3. Material und Methoden
3.7 Leberuntersuchungen
3.7.1 Probenentnahme
Nach der Gewinnung der Blutproben wurde an dem weiter in Narkose verbliebenen Versuchstier eine mediane Laparotomie vorgenommen. Es erfolgte eine Mobilisation der Leber durch Lösen der Leberbänder. Der linke laterale Leberlappen wurde entnommen. Das Versuchstier wurde anschließend mit einer Überdosis CO2 euthanasiert. Die gewonnene Leberprobe wurde mittels einer scharfen Klinge für die jeweilig geplanten Untersuchungsmethoden (Histologie, rt-qPCR) in unterschiedlich große Blöcke geschnitten.
3.7.2 Probenaufbereitung
Für die lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden zwei, ca. 0,5 x 0,5 cm große Blöcke zugeteilt. Anschließend wurden die Proben nach einem standardisiertem Schema aufbereitet:
Sie wurden für 24 Stunden in einer 4 %igen Paraform-Lösung (0,1 m PBS gepuffert, pH = 7,4) fixiert. Im Folgenden wurde das Fixiermittel eine Stunde lang mit 0,1 m PBS, pH = 7,4 ausgewaschen, und es erfolgte eine Dehydratation in einer ansteigenden Alkoholreihe (50%, 70%, 90%, 96%, 100%). Im Anschluss wurden die Proben für 24-72 Stunden zur Verdrängung des Restalkohols in Zedernholzöl und dann für 24 Stunden in einem Zedernholzöl-Paraffin-Gemisch bei 48°C gelagert. Danach erfolgte für 24 Stunden die Infiltration von reinem Paraffin bei 58 °C und jeweils dreimal 24 Stunden mit einem Paraffin-DMSO-Gemisch bei 58 °C. Die Proben wurden in einer Kassettenform platziert, in Paraffin ausgegossen und auf Raumtemperatur abgekühlt. Es wurden Schnitte von 8 – 10 µm an einem Rotationsmikrotom (Fa. Reichert und Jung) hergestellt und auf Eiweiß-Glycerin beschichtete Objektträger aufgezogen. Abschließend wurden die lichtmikroskopischen Färbungen durchgeführt.
Hämatoxylin-Eosin-Färbung nach Mayer
Charakteristisch für diese Färbung sind blaue Kerne bei rosa gefärbtem Plasma. Die Schnitte
MATERIAL UND METHODEN
Aqua dest. rehydriert. Danach wurden die Objektträger für 10 min in das Hämatoxylin eingestellt und dann 30 min gewässert. Sie wurden für 1-2 min mit Eosin gefärbt, differenziert und anschließend durch eine aufsteigende Alkoholreihe dehydriert. Die Objektträger wurden 1 x 10 min in Karboxylol und 2 x 10 min in Xylol eingestellt. Zum Abschluss wurde die Probe mit Depex (Fa. Serva) eingedeckt.
Azan-Färbung nach Heidenhain
Die Schnitte wurden entparaffiniert und rehydriert (siehe H.E.-Färbung) und in Azocarmin bei 60 ° C für 10 min eingestellt. Die Differenzierung erfolgt mit Anilinöl-Alkohol, die Beizung in 4 x 10 min 5 % Phosphorwolframsäure und anschließend 1 x 10 min Wässerung mit Aqua dest. Die Bindegewebsfärbung wird in Anilinblau-Orange G durchgeführt (1 x 10 min). Danach wurde in einer aufsteigenden Alkoholreihe entfärbt und dehydriert. Die Objektträger wurden 1 x 10 min in Karboxylol und 2 x 10 min in Xylol eingestellt. Zum Abschluss wurde die Probe mit Depex (Fa. Serva) eingedeckt.
Ölrot-Färbung
Für die Ölrot-Färbung wurden Leberbiopsien in der Größe von 0,5 x 0,5 cm zuerst mit Tissue-Tek (Fa. Sakura Finetek Europe) auf ein Korkplättchen aufgebracht und anschließend in Flüssigstickstoff eingefroren. Die Lagerung bis zur Aufarbeitung erfolgte bei -80° C.
