgedehnt und teils auch als Makrovesikel zu finden. Nach 48 Stunden ist eine milde bis gemäßigte Steatose präsent, die die trabekulare Struktur des Leberparenchyms in Zone I und II schädigt. Die Hepatozyten sind hierbei vergrößert und zeigen ein schaumiges Zytoplasma.
In Zone III, also zentrolobulär ist die trabekulare Struktur besser erhalten. Dort weisen die Hepatozyten Sudanrot 7b-positive mikro- und makrovesikuläre Veränderungen auf. Es zeigen sich allerdings keine inflammatorischen Infiltrationen.
Unterschiedliche Fütterungen mit Fruktose oder Succhrose angereicherten Diäten führen ebenfalls zur Fettleber. Bei der Verwendung einer Spezialdiät, die mit Fruktose angereichert ist und 60 % Kohlenhydrate enthält, zeigen Sprague Dawley-Ratten bei einer Fütterungsdauer von fünf Wochen makro- und mikrovesikuläre Fettablagerungen in der Leber bei gleichzeitiger Erhöhung hepatischer Triglyceride und Cholesterol bei gleichzeitiger Reduktion der hepatischen Phospholipide (ACKERMAN et al. 2005). Verwendet man eine succhrosereiche Diät (70 % Succhrose) werden die Ratten fettleibig und zeigen nach zwei bis drei Wochen eine Fettleber. Bei einer Fütterung von 10 % Fruktose in Wasser, zeigen Wistar- Ratten nach bereits 48 Stunden eine Induktion der Fettsäuresynthese (NANJI 2004 a).
Bei der High Fat-Diät wird wie der Name schon sagt der Diät eine große Menge an Fett zugesetzt. LIEBER et al. (2004) habe eine solche Diätformulierung beschrieben, welche eine Leberverfettung induziert. Männliche Sprague Dawley-Ratten erhalten dabei eine Diät, in der 71 % der Kalorien aus Fett stammen. Nach drei Wochen entwickeln diese Ratten eine panlobuläre Steatose. Auch von ZOU et al. (2006) wird ein Modell auf der Basis einer High Fat-Diät beschrieben, welche per Magensonde verabreicht wird und zu NASH führt. Durch diese exzessive Zufuhr von Fetten über die Nahrung werden die westlichen Lebensumstände mit einer viel zu fettreichen Ernährung am besten widergespiegelt. Aus diesen Gründen wurde die Diät von LIEBER et al. (2004) in der vorliegenden Studie ausgewählt, um eine Leberverfettung zu induzieren.
ALLGEMEINER TEIL
2.4 Stammhintergrund der Rattenstämme
Im Folgenden soll auf den Hintergrund der Laborratte allgemein und der drei verwendeten Rattenstämme im Speziellen eingegangen werden. Als Informationsquelle dienten LINDSEY u. BAKER. (2006) und die von der Fa. Charles River zur Verfügung gestellten Daten.
Ratten werden weit verbreitet in verschiedenen Fragestellungen im Labor eingesetzt. Die norwegische Ratte (Rattus norvegicus) ist die erste Säugetiersspezies, die speziell für wissenschaftliche Zwecke domestiziert wurde. Sporadisch wurde sie wahrscheinlich schon vor 1850 für Ernährungsexperimente in Europa benutzt. Die erste Arbeit allerdings, die große Beachtung fand und die die Ratte als experimentelles Modell benutzt, wurde in Frankreich von PHILIPEAUX (1856) publiziert und beschäftigt sich mit den Effekten der Adrenalektomie bei Albino-Ratten. Die ersten Zuchtexperimente wurden mit Albinos und auch Wildtieren in Deutschland von 1877 bis 1885 von CRAMPE durchgeführt (CRAMPE 1877, CRAMPE 1883, CRAMPE 1884, CRAMPE 1885). Ab 1906 begann Henry H.
Donaldson seine Bemühungen, als wissenschaftlicher Leiter am Wistar-Institut in Philadelphia die Albino-Ratte zu standardisieren, welche er zuvor in vielen Forschungsprojekten in seinem Department der Neurochirurgie an der Universität von Chicago verwendet hatte. Er wiederum hatte die Albino-Ratten wahrscheinlich von der Universität Genf von Adolf Meyer erhalten, einem emigriertem Schweizer Neuropathologen, der sich um 1890 der Fakultät von Donaldson anschloss. Die Hauptabsicht war, verlässliche Stämme für Wachstums- und Entwicklungsstudien des Nervensystems zu bekommen. In Wirklichkeit war dieses jedoch die Grundlage für die Nutzung der Ratte in den Bereichen Ernährung, Biochemie, Endokrinologie, Genetik, Verhaltensforschung und indirekt in vielen anderen Forschungsbereichen (LINDSEY u. BAKER 2006).
