Aus der Klinik für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Neuer diagnostischer Algorithmus zur
Beurteilung der Krankheitsaktivität bei NAFLD
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der
Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Neele Stöckmann
aus Göttingen
Hannover 2019
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 27.08.2020
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Professor Dr. med. Michael P. Manns
Betreuerin der Arbeit: Prof .‘in Dr. med. Heike Bantel 1. Referent: PD Dr. med. Björn Hartleben
2. Referent: Prof. Dr. med. Kinan Rifai Tag der mündlichen Prüfung: 27.08.2020 Prüfungsausschussmitglieder:
Vorsitz: Prof. Dr. med. Tobias Welte
1. Prüfer: Prof. Dr. med. Carlos A. Guzmán
2. Prüfer: PD Dr. med. Frank Gossé
Inhalt
1 Einleitung ... 1
2 Patienten, Methoden und statistische Analyse ... 9
2.1 Patienten ... 9
2.2 Methoden ... 9
2.3 Statistische Analyse ... 10
3 Ergebnisse ... 12
3.1 Risikoabschätzung einer fortgeschrittenen NAFLD durch Kombination nicht-invasiver ... 12
Methoden und einer Leberbiopsie... 12
3.2 Die Detektion von Caspase-gespaltenem Keratin-18 ermöglicht die Identifikation von NALFD-Patienten mit NASH trotz niedrigem NFS ... 14
3.3 Diagnostische Wertigkeit von M30 für die Detektion einer NASH bei NAFLD-Patienten mit undefinierbarem oder hohem NFS ... 16
3.4 Die M30-Bestimmung bei NAFLD-Patienten mit geringer Lebersteifigkeit ermöglicht die Identifikation von Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung ... 17
3.5 Evaluation der diagnostischen Wertigkeit von Caspase-gespaltenem Keratin-18 bei NAFLD-Patienten mit intermediärer oder erhöhter Lebersteifigkeit ... 19
3.6 Vorhersage einer NASH durch den Nachweis von Caspase-gespaltenem Keratin-18 bei NAFLD-Patienten mit niedrigem NFS oder niedriger Lebersteifigkeit ... 21
4 Diskussion ... 21
5 Zusammenfassung ... 24
6 Abkürzungsverzeichnis ... 25
7 Literaturverzeichnis ... 27
Anhang
I Lebenslauf ... 34
II Erklärung nach §2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7 der Promotionsordnung ... 35
III Danksagung ... 36
IV Veröffentlichung ... 37
1
1 Einleitung
Bedeutung und Epidemiologie der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung
Die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist eine der häufigsten Lebererkrankungen. Die weltweite Prävalenz wird auf 25% geschätzt.1
Die NAFLD umfasst die einfache Steatose (nicht-alkoholische Fettleber; NAFL) und die nicht- alkoholische Steatohepatitis (NASH).1 Die NASH ist histologisch gekennzeichnet durch eine Leberverfettung von mehr als 5% sowie eine Leberzellschädigung in Form eines hepatozellulären Balloonings und einer lobulären Inflammation. In der Folge können eine Leberfibrose und eine Zirrhose entstehen.2 Patienten mit NASH haben ein erhöhtes Risiko für ein Fortschreiten der Erkrankung mit Entwicklung einer Leberzirrhose und eines hepatozellulären Karzinoms sowie für extrahepatische Komplikationen wie kardiovaskuläre Erkrankungen, Diabetes mellitus Typ 2, chronische Nierenerkrankung und extrahepatische Malignome.2-6 Die Leberfibrose stellt dabei den wichtigsten prognostischen Faktor für den Verlauf einer NAFLD dar und korreliert sowohl mit dem leberassoziierten Outcome als auch mit der Gesamtmortalität. Aufgrund der hohen Prävalenz der NAFLD ist mit einer zunehmenden Inzidenz der NAFLD-assoziierten Komplikationen, wie der Entwicklung hepatozellulärer Karzinome (HCC) zu rechnen.1 Die durch NASH induzierte Leberzirrhose und das dadurch verursachte hepatozelluläre Karzinom zeigen bereits eine Zunahme als Indikation zur Lebertransplantation.6, 8
Die frühzeitige Identifikation von NAFLD-Patienten mit einem erhöhten Risiko für eine Krankheitsprogression und Entwicklung von Komplikationen ist deshalb von essentieller klinischer Relevanz.
Die Pathogenese der NAFLD
Bei der NAFLD handelt es sich um ein Krankheitsbild, das multifaktoriell bedingt ist. Die Mechanismen der NASH-Pathogenese sind noch nicht vollständig geklärt.9, 10
Risikofaktoren für die Entwicklung einer NAFLD sind ein fortgeschrittenes Alter, eine erhöhte Kalorienzufuhr mit einem konsekutiv erhöhten BMI und das Vorliegen einer Insulinresistenz bzw. eines Diabetes mellitus Typ 2.8 Zudem besteht bei bestimmten Polymorphismen im patatin-like phospholipase domain containing 3 (PNPLA3)-Gen,
2 welches für ein Protein codiert, das Fettsäuren in der Leber abbaut, eine genetische
Prädisposition für die Entwicklung einer Leberverfettung. Bei diesen Patienten besteht zudem ein erhöhtes Risiko für eine NAFLD-Progression mit Entwicklung einer NASH und
assoziierten Komplikationen wie der Entstehung einer Leberzirrhose und eines hepatozellulären Karzinoms.11, 12
Zur Leberverfettung kommt es, wenn ein Ungleichgewicht zwischen Synthese, Zufuhr, Abbau und Abtransport von Triglyzeriden besteht.10 Hier wirken verschiedene Mechanismen zusammen. Eine erhöhte Kalorienzufuhr in Kombination mit einer Insulinresistenz und damit assoziierten Hyperinsulinämie und -glycämie triggern die de novo-Lipogenese mit Produktion von freien Fettsäuren. Die Insulinresistenz führt zudem zur Lipolyse mit Freisetzung von freien Fettsäuren aus dem peripheren Fettgewebe.9 Dies führt zur Akkumulation von freien Fettsäuren in der Leber, die über Kompensationsmechanismen wie einer verstärkten
mitochondrialen β-Oxidation oder Autophagie abgebaut werden oder zur Triglyzeridsynthese herangezogen werden. Triglyzeride werden über VLDL ins Blut sekretiert und somit aus der Leber eliminiert oder als Fetttröpfchen in der Leber gespeichert, wodurch es zur
Leberverfettung kommt. Wenn die Kompensationsmechanismen mit zunehmender Insulinresistenz und Akkumulation von Fettsäuren erschöpft sind, kommt es zu toxischen Effekten der freien Fettsäuren in der Leber, die als Lipotoxizität bezeichnet werden. Hierzu zählen durch freie Fettsäuren induzierter oxidativer Stress mit ROS (reaktive
Sauerstoffspezies)-Bildung und endoplasmatischer Retikulum (ER)-Stress. Diese aktivieren wiederum Entzündungssignalwege und führen zur Leberzellschädigung und damit zur NASH.13, 14
Auch das Fettgewebe selbst ist in der NASH-Pathogenese involviert.15 Beispielsweise tragen die aus Adipozyten freigesetzten Zytokine wie TNF-α zur entzündlichen Leberschädigung und damit zur Entwicklung einer NASH und Leberfibrose bei. TNF-α inhibiert auch
Adiponektin, ein von Adipozyten freigesetztes Hormon, das die β-Oxidation von Fettsäuren und damit deren Abbau reguliert. Erhöhte TNF-α- und verminderte Adiponektin-Spiegel begünstigen somit die Fettsäureakkumulation und die dadurch verursachten
Entzündungsprozesse in der Leber.16, 17, 18
Weiter beeinflusst auch das Mikrobiom die Entstehung und Progression einer NAFLD. Eine veränderte Zusammensetzung des Mikrobioms mit Reduktion potentiell Krankheits-
hemmender Mikroorganismen wie Bacteroidetes sowie eine veränderte intestinale
3 Barrierefunktion mit Übertritt bakterieller Bestandteile und Stoffwechselprodukte ins Blut spielen dabei eine zentrale Rolle.6, 19 Bakterielle Endotoxine werden über die Pfortader in die Leber transportiert und verursachen dort beispielsweise über die Bindung an Toll-Like- Rezeptoren (TLR), wie TLR-4, die Aktivierung von entzündlichen Signalwegen und Apoptose von Leberzellen und tragen somit zur NASH-Entstehung und Fibrose bei.15, 19
Die Bedeutung der Apoptose in der Pathogenese der NAFLD
Die hepatozelluläre Apoptose, die bei NASH erhöht nachweisbar ist, wird über verschiedene Signalwege, wie den Todesrezeptor-vermittelten (extrinsischen) und den mitochondrialen (intrinsischen) Signalweg, induziert. Die Aktivierung des extrinsischen Signalweges erfolgt durch die Bindung spezifischer Liganden wie CD95L oder TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) an die entsprechenden Todesrezeptoren wie CD95 oder TRAIL-R1/R2.