Zur Färbung wurden 6-8 µm dicke Kryoschnitte an einem Kryomikrotom (Fa. Mikrom, Typ HM 505 E) hergestellt. Die Schnitte wurden mit H2O2 für 2 min ausgewaschen und anschließend in 60 %igem Isopropylalkohol für 5 min überführt. Gefärbt wird mit verdünnter, frisch filtrierter Ölrotlösung für 10 min. Danach erfolgt das Auswaschen mit Aqua dest. für 2 min. Die Kernfärbung erfolgt mit Hämatoxylin nach Meyer für 5 min. Dann werden die Schnitte in fließendem Wasser für 10 min gebläut. Zum Abschluss werden die Präparate mit Glycerin-Gelatine nach Kaiser bei 40°C eingeschlossen. Ergebnis dieser spezifischen Färbung sind rot gefärbte Lipide und blaue Kerne.
Ölrot-Stammlösung: 0,5 g ad 100 ml 99% Isopropylalkohol Gebrauchslösung: 6 Teile Stammlösung + 4 Teile Aqua dest.,
24 h stehen lassen, filtrieren (Lösung ist einen Tag haltbar)
MATERIAL UND METHODEN
Die histologischen Präparate wurden mittels eines Scores (mod. nach KLEINER 2005) ausgewertet (Tab. 7).
Tab. 7 : Histologiescore (mod. nach KLEINER et al. 2005).
Item Definition Score
Steatose
Perisinusoidal oder periportal Mild, Zone 3, perisinusoidal Moderat, Zone 3, perisinusoidal Portal/periportal
Perisinusoidal und portal/periportal Bridging Fibrosis
MATERIAL UND METHODEN
Elektronenmikroskopie
Für die Transelektronenmikroskopie wurden vier bis sechs Stücke der entnommenen Leberbiopsie von ca. 0,3 x 0,3 mm zugeschnitten und in 2,5 % Glutardialdehyd, 0,1 m PBS, pH 7,2 für 24 Stunden fixiert. Danach erfolgte 3 x 30 min das Auswaschen des Fixiermittels mit 0,1 m PBS, pH 7,2. Die Proben wurden 1 h mit 2 % Osmiumtetroxid in 0,1 m PBS, pH 7,2 behandelt und mittels aufsteigender Alkoholreihe jeweils 3 x 30 min dehydriert. Für 2 h wurde Propylenoxid als Intermedium und dann für 24 h Propylenoxid-Glycidether-Gemisch im Verhältnis 1:1 zugefügt. Anschließend wurden die Proben für 24 h in reinem Glycidether bei RT aufbewahrt. Danach erfolgte die Einbettung und Polymerisation in Glycidether für 24 h bei 60 °C. Es wurden Semidünnschnitte (1 µm) an einem Ultramikrotom (Fa. Leica) hergestellt und diese mit 1 % Toluidinblau zur Übersicht gefärbt. Im Anschluß erfolgte die Auswahl und das Antrimmen der Region für die Ultradünnschnitte (70 nm). Die Schnitte wurden auf Kupfernetze (200 Mesh) aufgefangen und mit Uranylacetat und Bleicitrat kontrastiert. Die transelektronenmikroskopische Untersuchung (Philips CM 10) erfolgte mit einer Beschleunigungsspannung von 60 kV.
Molekularbiologie
Für die molekularbiologischen Untersuchungen wurden Leberbiopsien (ca. 0,5 x 0,5 cm) in NUNC-Röhrchen (Fassungsvermögen 2 ml; Fa. NUNC, Langenselbold) zuerst in Flüssigstickstoff eingefroren und dann bei -80° C bis zur Weiterverarbeitung gelagert.
Zur RNA-Isolation wurden die im folgenden beschriebenen Schritte durchgeführt, wobei die Bezeichnungen der verwendeten Puffer „RLT“,„RPE“ und „RN“ Eigennamen der produzierenden Firma sind und nicht als Abkürzung gesehen werden können.
Zum gefrorenen Leberstück in einem Kryoröhrchen wurde 700 µl RLT-β-Mercaptoethanol (Verdünnung: 1 Teil Mercaptoethanol und 100 Teile RLT) gegeben und dann mit einem Stabhomogenisator so lange homogenisiert, bis keine groben Partikel mehr sichtbar waren.
350 µl dieses Homogenisats wurden in 1,5 ml-Eppendorf-Gefäße (Fa. Eppendorf, Hamburg) überführt und 350 µl RLT-β-Mercaptoethanol dazugegeben. Danach wurde diese Probe bei 8000 rpm für 30 sec zentrifugiert (Centrifuge 5417R, Fa. Eppendorf). 350 µl von dem
MATERIAL UND METHODEN
Überstand wurden in ein neues 1,5 ml-Eppendorf-Gefäß überführt und 350 µl 70 % RNase-freies Ethanol hinzugegeben. 700 µl dieser Probe wurden danach in ein RNeasy Mini Spin Röhrchen/Collection Tube (Fa. Qiagen) gegeben und bei 8000 g für 15 sec zentrifugiert. Der Inhalt des Röhrchens wurde im Anschluss verworfen und das Röhrchen wieder verwendet.