Wistar (WIS)
Der Stamm kam 1947 vom Wistar-Institut in Philadelphia zu Scientific Products Farm Ltd.;
diese Firma wurde später zu Charles River Laboratories United Kingdom (CRUK). Zu Charles River Laboratories USA kam der Stamm im Jahre 1975. Diese spezielle Kolonie wurde wegen der niedrigen Inzidenz von Hydronephrose gewählt. Die Tiere sind Albinos. Sie
ALLGEMEINER TEIL
werden als generelles Modell für vielfältige Zwecke, besonders bei infektiösen Erkrankungen, in der Sicherheits- und Effizienztestung und Alterungsforschung eingesetzt.
Die Kolonie wird als Auszucht-Stamm geführt (http://www.criver.com/SiteCollection Documents/Wistar%20rat.pdf).
Lewis (LEW)
Der Ursprung dieses Stammes liegt im Wistar Institut. Er wurde aus Tieren entwickelt, die von Margaret Reed Lewis am Wistar Institut ausgewählt und ingezüchtet wurden. 1956 erreicht der Stamm die achte Generation der Inzucht (LINDSEY u. BAKER 2006).
Zu Charles River kam der Stamm aus Tulane, USA im Jahre 1970 in der F34-Generation.
Auch diese Ratten sind Albinos. Sie werden in der Transplantationsforschung, für induzierte Arthritis/Inflammation, experimentelle allergische Enzephalitis, und Streptozotocin-induzierte Diabetes eingesetzt. Dieser Stamm ist ein klassischer Inzucht-Stamm (http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/Lewis%20Rat.pdf).
Sprague Dawley (SD)
Der genaue Ursprung der Sprague Dawley-Ratte ist ungewiss. Der ursprüngliche Bestand wurde etwa 1925 von Robert Worthington Dawley (1897-1949), einem Physikochemiker an der Universität von Wisconsin, etabliert. Bei der Stammbenennung kombinierte er den Mädchennamen seiner ersten Frau mit seinem eigenen Namen und erhielt so den Stamm- Namen Sprague Dawley. Danach etablierte er eine kommerzielle Firma, bekannt als Sprague- Dawley Inc., in Madison, Wisconsin, welche sich ausschließlich mit der Bewerbung und dem Verkauf seiner Ratten beschäftigte. Nach seinem Tod 1949 wurde die Originalfirma zu ARS/Sprague-Dawley Company, welche heutzutage als Harlan Sprague Dawley weiterexistiert (LINDSEY u. BAKER 2006). Zu SASCO kommen die Sprague Dawley Ratten 1979 von ASR/Sprague Dawley in 1979, zu Charles River 1996. Die Fellfarbe bei diesen Ratten ist weiß, die Tiere sind Albinos. Sie werden als generelles Modell für vielfältige Zwecke, zur Sicherheits- und Effizienztestung, im Bereich der Alterung und Ernährung, für diät-induzierte Obesitas und in der Onkologie eingesetzt. Sie werden als Auszucht-Stamm geführt(http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/CD-RAT23.04.07.pdf).
ALLGEMEINER TEIL
2.5 Unterschiede im Geschlecht und in der ethnischen/stammspezifischen Zugehörigkeit bei Lebererkrankungen -Mensch und Tier-
Geschlechtsabhängige Unterschiede bei Lebererkrankungen werden häufig beschrieben, so z.B. bei viralen Hepatitiden, alkoholischen Lebererkrankungen, NAFLD, Autoimmun- hepatitis, primärer biliärer Zirrhose, primärer sklerosierender Cholangitis und dem hepatozellulärem Karzinom (HCC) (NAGOSHI 2008).
Die Prävalenz des Hepatitis B Oberflächen Antigens (HBsAG) ist bei Männer weltweit größer als bei Frauen (BLUMBERG et al. 1972).
Alkoholische Lebererkrankungen entwickeln sich hingegen bei Frauen schneller als bei Männern. Auch die Grenze derjenigen wöchentlich zu sich genommenen Alkoholmenge, die zur Entwicklung einer Lebererkrankung beitrug, liegt bei Männern höher (168-324 g) als bei Frauen (84-156 g). Bei gleicher aufgenommener Alkoholmenge im Bezug zum Körpergewicht kommt es bei weiblichen Individuen zu einer höheren Ethanolkonzentration im Blut. Dieser Zusammenhang wird auf einen geringeren Alkohol-Dehydrogenase-Spiegel im weiblichen Magen und einer damit verbundenen niedrigeren Aktivität dieses wichtigen Enzyms im gastrischen First-Pass-Ethanolmetabolismus zurückgeführt, was letztendlich in einer höheren Blutkonzentration resultiert (NAGOSHI 2008).