Durch die dadurch induzierte Signalkomplexbildung erfolgt zunächst die Aktivierung von Initiator-Caspasen wie Caspase-8 und -10, die nachfolgend Effektor-Caspasen wie Caspase-3, -6 und -7, aktivieren. Der intrinsische Weg wird durch Cytochrom C aktiviert, welches bei zellulärem Stress aus den Mitochondrien freigesetzt wird. Eine dadurch induzierte
Signalkomplexbildung führt zur Aktivierung der Initiator-Caspase-9. Diese aktiviert nachfolgend die oben genannten Effektor-Caspasen. Effektor-Caspasen spalten für die Zellfunktion und -integrität wichtige Proteine und verursachen dadurch den apoptotischen Zelltod.20, 21
Zu den Caspase-Substraten zählt unter anderem das epithelzellspezifische Intermediärfilament (IF)-Protein Keratin-18. Keratin-18, ein Typ I-IF-Protein, wird zusammen mit dem Typ II-IF- Protein Keratin-8 von Hepatozyten exprimiert. Während der Apoptose von Hepatozyten wird Keratin-18 von aktivierten Effektor-Caspasen gespalten.22, 23 Die dabei generierten K18- Fragmente werden ins Blut freigesetzt, wo sie mittels des spaltungsspezifischen
monoklonalen K18-Antikörpers (M30) in einem enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) nachgewiesen werden können.20, 24, 25 Die Bestimmung von K18-Fragmenten ermöglicht es, frühzeitig nicht-invasiv eine apoptotische Leberzellschädigung bei akuten und chronischen Lebererkrankungen zu detektieren.20, 24
Es finden sich zunehmend Belege dafür, dass die Hepatozytenapoptose eine wichtige Rolle in der Pathogenese und der Krankheitsprogression der NAFLD spielt.25, 26 In diesem
Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass NASH-Patienten signifikant höhere Spiegel von
4 Caspase-gespaltenen K18-Fragmenten (M30-Antigen) im Vergleich zu NAFL-Patienten aufweisen.27-30 Der Blut-basierte M30-Nachweis wurde in verschiedenen Studien bei NAFLD-Patienten validiert und zeigte eine hohe diagnostische Genauigkeit für die
Vorhersage einer NASH.27, 29- 34 Zudem konnte gezeigt werden, dass der M30-Biomarker mit der histologischen Krankheitsaktivität und der Leberfibrose bei NAFLD korreliert.35, 36
Histologische Kriterien der NAFLD
Die NAFLD ist definiert durch das Vorhandensein einer überwiegend makrovesikulären Steatose von mehr als 5% der Hepatozyten, ohne dass ein relevanter Alkoholkonsum (20 g/d für Männer, 10 g/d für Frauen), eine Virusinfektion oder eine anderweitige Lebererkrankung vorliegt.37-39
Die Diagnose einer NASH erfordert das gleichzeitige Vorhandensein von Steatose, lobulärer Inflammation und Ballooning.37-39
Bei der Steatose wird im Wesentlichen eine makro- und eine mikrovesikuläre Verfettung unterschieden. Bei der makrovesikulären Verfettung finden sich ein großer zentraler Fetttropfen oder mehrere wenige kleinere, welche den Nucleus in die Zellperipherie
verdrängen. Bei der mikrovesikulären Steatose finden sich zahlreiche kleinere Fetttropfen und der Nucleus ist zentral gelegen. Die Steatose beginnt bei der NAFLD typischerweise in Zone 3, bei schwerer Steatose kann diese auch panazinär lokalisiert sein.37, 40, 41
Ein weiteres Diagnosekriterium ist die lobuläre Inflammation. Hier liegt meist ein
gemischtzelliges Infiltrat mit Lymphozyten, Neutrophilen, Eosinophilen, und Kupffer-Zellen vor. Vereinzelte Mikrogranulome (Kupffer-Zell-Aggregate) und Lipogranulome werden ebenfalls beobachtet. Eine portale Entzündung findet sich seltener und kann bei unbehandelter NAFLD Ausdruck für eine fortgeschrittene Erkrankung sein.37, 40, 41
Unter einem hepatozellulären Ballooning versteht man eine Schwellung der Hepatozyten mit rarefiziertem Zytoplasma. Dies beruht möglicherweise auf einer Alteration des Zytoskeletts mit Verlust der Keratine 8 und 18 und ist Ausdruck für einen Leberzellschaden. In
ballonierten Hepatozyten können sich Fetttropfen und/oder Zytoplasmaeinschlüsse,
sogenannte Mallory-Denk-Bodies, finden.37, 40, 41 Diese Strukturen finden sich in der Zone 3 von ballonierten Hepatozyten und beinhalten neben p62 und Ubiquitin im Wesentlichen Keratin-Aggregate mit einer verstärkten Expression von K8 gegenüber K18.14, 41, 42
5 Das Vorhandensein von Mallory-Denk-Bodies ist nicht erforderlich, kann jedoch hilfreich für die Diagnose einer NASH sein. Sie finden sich jedoch auch bei anderen Lebererkrankungen in höherer Anzahl, insbesondere bei alkoholischer Fettlebererkrankung.7, 41, 42
Bereits 1999 publizierte Brunt et al. in Anlehnung an die Beschreibung der chronischen Hepatitis eine semiquantitative Beschreibung für histologische Veränderungen bei NASH.40 2005 schlug eine Arbeitsgruppe um Kleiner den NAFLD Activity Score (NAS) vor, welcher die Gesamtheit der histologischen Veränderungen von der NAFL bis zur NASH erfassen sollte und validierte diesen auch.37 Das Bewertungssystem beurteilt semiquantitativ das Ausmaß der Steatose, lobulären Inflammation und hepatozellulären Ballonierung.37
Hinsichtlich der Steatose wird zwischen einer Verfettung des Leberparenchyms von < 5%, 5-33 %, 33-66 % oder > 66 % unterschieden und nach Ausmaß der Verfettung 0 bis 3 Punkte vergeben. Zur Beurteilung der lobulären Inflammation wurde die Anzahl der entzündlichen Herde lichtmikroskopisch bei 200-facher Vergrößerung betrachtet und bei fehlenden