Dann wurden 700 µl vom Puffer RW1 in das RNeasy Mini Spin Röhrchen pipettiert und bei 8000 rpm für 15 sec zentrifugiert. Wie im Schritt zuvor wurde dasselbe Collection Tube verwendet und der Inhalt verworfen.
Es wurden 350 µl RW1 zugeben und 15 sec bei 8000 rpm zentrifugiert. Der Durchfluss und das Collection Tube wurden verworfen und das Collection Tube ersetzt. Dann wurden 500 µl Puffer RPE zugegeben und bei 8000 rpm für 15 sec zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen, das Collection Tube aufbewahrt und 500 µl RPE-Puffer zugegeben. Um die Membran zu trocknen, wurde für 2 min bei 8000 rpm zentrifugiert. Das RNeasy Mini Spin Röhrchen wurde in ein 1,5 ml RNase-freies Eppendorf-Gefäß gesetzt. 30 µl RNase-freies Wasser wurde auf die Membran gegeben und die Membran vollständig benetzt. Anschließend wurde 1 min bei 8000 rpm zentrifugiert. Danach wurden wiederum 30 µl RNase-freies Wasser auf die Membran gegeben, diese vollständig benetzt und dann 1 min bei 8000 rpm zentrifugiert. Die RNA wurde sofort auf Eis gestellt. Die Konzentration der RNA wurde mittels Absorptionsphotometrie (bei 260 nm) bestimmt.
Zur Herstellung der cDNA (Reverse Transkription) wurden folgende Schritte durchgeführt.
Verwendet wurde das Kit „Superscript II“ der Fa. Invitrogen.
Zuerst wurden pro Probe 2 µl 10xRT-Puffer, 4 µl 25mM MgCl2, 2 µl 0,1M DTT und 1 µl RNase out Inhibitor zu einem Mix zusammen pipettiert und auf Eis gelagert.
Danach erfolgte die Aufbereitung der RNA. Dazu wurde 1µg RNA in die entsprechende Menge H2O pipettiert, so dass ein Gesamtvolumen vom 8 µl entstand. Dann wurde 1 µl 10 mM dNTP Mix und 1 µl Oligo dt hinzugegeben, so dass das Gesamtvolumen des RNA-Mix 10 µl betrug. Die nachfolgenden Schritte erfolgten im Thermocycler (T3, Fa. Biometra).
Zuerst wurde der RNA Mix bei 65 ° C für 5 min erwärmt. Danach wurden zu den 10 µl RNA Mix 9 µl des zuerst erstellten Mix hinzu gegeben und bei 42 °C für 2 min erwärmt. Im Anschluss wurden 1 µl der reversen Transkriptase Superskript II zugefügt und erwärmt (50
MATERIAL UND METHODEN
Für die q-PCR wurden auf einer 384-Well-Platte (Fa. Applied Biosystems, USA) pro Well 6 µl MasterMix (Fa. Eurogentec, Belgien) mit 4 µl cDNA (1:30 verdünnt mit H2O) und 2 µl des entsprechenden Primers (Fa. TIB Molbiol, Berlin) aufgetragen. Die Primer für die PCR (Tab.
8) wurden hergestellt gemäß Primer 3 Express Software (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MD, USA). Die Primer waren so lokalisiert, dass Exon-Intron-Grenzen der Gene in einer PCR-Amplicon von 90-120 bp resultieren. Die Optimierung der PCR wurde für jedes Gen-spezifisches Primerpaar mittles Ethidiumbromid-gefärbtem Agarosegel durchgeführt, um die Spezifität des Produktes zu bestätigen. Als negative Kontrollen wurde RNA statt cDNA aufgetragen, für die positive Kontrolle wurde jeweils eine cDNA verwendet, die in einer vorherigen q-PCR untersucht wurde. Diese cDNA diente als interner Standard und wurde in allen Versuchen mitgeführt.
Das Programm für die q-PCR wurde mittels der Software Abi Prism 7000 SDS Version 2.1 (Fa. Applied Bioscience) festgelegt und auch die darauf folgende Rohdatenauswertung erfolgt ebenfalls mit dieser Software.
Die Durchführung der q-PCR erfolgte mittels eines ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) unter Verwendung eines dreistufigen Programms (2 min bei 50°C, 10 min bei 95°C, 40 Zyklen von 14 s bei 95°C, 1 min bei 60°C).