Die ethnische Zugehörigkeit und das Geschlecht wirken sich auch bei NAFLD aus. WESTON et al. (2005) zeigen in einer repräsentativen Studie innerhalb der U.S.-Bevölkerung, dass sowohl der ethnische Hintergrund als auch das Geschlecht Einfluss auf die Erkrankung haben. Dieser Unterschied ist schon aus ähnlichen Erkrankungen wie der Hepatitis C- Erkrankung bekannt. So reagieren Afroamerikaner schlechter auf eine antivirale Therapie als Weiße/Kaukasier (MUIR et al. 2004). In Asien wurde gezeigt, dass die Prävalenz der NAFLD bei Männern höher ist als bei Frauen (CHITTURI et al. 2007).
Die Prävalenz von NASH ist bei morbid fettleibigen Männern größer im Vergleich zu morbid fettleibigen Frauen (ARUN et al. 2006). Auch in Asien konnte eine höhere Prävalenz von NAFLD bei Männern gezeigt werden. Es gibt allerdings bei manchen Studien auch einen Alterstrend. In einer japanischen Studie ist die Prävalenz 25-30 % in allen Altersgruppen bei
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von 30-39 Jahren betrug und schrittweise mit dem Alter der Frauen anstieg, so dass bei Frauen über 70 Jahre die Fettleber stärker prävalent war. Der Anteil der Frauen bei Patienten mit einer schweren Fibrose bei NAFLD scheint höher zu sein als bei Patienten mit einer milderen Fibrose (NAGOSHI 2008).
Das Immunsystem der Frau unterscheidet sich von dem des Mannes durch eine höhere Zahl von CD4+-T-Lymphozyten und ein höheres CD4+/CD8+-Verhältnis. In der Zellkultur zeigt sich, dass die Sekretion von IFN-γ und IL-10 nach der Zugabe von Östrogen in das Medium der Zellkultur aus T-Zell-Klonen einer Frau stieg. Die Sekretion von IFN-γ, IL-4 und IL-5 wird in murinen Zellen durch Androgen inhibiert. Die Immunantwort bei Östrogen in niedrigen Konzentrationen ist verstärkt, bei höheren Konzentrationen supprimiert. Dieses könnten Hinweise darauf sein, dass Östrogen oder Androgen das Immunsystem modulieren können und so in das Geschehen von Autoimmunerkrankungen wie einer Autoimmunhepatitis eingreifen (NAGOSHI 2008).
Betrachtet man das HCC, zeigt sich bei Männern eine höhere Inzidenz als bei Frauen, das Verhältnis liegt zwischen 2:1 und 4:1. Klinisch kann man allgemein bei Männern eine schnellere Progression einer chronischen Lebererkrankung hin zu einer Zirrhose beobachten.
Eine Zirrhose kann zu einem HCC führen. Der Mechanismus der Beeinflussung der HCC- Entstehung durch Östrogen und Androgen ist noch nicht vollständig verstanden (KALRA et al. 2008).
Induziert man bei Mäusen NASH mittels cholindefizienter Diät, dann ist kein Unterschied des Leberschadens bezüglich der Geschlechter nachzuweisen (KASIREDDY u. RAO 2004).
Bei Aromatase-defizienten Mäusen, denen die intrinsische Östrogen-Produktion fehlt, kommt es zu einer hepatischen Steatose, die durch Behandlung der Mäuse mit 17-β-Östradiol deutlich verbessert werden kann (NEMOTO et al. 2000). Auch beim Ischämie/Reperfusionsschaden sind weibliche Mäuse in größerem Maß geschützt. Dieses basiert auf einem 17β-estradiol-Mechanismus, der allerdings noch nicht genau identifiziert worden ist. Als potentieller Ansatz wird eine Aktivierung der hepatischen eNOS Aktivität und verstärkter NO-Produktion vorgeschlagen (HARADA et al. 2003).
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Östrogen und seine Derivate sind starke endogene Antioxidantien, welche Lipidperoxid- Spiegel in der Leber und dem Blut senken. Sie verhindern myofibroblastische Transformationen von Sternzellen in der Ratten-Zellkultur (CODES et al. 2007).
2.6 Adipozytokine (Leptin, Adiponektin)
Fettgewebe partizipiert an der Regulation der Energiehomöostase, indem es selbst als endokrines Organ fungiert und diverse biologisch aktive Adipokine wie z.B. Freie Fettsäuren, Leptin und Adiponektin sezerniert.
Adiponektin wurde ursprünglich von vier Forschungsgruppen unabhängig voneinander in unterschiedlichen Herangehensweisen identifiziert. Strukturell gehört es zur Complement 1q- Familie. Das humane Adiponektin ist ein 244 Aminosäuren-Protein mit ca. 28 kDa und besitzt ein amino-terminales Signalpeptid (WHITEHEAD et al. 2006).
Es existiert als full-length oder nach proteolytischem Abbau z.B. durch Leukozyten als kleineres, globuläres Fragment, wobei allerdings nahezu das ganze Adiponektin im Plasma als full-length vorzuliegen scheint (KADOWAKI et al. 2006, VUPPALAMCHI et al. 2005).