entzündlichen Infiltraten mit null, weniger als zwei Herden mit einem, zwei bis vier Herden mit zwei und mehr als vier Herden mit drei Punkten bewertet. Bei der Beurteilung des Balloonings wurde zwischen keinen, wenigen und vielen ballonierten Hepatozyten unterschieden (0 bis 2 Punkte).37 Diese drei Parameter liegen der Berechnung des NAS zugrunde. Der Score entspricht der Summe der Punkte für Steatose, lobuläre Inflammation und Ballooning.37
Der NAS soll weniger der Diagnosestellung einer NASH als der Evaluation des
Krankheitsverlaufes und der therapeutischen Effekte über einen längeren Zeitraum dienen und wird als Einschlusskriterium und zur Verlaufsbeurteilung in klinischen Studien genutzt.41 Dabei wird in der Regel ein NAS ≥ 4 mit Vorliegen einer NASH, d. h. mindestens einem Punkt in allen drei Komponenten, als Einschlusskriterium gefordert.44
Das Staging beschreibt das Ausmaß der Fibrose und erfasst semiquantitativ vier Stadien. Bei der NASH findet sich typischerweise eine perisinusoidale/perizelluläre Fibrose, welche in Zone 3 beginnt (Fibrose-Stadium 1). Die Fibrose wird bei NAFLD häufig zusammen mit nekro-inflammatorischen Veränderungen beobachtet. Bei Voranschreiten der NASH bildet sich eine portale/periportale (Fibrose-Stadium 2), im Verlauf eine brückenbildende Fibrose (Stadium 3) und schließlich eine Zirrhose (Stadium 4) aus. Bei fortgeschrittener Fibrose oder Zirrhose können eine Steatose und nekro-inflammatorische Veränderungen rückläufig oder nicht mehr nachweisbar sein.45-47
6 Bedeutung der Leberbiopsie und der transienten Elastographie bei NAFLD
Die Leberbiopsie stellt aktuell den Goldstandard für die Diagnose einer NAFLD und das Fibrosestaging dar. Sie ist jedoch mit Kosten verbunden, kann mit Komplikationen einhergehen und das histologische Ergebnis kann durch „sampling errors“ eingeschränkt beurteilbar sein. 48 Es ist deshalb von Interesse nicht-invasive Methoden zu entwickeln und zu evaluieren, die NAFLD-Patienten mit einem erhöhten Risiko für einen Krankheitsprogress identifizieren können.
Die Lebersteifigkeitsmessung (transiente Elastographie) mittels FibroScan stellt eine etablierte Methode zur nicht-invasiven Beurteilung des Fibrosestadiums dar. Die Lebersteifigkeitsmessung kann jedoch bei adipösen Patienten, Patienten mit schmalem Interkostalraum oder Aszites schwierig oder unmöglich sein.49, 50 Zur Durchführung einer transienten Elastographie bei adipösen Patienten wurde kürzlich die XL-Sonde entwickelt.
Verglichen mit der M-Sonde sind mit der XL-Sonde bei adipösen Patienten häufiger gültige Messergebnisse zu erzielen. Dennoch werden auch mit dieser Sonde in bis zu 25% der Fälle unzuverlässige Ergebnisse erzielt.51, 52 Die diagnostische Genauigkeit für die Detektion einer signifikanten Fibrose (≥ F2) ist vergleichbar bei M- und XL-Sonde. Bei Verwendung der XL- Sonde ist jedoch zu beachten, dass die Lebersteifigkeit 0,8 -2,3 kPa niedriger gemessen wird als bei Verwendung der M-Sonde.39, 51, 53, 54 Mit Hilfe der M-Sonde kann bei einem Cut-off von 7,9 bzw. 9,6 kPa mit guter Sensitivität und Spezifität sowie einem negativen prädiktiven Wert von 97% ein fortgeschrittenes Fibrosestadium (≥ F3) identifiziert bzw. ausgeschlossen werden.55 Allerdings ist die Bestimmung der transienten Elastographie mit höheren Kosten verbunden und meist nur in Leberzentren verfügbar.
Alternative nicht-invasive Methoden zur Beurteilung des Vorliegens einer fortgeschrittenen Fibrose
Alternativ haben sich weitere nicht-invasive Scoring-Systeme wie der NAFLD Fibrosis Score (NFS) zur Beurteilung fortgeschrittener Fibrosestadien etabliert.31 Der NFS setzt sich aus Parametern zusammen, welche mittels Anamnese und einer Blutentnahme ermittelt werden können und erfasst Alter, BMI, das Vorliegen oder Fehlen einer diabetischen Stoffwechsellage, Transaminasen, die Thrombozytenzahl und den Serum-Albumin-Spiegel. Bei Verwendung eines Cut-offs von -1,455 kann eine fortgeschrittene Fibrose mit hoher Genauigkeit ausgeschlossen werden (negativer prädiktiver Wert (NPV) 93%). Außerdem kann unter
7 Berücksichtigung eines Cut-offs von 0,676 das Vorliegen einer fortgeschrittenen Leberfibrose mit einem positiven prädiktiven Wert von 90% vorhergesagt werden.31 Eine wesentliche Limitation des Scores ist jedoch, dass ein signifikanter Anteil der Patienten (20-58%) zwischen den beiden Cut-offs liegt (-1,455 bis 0,676) und somit einen undefinierbaren Score hat.56 Die Kombination nicht-invasiver Methoden kann möglicherweise die Anzahl der Patienten, die als falsch negativ eingestuft werden oder ein undefinierbares Risiko haben, reduzieren. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass die Kombination aus transienter Elastographie (TE) und NFS die diagnostische Genauigkeit zum Ausschluss einer fortgeschrittenen Leberfibrose bei NAFLD-Patienten erhöhen kann.56
Bisher ist unklar, ob die Kombination von nicht-invasiven Methoden zum Ausschluss einer fortgeschrittenen Leberfibrose mit einem Biomarker, der bereits frühe Zeichen einer Leberschädigung detektiert, die Anzahl falsch negativer Patienten mit fortgeschrittener NAFLD reduziert und die Anzahl der richtig identifizierten Patienten mit NASH und ggf.
bereits entwickelter Fibrose verbessert.