Die gemessenen cycle threshold-Werte (ct-Werte) geben die Anzahl der Zyklen an, bei der das Fluoreszenzsignal einen Standard-Grenzwert überschritt. Der von einem einzelnen Primer produzierte ct-Wert wurde auf die Expression des Haushaltsgens HPRT normiert (Δct-Methode) und zwischen den einzelnen Gruppen ausgewertet (ΔΔct-(Δct-Methode).
MATERIAL UND METHODEN
Tab. 8: Sequenzen und GenBank accession numbers der Primer.
Gene Name Accession
Number Primer (forward/reverse) Gruppe 1: Referenzgene
HPRT hypoxanthine guanine
phosphoribosyl transferase NM012583 AAAGGACCTCTCGAAGTGTTGG AAGGGCATATCCAACAACAAAC Gruppe 2: Angiogenese
Tie2 endothelial-specific receptor
tyrosine kinase 2 XM342863 AGGTCGAGTTCGAGGACAGG CCTGTCCACGGTCATAGTTAG VEGFA vascular endothelial growth
factor A NM031836 CAGTTCGAGGAAAGGGAAAGG
CAAATGCTTTCTCCGCTCTG FLT-1 FMS-like tyrosine kinase 1 NM019306 CAAAGCTCTGATGACCGAACTC
TCCACGATCACCATCAGAGG FLK-1 kinase insert domain protein
receptor NM013062 GAGCCCTCATGTCCGAACTC
AGTCTTTCCCAGAGCGGAAG
Ang1 Angiopoietin-1 NM053546 GCACAAAGGACGCTGATAACG
TAGATTGGAAGGGCCACAGG Gruppe 3: Zytokine/Wachstumsfaktoren
HGF hepatocyte growth factor NM017017 GTCAGCACCATCAAGGCAAG TGAGTGGGCCACCATAATCTC PDGFB platelet-derived growth factor B Z14117 CTGCTGCAATAACCGCAATG
TGGCTTCTTTCTCACAATTTCG PDGFBR platelet derived growth factor B
receptor NM031525 CAAGCCTGATGCTGCTGATG
GTCGCAGGAGATGGTGGAAG SCF stem cell growth factor NM001012459 AGGTCCGTTCTGAGCAGGAG GCCTGTGTCTCGAAGTCTCG Gruppe 4: Extrazelluläre Matrix
SMA smooth muscle alpha-actin X06801 CCGTGACATCAAGGAGAAGC GCCCATCAGGCAGTTCGTAG TIMP1 tissue inhibitor of
metalloproteinase 1 BC099821 CCTGGTTCCCTGGCATAATC TTGCAAGGGATGGCTGAAC ICAM intercellular adhesion molecule-1 BC081837 TTAGCTCCCGTGGGAGTATCAC
CCGCAATGATCAGTACCAACAC VCAM1 vascular cell adhesion molecule 1 NM012889 CCGGCATTTATGTATGTGAAGG TGACGCTCTTAGATGGGAAGAC Gruppe 5: Steatose/Fibrose
MATERIAL UND METHODEN
Lepr leptin receptor NM_012596 TGGATGGACTAGGGTATTGGAG
TCCAGAATTCAGGCCCTCTC PPARa peroxisome proliferator activated
receptor alpha NM013196 ATGCCCTCGAACTGGATGAC
CCCTCCTGCAACTTCTCAATG PPARg peroxisome proliferator-activated
receptor gamma AF156665 TCAGAAGTGCCTTGCTGTGG
ATCTCCGCCAACAGCTTCTC
HOX-1 heme oxygenase NM012580 AGAGGCTAAGACCGCCTTCC
AGGCCTCTGGCGAAGAAAC Gruppe 6: Fettmetabolismus
GK Glucokinase M25807 ATCACTGTGGGCGTGGATG
TGATTTCGCAGTTGGGTGTC G6P glucose-6-phosphatase NM013098 GTGGCAGTGGTTGGAGACTG
GTCCAGGACCCACCAATACG SREBP-1c sterol regulatory element-binding
protein-1c AF286470 AGAAGGCCAGTGGGTACCTG
TGCGGGCCACAAGAAGTAG Gruppe 7: Zellzyklus
CycD3 Cyclin D3 NM 012766 CCAGCACTCCCACAGATGTC
CCCTCGGGCTTCAGATATGG P21 cyclin-dependent kinase inhibitor
P21 U24174 CTTGCACTCTGGTGTCTCACG
ATCGGCGCTTGGAGTGATAG
MATERIAL UND METHODEN