Adiponektin bindet an zwei Rezeptoren, die Isoformen 1 und 2, die durch zwei Gene codiert werden: AdipoR1 und AdipoR2. Der AdipoR1-Rezeptor besitzt eine hohe Affinität für das globuläre Adiponektin, während der AdipoR2-Rezeptor beide Adiponektin-Formen mit einer mittleren Affinität erkennt (VUPPALAMCHI et al. 2005).
Die Rezeptoren für Adiponektin sind in allen Geweben zu finden; der Rezeptortyp 1 vor allem in Muskelgewebe und Typ 2 in der Leber. Die Konzentration des Adiponektins ist reduziert bei systemischer Insulinsensitivität sowie Steatosis. Es wird angenommen, dass Adiponektin die Hepatozyten vor Triglyceridakkumulation schützt, in dem es an seinen Rezeptor Typ 2 bindet und so die AMP-Kinase durch Phosphorylation aktiviert. Diese hat eine Vielzahl von Effekten, eingeschlossen einer Reduktion von pro-oxidativen Produkten wie reaktiven Sauerstoffspezies (ANANIA 2005).
Neben seinen metabolischen Effekten besitzt Adiponektin ebenfalls antiinflammatorische Wirkung und wirkt antidiabetisch und antiatherogen (DANCYGIER 2006).
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Niedrige Adiponektinspiegel sind assoziiert mit dem Ausmaß an hepatischer Steatose, Necroinflammation und Fibrose in NAFLD (ADACHI u. BRENNER 2007).
Ein weiteres Adipozytenhormon mit großer Bedeutung ist das Leptin. Dieses 16kDa große Protein wurde nach dem griechischen Wort λεπτοσ, welches „dünn“ bedeutet, benannt. 1994 wurde es von Friedman et al. entdeckt (ARORA u. ARORA 2008). Es besitzt auffällige Ähnlichkeit mit Mitgliedern der langkettigen, helikalen Zytokin-Familie, zu der auch IL-6, IL-11 und IL-12 gehören. Die dreidimensionale Struktur des 167-Animosäuren-Moleküls Leptin basiert auf vier antiparallelen α-Helices, die durch zwei lange Querverbindungen und einer kurzen Schleife verbunden und in einem linksgängigen Bündel arrangiert sind, welches zweischichtig gepackt ist (FRÜHBECK 2006) (Abb. 3).
Abb. 3: Ribbondiagramm von Leptin ( ZHANG et al. 1997) .
Es wird von dem ob-Gen codiert und hauptsächlich im weißen Fettgewebe von den Adipozyten synthetisiert. Leptin dient in Abhängigkeit zur Fettmasse des Körpers als hypothalamisches Signal für die Überfüllung der Körperenergiespeicher (BATRA et al. 2004, ARORA u. ARORA 2008, FRÜHBECK 2006). Unter besonderen Unständen kann es allerdings auch in geringen Mengen in der Plazenta, gastrischen Mukosa, im Knochenmark, Mammaepithel, Skelettmuskel, Hypothalamus, in der Hypophyse und Knochen produziert werden (FRÜHBECK 2006).
ALLGEMEINER TEIL
Des Weiteren spielt Leptin eine wichtige Rolle bei der Regulation der Nahrungsaufnahme, des Energieverbrauchs und der Adipositas (Abb. 4).
Abb. 4: Regulation des Energiehaushaltes durch Leptin (GAO u. HORVATH 2008).
Bisher sind sechs Varianten des Leptin-Rezeptors identifiziert, welche sich in der COOH- Gruppe der Proteine unterscheiden (QIAN u. FAN 2008). Die Rezeptoren sind im Zentralnervensystem hauptsächlich in den afferenten Zentren des Hypothalamus und in peripheren Organen (Fettgewebe, Muskel, Pankreas, Leber) zu finden. Dieses zeigt die auto- und parakrine Rolle des Leptins in der Energieregulation. Neben seinen physiologischen Aufgaben kann Leptin auch pathologische Zustände beeinflussen wie z.B. adipositas-
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assoziierte Arteriosklerose, oxidativen Stress und Krebs (ARORA 2008). Ebenfalls wird ihm eine pro-fibrotische Wirkung zugesprochen (KISSELEVA u. BRENNER 2007).
In der aktuellen Diskussion um eine „hormonzentrierte“ Sichtweise bei der Pathogenese der NAFDL (LONARDO et al. 2006) ist es von entscheidender Bedeutung, für das Verständnis der beteiligten molekularen Mechanismen sowie für die Entwicklung optimierter Therapieverfahren ein den häufigsten Ursachen nahe stehendes, kliniknahes Tiermodell zu charakterisieren.