Neben dem NFS existieren weitere Tests und Scoring-Systeme zur Abschätzung einer Leberfibrose. Zahlreiche dieser Scores sind für eine spezielle Ätiologie der Lebererkrankung entwickelt worden. Zur Anwendung kommen unter anderem der Enhanced Liver Fibrosis (ELF)-Test, Fibrotest und FIB-4-Test.
Der ELF-Test verbindet drei verschiedene serumbiochemisch erhobene Parameter mit Hilfe eines Algorithmus: Hyaluronsäure, N-terminales Propeptid des Prokollagen Typ 3 und Gewebe-Metalloproteinase-1-Inhibitor. Dieser kommerziell erhältliche Test kann mit hoher diagnostischer Genauigkeit eine fortgeschrittene Fibrose nicht-invasiv nachweisen und ist von prognostischer Relevanz.57 Der ELF-Test kann auch das klinische Outcome bei NASH und Lebererkrankungen anderer Ätiologie vorhersagen.58
Auch der FibroTest ist ein kommerzieller Test, der initial für die virale Hepatitis entwickelt, jedoch auch für die NAFLD mit ausreichender diagnostischer Genauigkeit für den Nachweis einer fortgeschrittenen Fibrose evaluiert wurde. Dieser Test berücksichtigt Alter und
Geschlecht des Patienten sowie Gamma-GT, Gesamt-Bilirubin, Alpha2-Makroglobulin, Apolipoprotein A1 und Haptoglobin.59, 60
Der FIB-4-Test wurde zur Abschätzung einer Fibrose bei Patienten mit HCV/HIV-
Koinfektion entwickelt, wurde im Verlauf jedoch auch für die NASH evaluiert.61 Dieser Test bietet den Vorteil, dass ausschließlich Parameter erfasst werden, welche routinemäßig
8 bestimmt werden können. Für die Berechnung des FIB-4 werden Patientenalter, die
Transaminasen und Thrombozytenzahl benötigt. Dieser Test zeigte eine ausreichend hohe diagnostische Genauigkeit für den Nachweis bzw. den Ausschluss einer fortgeschrittenen Fibrose und eine bessere diagnostische Performance als andere nicht-invasive
Fibrosemarker.55, 62 Im Vergleich zum ELF-Test und FibroTest sind NFS und FIB-4 nicht kommerziell und deshalb einfach im klinischen Alltag verfügbar.
Fragestellung
In dieser Biopsie-kontrollierten Studie ist der Frage nachgegangen worden, inwieweit durch die zusätzliche Bestimmung des M30-Biomarkers NAFLD-Patienten mit erhöhtem Risiko für
NASH und Fibrose identifiziert werden können, wenn initial – wie gegenwärtig in der DGVS-Leitlinie vorgeschlagen,39 mittels NFS oder transienter Elastographie ein niedriges oder
intermediäres/undefinierbares Risiko für das Vorliegen einer fortgeschrittenen Fibrose ermittelt wurde.
9
2 Patienten, Methoden und statistische Analyse 2.1 Patienten
Bei 101 von 102 Patienten mit histologisch gesicherter NAFLD konnten wir den NAFLD Fibrosis Score (NFS) bestimmen. Die Diagnose einer NASH wurde auf dem Boden einer histologischen Untersuchung unter Berücksichtigung des NAFLD Activity Scores (NAS) nach Kleiner et al. gestellt.37 Dieser Score evaluiert semiquantitativ das Ausmaß von Steatose, lobulärer Inflammation und hepatozellulärem Ballooning und setzt sich aus der Summe der Einzelkomponenten zusammen. 62 Patienten hatten histologisch eine definitive NASH mit einer Steatose, Inflammation und Ballooning von jeweils mindestens 1 sowie einem kumulativen NAS von ≥ 4. Diese Definition wird in klinischen Studien als Einschlusskriterium von NASH-Patienten genutzt.44 40 Patienten erfüllten diese Kriterien nicht (NAS < 4).
Patienten mit NASH (54,8% männlich, durchschnittliches Alter 44,7 ± 1,5 Jahre) hatten einen durchschnittlichen NAS von 4,9 ± 0,1, wohingegen Patienten ohne definitive NASH (60%
männlich, durchschnittliches Alter 46,3 ± 2,0 Jahre) einen durchschnittlichen NAS von 2,3 ± 0,1 hatten (p < 0,01). Das histologische Fibrosestaging erfolgte nach Kleiner et al.37
Bei Patienten mit definitiver NASH konnten im Vergleich zu Patienten, die diese Kriterien nicht erfüllten, höhere Fibrosestadien (durchschnittliches Fibrosestadium 1,0 ± 0,1 versus 0,3
± 0,1; p < 0,01) nachgewiesen werden. Patienten mit NASH hatten einen signifikant (p < 0,01) höheren BMI von 30,7 ± 0,6 kg/m² im Vergleich zu solchen ohne NASH (BMI 27,1 ± 0,7 kg/m²). Durchschnittswerte für AST, ALT und Gamma-GT waren 59±4 U/L, 95±7 U/L und 154±22 U/L bei Patienten mit NASH verglichen mit 46±4 U/L, 82±10 U/L und 164±22 U/L bei Patienten ohne NASH. NASH-Patienten hatten einen signifikant (p < 0,01) höheren M30- Spiegel (524±64 U/L) als solche ohne NASH (245±29 U/L). Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied im prozentualen Anteil von Typ 2-Diabetes bei Patienten mit und ohne NASH (17,7% versus 10,0%).
2.2 Methoden
Bestimmung des NAFLD Fibrosis Score (NFS). Der NFS umfasst Alter, BMI, das Vorliegen oder Fehlen einer diabetischen Stoffwechsellage, Transaminasen, Albumin und die
10 Thrombozytenzahl. Es wurden zwei verschiedene Cut-offs etabliert: bei einem NFS < -1,455 sollte eine fortgeschrittene Leberfibrose ausgeschlossen und ein NFS > 0,676 hinweisend für das Vorliegen einer fortgeschrittenen Leberfibrose sein.31 In dieser Arbeit verwendeten wir oben genannten Score zur Risikostratifikation von NAFLD-Patienten (n = 101). Die Patienten
wurden entsprechend dem NFS in drei verschiedene Gruppen unterteilt: niedriges (NFS
< -1,455), undefinierbares (NFS -1,455 bis 0,676) und hohes Risiko (NFS > 0,676) für eine fortgeschrittene Fibrose.8, 31, 39
Beurteilung der Lebersteifigkeit mittels transienter Elastographie. Bei 64 Patienten mit NAFLD wurde die Lebersteifigkeit mittels transienter Elastographie (FibroScan®; EchoSens, Paris, France) erhoben. Bei 63 dieser Patienten konnte der NFS berechnet werden. Die Messungen erfolgten durch einen erfahrenen Untersucher wie beschrieben.49 Das Ergebnis der Messung wurde in kPa angegeben und repräsentiert den Median von mindestens zehn Messungen mit einer Erfolgsrate von > 60%.
Für Lebersteifigkeitsmessungen bei NAFLD-Patienten werden zwei Cut-offs vorgeschlagen:
ein niedriger Cut-off von 7,9 kPa, um das Vorliegen einer fortgeschrittenen Fibrose auszuschließen und ein hoher Cut-off von 9,6 kPa, um diese vorherzusagen.55 Zur Risikostratifikation unterteilten wir die NAFLD-Patienten unter Berücksichtigung der Leberelastizität in drei Gruppen: niedriges (TE < 7,9/7,2 kPa, ermittelt mittels M/XL-Sonde), intermediäres (TE von 7,9/7,2 bis 9,6/9,3 kPa; M/XL-Sonde) und hohes Risiko (TE > 9,6/9,3 kPa; M/XL-Sonde) für eine fortgeschrittene Fibrose (≥ F3).8, 39,55
Serumanalyse von Caspase-gespaltenem Keratin-18. Für die quantitative Messung von Caspase-gespaltenem K18 im Serum von NAFLD-Patienten verwendeten wir den M30- Apoptosense ELISA (PEVIVA, Bromma, Sweden) wie beschrieben.24, 29, 65 Die Analyse der Proben erfolgte in Doppelbestimmungen.
2.3 Statistische Analyse
Die statistische Analyse erfolgte mit GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) and SPSS 24 (IBM Corporation, Armonk, NY).
Mit Hilfe des Mann-Whitney-U-Test und dem unpaaren T-Test wurden die klinischen Charakteristika von Patienten mit einem NAS ≥ 4 und < 4 verglichen. Zur Ermittlung der
11 bestmöglichen Sensitivität versus Spezifität wurden Receiver Operating Characteristics (ROC)- Analysen durchgeführt und die entsprechenden Cut-off-Werte ermittelt. Die Ergebnisse wurden als Mittel ± Standardabweichung des Mittelwertes (SEM, standard error of the mean) angegeben. Ein p-Wert < 0,05 galt als signifikant.
12
3 Ergebnisse
3.1 Risikoabschätzung einer fortgeschrittenen NAFLD durch Kombination nicht- invasiver Methoden und einer Leberbiopsie
Die Leberbiopsie ist der Goldstandard zur Identifikation von NAFLD-Patienten mit erhöhtem Risiko für einen Krankheitsprogress. Dies sind Patienten mit gesicherter NASH und im Besonderen NASH-Patienten, die bereits eine Fibrose entwickelt haben. Um Leberbiopsien bei Patienten mit niedriger Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer fortgeschrittenen Erkrankung zu vermeiden, wird ein diagnostischer Algorithmus, der nicht-invasive Methoden wie die transiente Elastographie und/oder den NFS mit einer Leberbiopsie kombiniert, empfohlen.8, 39
Ziel eines solchen Algorithmus ist es nach nicht-invasiver Risikoeinschätzung nur Patienten mit unklarer oder hoher Wahrscheinlichkeit für eine fortgeschrittene Fibrose zu biopsieren und somit die Anzahl erforderlicher Leberbiopsien zu reduzieren.8, 39, 67 Nachdem bildmorphologisch eine Leberverfettung festgestellt und andere Ursachen einer Verfettung ausgeschlossen wurden, wird als erster diagnostischer Schritt des Algorithmus die Bestimmung des NFS empfohlen (Abb. 1). 8, 39 Bei einem NFS < -1,455 (n = 74 in unserer Kohorte) wird ein niedriges Risiko für eine fortgeschrittene Erkrankung postuliert und eine nicht-invasive Verlaufskontrolle des Krankheitsprogresses empfohlen. Bei einem NFS zwischen -1,455 und 0,676 (n = 25 in unserer Kohorte) liegt ein undefinierbares Risiko für eine fortgeschrittene NAFLD vor und es wird eine Bestimmung der transienten Elastographie mittels FibroScan empfohlen. Ist eine weitere Risikostratifikation mittels FibroScan nicht möglich (TE 7,9/7,2 - 9,6/9,3 kPa, ermittelt mit der M/XL-Sonde), so wird eine Leberbiopsie empfohlen. Im Falle eines NFS > 0,676 und/oder einer TE > 9,6/9,3 kPa (n = 22 in unserer Kohorte) ist von einer fortgeschrittenen NAFLD auszugehen und es kann auf eine Leberbiopsie verzichtet werden (Abb. 1).
14
3.2 Die Detektion von Caspase-gespaltenem Keratin-18 ermöglicht die Identifikation von NALFD-Patienten mit NASH trotz niedrigem NFS
In der vorliegenden Studie haben wir evaluiert, inwiefern die Messung von K18-Spiegeln mittels M30-ELISA im Serum die Risikostratifikation bei NAFLD-Patienten verbessern kann.
Frühere Studien haben gezeigt, dass ein K18-Spiegel von > 200 U/L ein geeigneter Cut-off zur Detektion einer fortgeschrittenen Lebererkrankung ist.24, 27, 29 Unter Berücksichtigung dieses Cut-offs haben wir Serum-M30-Spiegel von Patienten mit einem NFS < -1,455, der eine fortgeschrittene Fibrose mit hoher Wahrscheinlichkeit ausschließen sollte, bestimmt.31
Überraschenderweise konnten wir bei der Mehrheit (64%) der Patienten mit einem NFS < -1,455 (47/74) erhöhte M30-Spiegel (M30 > 200 U/L) messen, wohingegen nur 36%
der Patienten (27/74) einen M30-Spiegel ≤ 200 U/L hatten (Abb. 2A). Darüber hinaus konnte bei Patienten mit einem NFS < -1,455, die erhöhte M30-Spiegel (M30 > 200 U/L) aufwiesen, in 70% der Fälle histologisch eine NASH nachgewiesen werden (33/47; Abb. 2B). 58% dieser Patienten (19/33) hatten bereits eine Fibrose entwickelt (F1 = 14; F2 = 4; F3 = 1), wohingegen 42% keine Fibrose hatten (Abb. 2C). Umgekehrt hatte ein Großteil der Patienten (67%) mit einem NFS < -1,455 und M30-Spiegeln ≤ 200 U/L keine NASH (18/27; Abb. 2D). Die meisten falsch negativen Patienten hatten keine Fibrose (6/9; 67%; Abb. 2E).
17 Zusammengefasst konnte bei 74% (48/65) der Patienten mit niedrigem oder undefinierbarem NFS und erhöhtem M30-Spiegel eine NASH detektiert werden. Bei diesen Patienten wäre eine Leberbiopsie nicht in Erwägung gezogen worden. Im Gegensatz dazu wären 26% (17/65) der Patienten mit einem NAS < 4 unter Berücksichtigung des M30-basierten diagnostischen Algorithmus biopsiert worden. Bei den meisten der „falsch positiven“ Patienten (14/17) konnte eine Inflammation von 1 im NAS dokumentiert werden.