2.7 Ziel der Studie
Die Pathogenese der NAFLD, insbesondere der Mechanismus der Progression der Steatose zur Steatohepatitis und Fibrose, ist bislang in ihren molekularen Abfolgen noch unzureichend erforscht. Die unterschiedliche Ausprägung, Progression und Reversibilität der Fettleber in den bisher verfügbaren tierexperimentellen Modellen lassen stamm- und geschlechts- spezifische Unterschiede in der Pathogenese der NAFLD vermuten, die durch eine unterschiedliche Adipozytenhormonregulation und Mikrozirkulationsstörung ausgelöst werden könnten.
Hypothese
Es gibt eine unterschiedliche Verfettung in Abhängigkeit des Stammes bei der Induktion der Fettleber mittels High Fat-Diät.
Darüber hinaus wird die Verfettung bzw. der Verfettungsmodus geschlechtsabhängig geprägt.
Ziel der Studie ist der Vergleich unterschiedlicher Rattenstämme und beider Geschlechter, um die Forschungsergebnisse bezüglich der Fettleber besser in Verbindung miteinander zu setzen. Damit lassen sich Ergebnisse hinsichtlich ihrer Aussagekraft besser und exakter interpretieren. Die Ergebnisse dieser Studie tragen einerseits zur Standardisierung der Tiermodelle bei, andererseits stellen sie die Grundlage für Folgeprojekte mit therapeutischer Beeinflussung der NAFLD, z. B. durch Manipulation der Expression des Adipozytenhormons Adiponektin in verschiedenenen pathophysiologischen Szenarien (Spenderkonditionierung vor Lebertransplantation, Ischämie/Reperfusionsschaden, Lebertransplantation) dar.
MATERIAL UND METHODEN
3. Material und Methoden
3.1 Versuchstiere und Studiendesign
Sämtliche Versuche wurden in der Abteilung Chirurgische Forschung der Klinik und Poliklinik für Allgemein- und Viszeralchirurgie des Universitätsklinikums Münster durchgeführt.
Insgesamt wurden für diese Versuche 72 Ratten im Alter von fünf Wochen eingesetzt. Dabei wurden zu gleichen Teilen die Rattenstämme Sprague Dawley, Lewis und Wistar verwendet.
Pro Stamm war jeweils die Hälfte der Tiere weiblichen Geschlechts. Alle Versuchstiere wurden von der Fa. Charles River Laboratories, Sulzfeld bezogen.
Die Versuchstiere wurden im Alter von vier Wochen geliefert. Sie wurden dann eine Woche zur Akklimatisierung in der Zentralen Tierexperimentellen Einrichtung (ZTE) der Medizinischen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität gehalten. Im Alter von fünf Wochen begann die Fütterung gemäß dem Studiendesign. Während der gesamten Haltungszeit in der ZTE wurden sie in Makrolon-Käfigen der Größe 4 gehalten. Sie unterlagen einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Rhythmus. Die Raumtemperatur betrug konstant 24 ° C. Sie erhielten Wasser und das entsprechende Futter ad libitum.
3.2 Versuchsgruppen
Die Versuchstiere wurden innerhalb des jeweiligen Geschlechtes und Stammes randomisiert und auf die unterschiedlichen Versuchsgruppen verteilt. Diese unterschieden sich in der Art des Futtermittels. Die Hälfte der Versuchstiere erhielt eine High Fat-Diät (Fa. Altromin, Lage), die andere Hälfte eine Standard-Diät (Haltungsdiät Mäuse-Ratten, Fa. Altromin, Lage) (Tab. 5).
MATERIAL UND METHODEN
Proben- entnahme Tab. 5 : Einteilung der Versuchsgruppen.
Gruppe Stamm Fütterung Geschlecht Anzahl High Fat Männlich
Weiblich
6
I Lewis 6
Standard Männlich Weiblich
6 6 High Fat Männlich
Weiblich
6 II Sprague 6
Dawley
Standard Männlich Weiblich
6 6 High Fat Männlich
Weiblich
6
III Wistar 6
Standard Männlich Weiblich
6 6
Σ 72
Abb. 5: Zeitlicher Versuchsablauf.
Tag 0 7 14 21
Fütterungsbeginn
• Standarddiät
• High Fat Diät
MATERIAL UND METHODEN
3.3 Versuchsdurchführung
Alle Versuchstiere erhielten entsprechend ihrer Versuchsgruppenzugehörigkeit die ihnen zugeteilte Diät für drei Wochen und wurden alle drei Tage gewogen. Nach Ablauf der Fütterungszeit erfolgten die Probenentnahme und anschließend die Opferung der Versuchstiere (Abb. 5).
3.4 Futter
Sowohl die Standardhaltungsdiät als auch die High Fat-Diät wurden von der Firma Altromin (Lage, Deutschland) bezogen. Die Inhaltsangaben der beiden Diäten sind im Anhang zu finden. Eine Woche nach Lieferung der Versuchstiere begann die Fütterung entsprechend der Studieneinteilung. Die Tiere mit der Standardhaltungsdiät erhielten ihr Futter ad libitum als Pellets. Die breiartige High Fat-Diät wurde zu kleinen Bällchen geformt und ebenfalls ad libitum gefüttert.