3.4 Die M30-Bestimmung bei NAFLD-Patienten mit geringer Lebersteifigkeit ermöglicht die Identifikation von Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung
Die Bestimmung der Lebersteifigkeit mittels transienter Elastographie ist eine weit verbreitete Methode zur Beurteilung des Fibroseprogresses bei Lebererkrankungen und wird auch im diagnostischen Algorithmus zur Abschätzung des Fibrosestadiums bei NAFLD berücksichtigt.8, 39, 66
Durch transiente Elastographie bestimmte Werte unterhalb des Cut-offs von 7,9 kPa (M-Sonde) oder 7,2 kPa (XL-Sonde) schließen mit hoher Genauigkeit fortgeschrittene Fibrosestadien aus.55 Wir haben nun evaluiert, ob die Kombination aus transienter Elastographie und M30 die diagnostische Wertigkeit für die Detektion einer fortgeschrittenen NAFLD verbessert. Ähnlich wie bei unseren Patienten mit niedrigem NFS konnten wir erhöhte M30-Spiegel bei einem signifikanten Anteil von Patienten (55%) mit niedriger TE messen (21/38). Ein geringerer Anteil (45%) zeigte normwertige M30-Spiegel (Abb. 4A). In Übereinstimmung mit unseren Daten bei Patienten mit niedrigem NFS zeigte die Mehrheit (71%) der Patienten mit niedriger TE, aber erhöhtem M30 eine NASH mit einem NAS ≥ 4 (15/21; Abb. 4B) und 47% (7/15) hatten bereits eine Fibrose (F1 = 5, F2 = 2 (Abb. 4C)). Entsprechend dem diagnostischen Algorithmus in Abbildung 1 evaluierten wir den zusätzlichen Nutzen einer M30-Bestimmung bei Patienten mit undefinierbarem NFS und niedriger TE, die nicht für eine Leberbiopsie berücksichtigt werden würden. 50% dieser Patienten (3/6) hatten erhöhte M30-Spiegel und bei allen lag eine NASH vor (Daten nicht abgebildet). Bei M30-Spiegeln ≤ 200 U/L zeigte die Mehrheit (76%) der NAFLD-Patienten mit niedriger TE (13/17) keine NASH (Fig. 4D). 75%
(3/4) der NASH-Patienten mit M30-Spiegeln ≤ 200 U/L hatten keine Fibrose (Abb. 4E).
19
3.5 Evaluation der diagnostischen Wertigkeit von Caspase-gespaltenem Keratin-18 bei NAFLD-Patienten mit intermediärer oder erhöhter
Lebersteifigkeit
In einem weiteren Schritt haben wir die diagnostische Genauigkeit von M30-Spiegeln bei Patienten mit intermediärer Lebersteifigkeit, also bei einer transienten Elastographie zwischen 7,9-9,6 kPa (M-Sonde) und 7,2-9,3 kPa (XL-Sonde) untersucht. Wir konnten zeigen, dass 60%
der Patienten (3/5) mit intermediärer Lebersteifigkeit erhöhte M30-Spiegel hatten (> 200 U/L;
Abb. 5A) und alle davon (3/3) eine NASH aufwiesen (Abb. 5B). Dabei hatte bereits ein Patient eine F2-Fibrose entwickelt (Abb. 5C). Ähnlich wie in unserer Beobachtung von Patienten mit undefinierbarem NFS verbessert die Messung von Caspase-gespaltenem K18 bei Patienten mit intermediärer Lebersteifigkeit die Risikostratifikation von NAFLD-Patienten.
Patienten mit erhöhter Lebersteifigkeit, das heißt > 9,6 kPa (M-Sonde) oder > 9,3 kPa (XL- Sonde) zeigten erhöhte M30-Spiegel in 90% der Fälle (19/21; Abb. 5D) und 84% von ihnen (16/19) hatten eine NASH (Abb. 5E). Die Mehrheit (75%) der Patienten mit hoher Lebersteifigkeit und erhöhten M30-Spiegeln (12/16) hatte bereits eine Fibrose entwickelt (Abb.
5F).
Eine NASH konnte bei 75% (18/24) der NAFLD-Patienten mit niedriger oder intermediärer transienter Elastographie und erhöhten M30-Spiegeln nachgewiesen werden. Bei NAFLD- Patienten mit niedriger transienter Elastographie würde eine Leberbiopsie normalerweise nicht erwogen werden. In dieser Situation scheint die Bestimmung des M30-Biomarkers, der in rund 70% der Fälle bei Patienten mit NASH und niedriger TE erhöht nachweisbar war, von diagnostischer Relevanz. Umgekehrt würden 29% (6/21) der Patienten mit einem NAS < 4 und niedriger TE aber erhöhten K18-Spiegeln unnötig biopsiert werden. Allerdings wiesen alle diese Patienten im NAS eine Inflammation von mindestens 1 auf.
21
4 Diskussion
Die NAFLD ist die häufigste Lebererkrankung mit einer weltweiten Prävalenz von ~ 25%.14, 43 10-20% der NAFLD-Patienten haben eine NASH. Diese ist mit einer Leberfibrose und ihren Komplikationen assoziiert. Studien, die den natürlichen Krankheitsverlauf beobachtet haben, haben gezeigt, dass die Fibrose der wichtigste Faktor nicht nur für die Leber-assoziierte, sondern auch für die Gesamtmortalität bei NAFLD ist.4, 5, 7 Die Identifikation von NAFLD-Patienten, die eine NASH und möglicherweise bereits eine Fibrose entwickelt haben, ist deshalb äußerst wichtig. Zur Diagnosesicherung und Beurteilung der Krankheitsaktivität sowie des Fibrosestadiums ist die Leberbiopsie der Goldstandard. Sie ist jedoch mit Kosten und Aufwand eines stationären Aufenthalts, sowie mit möglichen Komplikationen verbunden und kann mit einem „sampling error“ einhergehen. Zudem ist es unrealistisch bei 25% der Gesamtbevölkerung eine Leberbiopsie vorzunehmen. Deshalb sind neue Überwachungsstrategien für NAFLD-Patienten erforderlich, welche nicht-invasiv die Beurteilung des Vorliegens einer fortgeschrittenen Erkrankung, das heißt einer NASH und eventuellen Fibrose, ermöglichen. Der NAFLD Fibrosis Score wurde als erster diagnostischer Schritt vorgeschlagen, um Patienten ohne erhöhtes Risiko für eine fortgeschrittene Erkrankung zu identifizieren.8, 39 Laut diesem Algorithmus können Patienten mit einem NFS < -1,455 bezüglich einer Krankheitsprogression nicht-invasiv überwacht werden.
In der vorliegenden Studie berücksichtigten wir bei diesem diagnostischen Algorithmus die serologische Bestimmung von Caspase-gespaltenem K18 (M30-Spiegel) und fanden heraus, dass mehr als 50% der NAFLD-Patienten mit niedrigem NFS erhöhte M30-Spiegel hatten.