3.5 Narkose
Die Blut- und Gewebegewinnung zum Ende der Fütterungsperiode erfolgte unter Narkose.
Diese wurde mit Forene® (Hersteller: Abbott, Wiesbaden; Wirkstoff: Isofluran) durchgeführt.
Als Trägergas wurden Lachgas und Sauerstoff im Verhältnis von 2:1 verwendet. Lachgas besitzt einen analgetischen Effekt und führt zu einer Reduktion des Isofluran-Einsatzes (Second-Gas-Effekt). Zur Narkoseeinleitung wurden die Tiere in eine Narkosekammer aus Kunststoff verbracht, welche mit dem Isofuran-Lachgas-Sauerstoffgemisch (2,5 Vol%
Isofluran, N2O:O2 = 2:1) geflutet wurde. Nachdem das Versuchstier den Verlust der Stellreflexe zeigt, was durch einfaches Drehen der Narkosekammer zu prüfen war, wurde es aus der Narkosekammer genommen. Die Narkose wurde anschließend in einem halboffenen System mit einer Gesichtsmaske bei 1,5 Vol% Isofluran aufrechterhalten. Als Nasenmaske diente eine 50 ml-Spritze, in der das Versuchstier mit der Nase platziert wurde.
MATERIAL UND METHODEN
3.6 Blutuntersuchungen
Zur Blutentnahme wurden die Tiere in Narkose gelegt. Zur Bestimmung der Narkosetiefe wurde die Tiefensensibilität der Ratte mittels Zwischenzehenreflex geprüft. Bei einem negativen Zwischenzehenreflex wurde das Tier seitlich gelagert, der Hals zur Stauung der Venen ein wenig komprimiert, die Augenlider zwischen Daumen und Zeigefinger des Probennehmers aufgespannt und am nasalen Augenwinkel eine Hämatokritkapillare (4 µl NH4-Heparin-End-zu-End-Kapillare, Fa. Sarstedt, Nümbrecht) mit drehend-schiebenden Bewegungen unter Schonung des Bulbus bis zum retrobulbären Venengeflecht vorgeschoben.
Das Blut wurde in einem mit Lithium-Heparin-beschichteten Microtainer (Fa. Becton Dickinson Microtainer Brand Tube, Franklin Lakes, USA) aufgefangen. Insgesamt wurden 3 ml Blut entnommen. Anschließend wurde die Probe innerhalb von zwei Minuten nach Entnahme in einer Zentrifuge (Centrifuge 5417 R, Fa. Eppendorf, Hamburg) bei 3000 rpm und einer Temperatur von 4 ° C für zehn Minuten zentrifugiert.
3.6.1 Plasma
Das Plasma wurde nach der Zentrifugation in Eppendorf-Gefäße mit einem Fassungsvermögen von 2 ml (Fa. Eppendorf, Hamburg) abpipettiert. 0,5 ml der Probe wurde innerhalb von einer Minute bezüglich der biochemischen Parameter im Labor untersucht. Die restliche Probe wurde innerhalb von fünf Minuten nach Zentrifugation in 200 μl-Aliquots aufgeteilt, in Eppendorf-Gefäße abgefüllt und für weitere Untersuchungen (ELISA) bei -80°
C asserviert.
Klinische Chemie
Die Bestimmung der Parameter der klinischen Chemie erfolgte im Vitros 250-Automaten der Fa. Ortho-Clinical Diagnostics (Neckargemünd) bei 37° C.
Es wurden folgende Parameter bestimmt: Kalium, Bilirubin, Alkalische Phosphatase, ALT, AST, PCHE, Lipase, Albumin, HDL, LDL, Triglyceride, Cholesterin (Tab. 6).
MATERIAL UND METHODEN
Tab. 6 : Reaktionsprinzipien der unterschiedlichen Parameter in der klinischen Chemie Parameter Reaktionsprinzip
Albumin • Albumin + Bromcresolgrün (BCG) → BCG-Albumin-Komplex
• 37 °C, 630 nm Alkalische
Phosphatase (AP)
• p-Nitrophenylphosphat (+ ALKP, Mg2+, Amp) → p-Nitrophenol + H3PO4
• 37 °C, 400 nm
Alaninamino- transferase (ALT)
• Alanin + α -Ketoglutarat → (+ ALT, P-5-P) → Pyruvat + Glutamat
• Pyruvat + NADH + H+ (+ LDH) → Laktat + NAD+
• 37 °C, 340 nm
Aspartatamino- tranferase (AST)
• Aspartat + α-Ketoglutarat (+ AST, P-5-P) → Oxalacetat + Glutamat
• Oxalacetat (+ Oxalacetat-Decarboxylase) → Pyruvat + CO2
• Pyruvat + Phosphat + O2 (+ Pyruvatoxidase) → H2O2 + Acetylphosphat
• Wasserstoffperoxid + Leukofarbstoff (+ Peroxidase) → Farbstoff
• 37 °C, 670 nm
Gesamt-Bilirubin • Gesamt-Bilirubin (+ Dyphyllin) → Azobilirubin-Chromophoren
• 37 °C, 540 und 460 nm Kalium • direkte Potentiometrie
Lipase
• 1-Oleoyl-2,3-diacetylglycerin (+ Lipase, Cholinlipase, pH 8) → 2,3- Diaceytlglycerin + Ölsäure
• 2,3-Diaceytlglycerin (+ Diacetinase) → Glycerin + Ölsäure
• Glycerin + ATP (+ Glycerinkinase, MgCl2) → L-α-Glycerophosphatoxidase + ADP
• L-α-Glycerophosphatoxidase + O2 (+L-α-Glycerophosphatoxidase) → Dihydroxiacetonphosphat + H2O2
• H2O2 + Leukofarbstoff (+ Peroxidase) → Farbstoff + 2 H2O
• 37 °C, 540 nm
High Density Lipoprotein (HDL)
• Lipoproteine hoher Dichte (+ TX100) → Cholesterin + Cholesterinester+
Proteine
• Cholesterinester + H2O (+ Cholesterinesterhydrolase) → Cholesterin + Fettsäuren
• Cholesterin + O2 (+ Cholesterinoxidase) → Cholest-4-en-3-on + H2O2
•
MATERIAL UND METHODEN
Low Density Lipoprotein (LDL)
• LDL-Cholesterinester + H2O (+ Detergenz, Cholinesterase) → Cholesterin + freie Fettsäuren
• LDL-Cholesterin + O2 (+ Cholesterinoxidase) → Δ4-Cholestenon + H2O2
• 2 H2O2 + 4-Aminoantipyrin (+ Peroxidase) → Violettblaues Pigment + 5 H2O
• 37 °C, 585 nm
Triglyzeride
• Lipoproteine (+ Tensid) → Triglyzeride + Proteine
• Triglyzeride + H2O (+ Lipase) → Glyzerin + Fettsäuren
• Glyzerin + ATP (+ Glyzerinkinase, MgCl2 → L-α-Glyzerophosphat + ADP
• L-α-Glyzerophosphat + O2 (+ L-α-Glyzerinphosphatoxidase) → Dihydroxyacetonphosphat + H2O2
• H2O2 + Leukofarbstoff (+ Peroxidase) → Farbstoff + 2 H2O
• 37 °C, 540 nm
Pseudocholin- esterase (PCHE)
• Butyrylthiocholin + H2O (+ PCHE) → Thiocholin + Butyrat
• 2 Thiocholin + 2 Kaliumferricyanid → Dithiobis(cholin) + 2 Kaliumferrocyanid
• 37 °C, 400 nm
Cholesterin
• Lipoprotein (+ TX100) → Cholesterin +Cholesterinester + Proteine
• Cholesterinester + H2O (+ Cholesterinesterhydrolase) → Cholesterin + Fettsäuren
• Cholesterin + O2 (+ Cholesterinoxidase) → Cholest-4-en-3-on + H2O2
• H2O2 + Leukofarbstoff (+ Peroxidase) → Farbstoff + 2 H2O
• 37 °C, 540 nm
Enzyme linked immunosorbent assay (ADN und Leptin)
Mittels enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) wurden die Parameter Leptin, Adiponektin untersucht. Als Probenmaterial wurden hierfür die bei -80°C gelagerten Plasmaaliquots herangezogen.