Darüber hinaus zeigten 70% dieser Patienten histologisch eine NASH. Umgekehrt hatten mehr als 60% der Patienten mit niedrigem NFS und nicht erhöhtem M30 keine NASH und die Mehrheit der falsch negativen Patienten hatte histologisch keine Fibrose. Die Patienten mit erhöhtem M30 trotz niedrigem NFS und einem NAS < 4 (falsch positive Patienten) zeigten in der Mehrzahl der Fälle histologisch eine Inflammation. Es gibt zunehmende Evidenz, dass sich eine NAFL mit leichter Inflammation zu einer fortgeschrittenen Erkrankung entwickeln kann, wenn auch in einem geringeren Maße als bei einer NASH.67, 69 Deshalb kann auch die Identifikation dieser Patienten von diagnostischer Relevanz sein. Bei Patienten mit undefinierbarem NFS jedoch erhöhtem M30-Spiegel hatten 80% eine NASH und 80% letzterer hatten bereits eine Fibrose entwickelt.
22 Wir erhielten ähnliche Ergebnisse, wenn anstelle des NFS die transiente Elastographie mittels FibroScan berücksichtigt wurde. Bei mehr als 50% der Patienten mit niedriger TE konnten erhöhte M30-Spiegel gemessen werden und rund 70% dieser Patienten hatten eine NASH.
47% letzterer Patienten hatten bereits eine Fibrose entwickelt. Umgekehrt wies die Mehrheit der Patienten mit niedriger transienter Elastographie und nicht erhöhten M30-Spiegeln keine NASH auf und die meisten Patienten mit NASH zeigten bei dieser Konstellation histologisch keine Fibrose. Insgesamt konnte mit erhöhten M30-Spiegeln eine NASH bei 74% der Patienten mit niedrigem oder undefinierbarem NFS und bei 75% der Patienten mit niedriger oder intermediärer transienter Elastographie vorhergesagt werden. Bei der Mehrzahl dieser Patienten wäre keine Leberbiopsie durchgeführt worden. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass der NFS für die Vorhersage einer fortgeschrittenen Fibrose nicht so gut geeignet ist und mit einer hohen Rate falsch negativer Befunde einhergeht.43, 57 Somit verbessert die zusätzliche Bestimmung von M30 bei niedrigem oder undefinierbarem NFS und/oder bei niedriger oder intermediärer transienter Elastographie die Identifikation von Patienten mit fortgeschrittener NAFLD.
K18 korreliert mit den histologischen Charakteristika einer NASH, das heißt mit dem histologisch bestimmten NAS (NAFLD Activity Score) und den Einzelkomponenten, wie insbesondere mit der lobulären Inflammation und dem hepatozellulärem Ballooning,33, 35-37 welche beide mit dem Progress einer NAFLD assoziiert sind.67, 69 Klinische Studien haben
gezeigt, dass M30-Spiegel bei Patienten mit histologischem Ansprechen auf eine NASH-Therapie im Vergleich zu Non-Respondern signifikant abfallen.68 Weitere Studien mit
gepaarten Biopsien haben gezeigt, dass M30-Spiegel mit Verbesserung des NAS abfallen und mit Verschlechterung des NAS ansteigen.36, 64
NAFLD-Aktivitätsmarker wie Inflammation und Ballooning sind mit einer Fibroseentwicklung und einem Fibroseprogress assoziiert.67, 69 Eine Inflammation triggert die Hepatozytenapoptose und diese begünstigt wiederum die Fibrogenese.70, 71 Die Aufnahme von apoptotischen Zellen durch hepatische Sternzellen stimuliert ihre fibrogenetische Aktivität, wohingegen eine Verminderung der Hepatozytenapoptose die Fibrogenese reduzierte, wie in einem experimentellen Fibrosemodell gezeigt werden konnte.20, 72, 73 Es finden sich zunehmend Hinweise darauf, dass M30-Spiegel mit der Leberfibrose bei chronischen Lebererkrankungen einschließlich der NAFLD korrelieren.29, 35, 74, 75 In unserer Kohorte hatte ein signifikanter Anteil der NASH-Patienten mit erhöhten M30-Spiegeln bei niedrigem bzw. undefinierbarem
23 NFS oder niedriger bzw. intermediärer transienter Elastographie bereits eine Fibrose entwickelt. Somit scheint die Bestimmung von M30 bei dieser Konstellation von zusätzlichem diagnostischem Nutzen zu sein, um nicht nur die Patienten mit NASH, sondern auch solche, die bereits eine Fibrose entwickelt haben und mittels NFS oder TE nicht detektiert wurden, zu identifizieren.
Obwohl der NFS und die TE etablierte Methoden sind, um eine fortgeschrittene Fibrose abzuklären, sind sie weniger gut geeignet für die Detektion von niedrigen Fibrosestadien.31, 55 Bis zu 58% der Patienten haben einen undefinierbaren NFS. Zudem zeigen andere Modelle eine bessere diagnostische Performance zur Detektion einer NASH und fortgeschrittenen Fibrose
bei NAFLD-Patienten mit Diabetes.34, 76 In unserer Kohorte, welche überwiegend NAFLD-Patienten ohne Diabetes mellitus erfasste, konnten wir eine gute diagnostische
Performance des M30-Biomarkers zur Detektion einer NASH demonstrieren.
Interessanterweise konnte eine ähnlich gute diagnostische Performance zur Vorhersage einer NASH bei NALFD-Patienten mit niedrigem NFS oder niedriger TE gezeigt werden. Im Vergleich zur ALT wurde für den M30-Biomarker eine höhere diagnostische Performance für den Nachweis einer NASH bei NAFLD-Patienten mit niedrigem NFS oder niedriger TE erzielt.
Dies stimmte auch mit der publizierten Beobachtung überein, dass der M30 im Vergleich zur ALT eine höhere diagnostische Genauigkeit für den Nachweis einer NASH bei NAFLD aufweist.33
Die Anwendung unseres modifizierten Algorithmus identifizierte rund 70% der NASH-Patienten in unserer NAFLD-Kohorte mit niedrigem NFS oder niedriger TE. Die
Berücksichtigung von M30 im diagnostischen Algorithmus zur Detektion einer NASH bei Patienten mit vermuteter NAFLD könnte deshalb hilfreich sein bei der Entscheidung, welche Patienten eine Leberbiopsie erhalten und zur weiterführenden Beurteilung bei einem Hepatologen vorstellig werden sollten. Weitere Kohortenstudien, welche die Rolle von Caspase-gespaltenem K18 in Kombination mit nicht-invasiven Verfahren zur Risikostratifikation bei NAFLD-Patienten untersuchen, sind erforderlich, um die erzielten Ergebnisse zu validieren.