Zur Leptinbestimmung diente ein mouse Leptin-ELISA-Test-Kit (Fa. R&D, Katalognummer:
DY 498, Minneapolis, USA). Im ersten Schritt wurden die entsprechenden Stoffe rekonstituiert und in die benötigte Arbeitskonzentration überführt. Der erste Antikörper (Capture Antibody, goat anti mouse Leptin) wurde mit 1 ml PBS rekonstituiert. Daraus resultierte eine Konzentration von 360 µg/ml. Diese Lösung wurde mit PBS zu einer
MATERIAL UND METHODEN
Arbeitskonzentration von 2 µg/ml verdünnt. Der zweite Antikörper (Detection Antibody, bionylated goat anti mouse Leptin) wurde in 1 ml Reagent Diluent (0,05 % Tween® 20 in PBS) gelöst. Die entstandene Lösung enthielt eine Konzentration von 36 µg/ml und wurde in einem zweiten Schritt mit Reagent Diluent zu einer Arbeitskonzentration von 200 ng/ml verdünnt. Die Rekonstitution des Standards erfolgt mit 0,5 ml Reagent Diluent. Damit erhielt man eine Lösung mit 95 ng/ml. Die benötigte Konzentration von 8000 pg/ml wurde mit Reagent Diluent hergestellt und im Anschluss eine zweifache Serienverdünnung mit Reagent Diluent durchgeführt, die zu einer Konzentrationsreihe von 8000, 4000, 2000, 1000, 500, 250 pg/ml führte. Danach erfolgte die Plattenpräparation. Dazu wurden 100 µl des 1. Antikörpers auf die 96-Well-Platte (MaxiSorp, Fa. NUNC) aufgetragen und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Am darauf folgenden Tag wurden alle Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht. Die Mikroplatte wurde mit Waschpuffer dreimal gewaschen und dann mit einer Blocklösung (Fetales Kälberserum 5 %, verdünnt mit PBS) 60 min bei Raumtemperatur geblockt. Nach dem erneuten Waschvorgang wurden pro Well 100 µl Standardlösung, die 1:
3 mit PBS verdünnte Probe oder PBS als Negativkontrolle aufgetragen und für 120 min inkubiert. Nach dem Waschen der Platte wurden pro Well 100 µl vom zweiten Antikörper zugefügt und 120 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Platte erneut gewaschen wie oben beschrieben und mit 100 µl Streptavidin-HRP (strepavidin conjugated with horseradish-peroxidase) für 20 min beschichtet. Die Platte wurde gewaschen und 100 µl Substrat-Lösung (H2O2:Tetramethylbenzidine = 1:1) für 20 min hinzugegeben. Die Farbreaktion wurde dann mit 50 µl Säure (2 N H2SO4) unterbrochen und die Platte direkt im Mikroplatten-Lesegerät (Sunrise, Fa. Tecan Austria) bei 450 nm ausgelesen.
Zur Auswertung wurde mittels der Standardverdünnungsreihe eine Standardkurve erstellt und so die Stoffmenge in den einzelnen Proben bestimmt.
Die Bestimmung der Adiponektinkonzentration wurde mit einem ELISA-Kit (AssayMax Human Adiponektin (Acrp30), Katalog-Nr. EA 2500-1, Fa. Assay Pro St. Charles, USA) durchgeführt. Für die ELISA-Durchführung wurden die nötigen Verdünnungen und Rekonstitutionen durchgeführt. Das zehnfach konzentrierte MIX Diluent Konzentrat (gepufferte Proteinbase) wurde mit reagent grade water in die einfache Arbeitskonzentration
MATERIAL UND METHODEN
1:10 gemischt, um den benötigten einfach konzentrierten Waschpuffer zu erhalten. Die nötige Verdünnung des Streptavidin-Peroxidase-Konjugates betrug 1:100 und wurde mit MIX Diluent durchgeführt. Zur Erstellung der Standardlösung wurden 50 ng des Adiponektin- Standards mit 1 ml des einfach konzentrierten MIX Diluents rekonstituiert. Damit enthielt die Standardlösung 50 ng Adiponektin pro ml. Daraus wurde eine Standardverdünnungsreihe angelegt. Der Antikörper wurde im Verhältnis 1:150 mit MIX Diluent zur erforderlichen Arbeitskonzentration verdünnt.
Alle Reagenzien wurden vor Versuchsbeginn auf Raumtemperatur gebracht. Die Proben wurden aufgetaut und 1:150 mit dem MIX Diluent verdünnt. Anschließend wurden die Proben, die Standardverdünnungsreihe mit den Konzentrationen 50, 25, 12,5, 6,25 und 3,125 ng/ml und PBS als Negativkontrolle auf die Mikroplatte mit 96 Wells aufgebracht (50 µl pro Well) und für 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde die Platte viermal mit Wasch-Puffer gewaschen. Im Anschluss wurden vom Adiponektin-Antikörper 50 µl pro Well auf die Mikroplatte aufgetragen und wiederum für 60 min inkubiert. Nach erneutem viermaligem Waschen mit Waschpuffer wurden 50 µl Streptavidin-Peroxidase-Konjugat pro Well hinzugefügt und für 30 min inkubiert. Wiederum wurde viermal mit Waschpuffer gewaschen. Danach wurde 50 µl Chromogen-Substrat (stabilized peroxidase chromogen substrate tetramethylbenzidine) und 8 min später die Stopsäure (0,5 N hydoxychloric acid) hinzugegeben, um die Farbreaktion zu unterbrechen. Die Platte wurde direkt im Anschluss in ein Mikroplatten-Lesegerät (Sunrise, Fa. Tecan Austria) verbracht und die Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm ausgelesen.
Zur Auswertung wurde mittels der Standardverdünnungsreihe eine Standardkurve erstellt und so die Stoffmenge in den einzelnen Proben bestimmt.
Sowohl bei dem ADN- als auch bei dem Leptinnachweis wurden Doppelwerte bestimmt.
Innerhalb eines Geschlechts wurden alle Proben auf einer Platte aufgetragen und gleichzeitig bestimmt. Es wurden ebenfalls zwei Messungen der Absorption durchgeführt, um die Messwerte zu bestätigen.