24
5 Zusammenfassung
Die nicht-alkoholische Steatohepatitis (NASH) und das Ausmaß einer Leberfibrose spielen eine wichtige Rolle für die langfristige Prognose von Patienten mit nicht-alkoholischer Fettlebererkrankung (NAFLD). Somit ist es wichtig, Patienten mit einem erhöhten Risiko für eine NASH oder eine Fibrose zu identifizieren und ihre Versorgung bzw. Überwachung zu optimieren. Der NAFLD Fibrosis Score (NFS) und die transiente Elastographie (TE) wurden als erster diagnostischer Schritt zum Ausschluss einer fortgeschrittenen Leberfibrose vorgeschlagen. Um Patienten mit NASH und frühen Fibrosestadien zu identifizieren ist jedoch weiterhin eine Leberbiopsie erforderlich. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit einer verbesserten nicht-invasiven Risikostratifikation bei NAFLD. Da die Hepatozytenapoptose in der Pathogenese der NASH eine wichtige Rolle spielt, untersuchten wir den Nutzen des Apoptosemarkers M30, einem Antigen, das bei der Caspase-vermittelten Spaltung von Keratin-18 gebildet wird. Bei insgesamt 102 Patienten mit histologisch gesicherter NAFLD wurden Serum M30-Spiegel mittels ELISA ermittelt und mit dem NFS und/oder der TE kombiniert. Die Mehrheit (64%) der Patienten mit einem niedrigem NFS unterhalb des Cut- offs von -1,455 zeigte erhöhte M30-Spiegel (> 200 U/L) und 70% dieser Patienten hatten eine NASH. Mehr als 50% letzterer Patienten hatten histologisch bereits eine Fibrose entwickelt.
Umgekehrt wies die Mehrheit der Patienten mit einem NFS < -1,455 und nicht erhöhtem M30 histologisch keine NASH auf. Eine NASH wurde bei 83% der Patienten mit undefinierbarem NFS (-1,455 bis 0,676) und erhöhten M30-Spiegeln detektiert. Bei 80% dieser Patienten lag bereits eine Fibrose vor. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn anstelle des NFS die transiente Elastographie mit einem Cut-off < 7,9 (M-Sonde) oder < 7,2 kPa (XL-Sonde) verwendet wurde.
Die Kombination des Apoptosemarkers M30 mit dem NFS oder der TE ermöglicht somit die Identifikation von Patienten mit einem erhöhten Risiko für eine fortgeschrittene NAFLD und verbessert damit die Risikostratifizierung dieser Patienten.
25
6 Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung Bedeutung
ALT Alaninaminotransferase AST Aspartataminotransferase AUC Area under the curve BMI Body Mass Index CK Cytokeratin
ELF-Test Enhanced liver fibrosis-Test
ELISA Enzmye-linked immunosorbent assay FIB4-Score Fibrosis 4 Score
HCC hepatozelluläres Karzinom IF Intermediärfilament kPa Kilopascal
n Stichprobengröße NAFL Non-alcoholic fatty liver
NAFLD Non-alcoholic fatty liver disease NAS NAFLD Activity Score
NASH Non-alcoholic steatohepatitis NFS NAFLD Fibrosis Score NPV negativer prädiktiver Wert p-Wert Signifikanzwert
ROC Receiver operating characteristics SEM Standard error of the mean TE Transiente Elastographie
26 TNF-α Tumornekrosefaktor-α
U/L Units/Liter
VLDL Very Low Density Lipoprotein
27
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34
I Lebenslauf
Neele Stöckmann
Geburtsdatum: 10.11.1987 Geburtsort: Göttingen Ausbildung
Juni 2006 Abitur am Georg-Forster-Gymnasium in Berlin-Lichtenberg
08/2006 - 07/2007 Freiwilliges Soziales Jahr in der Camphill Community Mourne Grange (Nordirland, Arbeit mit geistig behinderten Erwachsenen)
10/2007 - 12/2013 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum 09/2009 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
09/2009 - 05/2010 Studium an der Université François Rabelais de Tours (Frankreich), Teilnahme am Erasmusprogramm
08/2012 - 06/2013 Praktisches Jahr:
08/2012 - 10/2012 Chirurgie im St. Josef-Hospital Bochum
10/2012 - 12/2012 Chirurgie im Royal Hallamshire/Northern General Hospital in Sheffield (England)
12/2012 - 03/2013 Innere Medizin im Spital Emmental in Burgdorf (Schweiz) 04/2013 - 06/2013 Anästhesie im Marienhospital Herne
12/2013 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Berufstätigkeit
seit 02/2014 Assistenzärztin in der Klinik für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Hannover, Dezember 2019
35
II Erklärung nach §2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7 der Promotionsordnung
Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion eingereichte Dissertation mit dem Titel
Neuer diagnostischer Algorithmus zur Beurteilung der Krankheitsaktivität bei NAFLD
in der Klinik für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie unter Betreuung von Frau Professor Heike Bantel mit der Unterstützung von Mitarbeiterinnen der Arbeitsgruppe Frau Stephanie Liebig und Frau Franziska Wandrer ohne sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Die Gelegenheit zum vorliegenden Promotionsverfahren ist mir nicht kommerziell vermittelt worden. Insbesondere habe ich keine Organisation eingeschaltet, die gegen Entgelt Betreuerinnen und Betreuer für die Anfertigung von Dissertationen sucht oder die mir obliegenden Pflichten hinsichtlich der Prüfungsleistungen für mich ganz oder teilweise erledigt.
Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur Promotion eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel bisher noch nicht erworben habe.
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III Danksagung
Mein Dank gilt insbesondere meiner Doktormutter Frau Professor Heike Bantel für die Bereitstellung des Themas und die gute Betreuung, die sich durch interessante Diskussionen, Geduld und eine sehr verlässliche Kommunikation während der Erstellung der Arbeit auszeichnete. Den Mitarbeiterinnen aus der Arbeitsgruppe von Frau Professor Bantel, Stephanie Liebig und Franziska Wandrer, danke ich für ihre Hilfsbereitschaft und Unterstützung bei Fragen zur Datendokumentation und statistischen Auswertung.
Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern Fritz und Vera Stöckmann für ihre selbstlose Unterstützung und ein immer offenes Ohr auf meinem bisherigen Lebensweg.
Weiter danke ich meinen Freunden Stefan Surhoff, Susanne Krusche und Golnar Rath, allesamt Mediziner, die mich an den Erfahrungen bei der Erstellung ihrer Promotion teilhaben lassen und mich moralisch unterstützt haben. Abschließend danke ich meiner ersten Arbeitskollegin auf Station, Martha Kirstein, die mich mit Geduld in die stationäre Patientenversorgung eingeführt hat und durch die der Kontakt für die Promotion erst zustande gekommen ist.
37
IV Veröffentlichung
Diese Promotionsarbeit bildete die Grundlage einer multizentrischen Validierungsstudie, die im August 2019 online veröffentlicht wurde:
Liebig S, Stoeckmann N, Geier A, Rau M, Schattenberg JM, Bahr MJ, et al. Multicenter Validation Study of a Diagnostic Algorithm to Detect NASH and Fibrosis in NAFLD Patients With Low NAFLD Fibrosis Score or Liver Stiffness. Clin Transl Gastroenterol.
2019;10:e00066
