3. Material und Methoden
3.6 Blutuntersuchungen
Zur Blutentnahme wurden die Tiere in Narkose gelegt. Zur Bestimmung der Narkosetiefe wurde die Tiefensensibilität der Ratte mittels Zwischenzehenreflex geprüft. Bei einem negativen Zwischenzehenreflex wurde das Tier seitlich gelagert, der Hals zur Stauung der Venen ein wenig komprimiert, die Augenlider zwischen Daumen und Zeigefinger des Probennehmers aufgespannt und am nasalen Augenwinkel eine Hämatokritkapillare (4 µl NH4-Heparin-End-zu-End-Kapillare, Fa. Sarstedt, Nümbrecht) mit drehend-schiebenden Bewegungen unter Schonung des Bulbus bis zum retrobulbären Venengeflecht vorgeschoben.
Das Blut wurde in einem mit Lithium-Heparin-beschichteten Microtainer (Fa. Becton Dickinson Microtainer Brand Tube, Franklin Lakes, USA) aufgefangen. Insgesamt wurden 3 ml Blut entnommen. Anschließend wurde die Probe innerhalb von zwei Minuten nach Entnahme in einer Zentrifuge (Centrifuge 5417 R, Fa. Eppendorf, Hamburg) bei 3000 rpm und einer Temperatur von 4 ° C für zehn Minuten zentrifugiert.
3.6.1 Plasma
Das Plasma wurde nach der Zentrifugation in Eppendorf-Gefäße mit einem Fassungsvermögen von 2 ml (Fa. Eppendorf, Hamburg) abpipettiert. 0,5 ml der Probe wurde innerhalb von einer Minute bezüglich der biochemischen Parameter im Labor untersucht. Die restliche Probe wurde innerhalb von fünf Minuten nach Zentrifugation in 200 μl-Aliquots aufgeteilt, in Eppendorf-Gefäße abgefüllt und für weitere Untersuchungen (ELISA) bei -80°
C asserviert.
Klinische Chemie
Die Bestimmung der Parameter der klinischen Chemie erfolgte im Vitros 250-Automaten der Fa. Ortho-Clinical Diagnostics (Neckargemünd) bei 37° C.
Es wurden folgende Parameter bestimmt: Kalium, Bilirubin, Alkalische Phosphatase, ALT, AST, PCHE, Lipase, Albumin, HDL, LDL, Triglyceride, Cholesterin (Tab. 6).
MATERIAL UND METHODEN
Tab. 6 : Reaktionsprinzipien der unterschiedlichen Parameter in der klinischen Chemie Parameter Reaktionsprinzip
Albumin • Albumin + Bromcresolgrün (BCG) → BCG-Albumin-Komplex
• 37 °C, 630 nm
• Aspartat + α-Ketoglutarat (+ AST, P-5-P) → Oxalacetat + Glutamat
• Oxalacetat (+ Oxalacetat-Decarboxylase) → Pyruvat + CO2
• Pyruvat + Phosphat + O2 (+ Pyruvatoxidase) → H2O2 + Acetylphosphat
• Wasserstoffperoxid + Leukofarbstoff (+ Peroxidase) → Farbstoff
• 37 °C, 670 nm
Gesamt-Bilirubin • Gesamt-Bilirubin (+ Dyphyllin) → Azobilirubin-Chromophoren
• 37 °C, 540 und 460 nm Kalium • direkte Potentiometrie
Lipase
• 1-Oleoyl-diacetylglycerin (+ Lipase, Cholinlipase, pH 8) → 2,3-Diaceytlglycerin + Ölsäure
• 2,3-Diaceytlglycerin (+ Diacetinase) → Glycerin + Ölsäure
• Glycerin + ATP (+ Glycerinkinase, MgCl2) → L-α-Glycerophosphatoxidase + ADP
• L-α-Glycerophosphatoxidase + O2 (+L-α-Glycerophosphatoxidase) → Dihydroxiacetonphosphat + H2O2
• H2O2 + Leukofarbstoff (+ Peroxidase) → Farbstoff + 2 H2O
• 37 °C, 540 nm
High Density Lipoprotein (HDL)
• Lipoproteine hoher Dichte (+ TX100) → Cholesterin + Cholesterinester+
Proteine
• Cholesterinester + H2O (+ Cholesterinesterhydrolase) → Cholesterin + Fettsäuren
• Cholesterin + O2 (+ Cholesterinoxidase) → Cholest-4-en-3-on + H2O2
•
MATERIAL UND METHODEN
Low Density Lipoprotein (LDL)
• LDL-Cholesterinester + H2O (+ Detergenz, Cholinesterase) → Cholesterin + freie Fettsäuren
• LDL-Cholesterin + O2 (+ Cholesterinoxidase) → Δ4-Cholestenon + H2O2
• 2 H2O2 + 4-Aminoantipyrin (+ Peroxidase) → Violettblaues Pigment + 5 H2O
• 37 °C, 585 nm
Triglyzeride
• Lipoproteine (+ Tensid) → Triglyzeride + Proteine
• Triglyzeride + H2O (+ Lipase) → Glyzerin + Fettsäuren
• Glyzerin + ATP (+ Glyzerinkinase, MgCl2 → L-α-Glyzerophosphat + ADP
• L-α-Glyzerophosphat + O2 (+ L-α-Glyzerinphosphatoxidase) → Dihydroxyacetonphosphat + H2O2
• H2O2 + Leukofarbstoff (+ Peroxidase) → Farbstoff + 2 H2O
• 37 °C, 540 nm
Pseudocholin-esterase (PCHE)
• Butyrylthiocholin + H2O (+ PCHE) → Thiocholin + Butyrat
• 2 Thiocholin + 2 Kaliumferricyanid → Dithiobis(cholin) + 2 Kaliumferrocyanid
• 37 °C, 400 nm
Cholesterin
• Lipoprotein (+ TX100) → Cholesterin +Cholesterinester + Proteine
• Cholesterinester + H2O (+ Cholesterinesterhydrolase) → Cholesterin + Fettsäuren
• Cholesterin + O2 (+ Cholesterinoxidase) → Cholest-4-en-3-on + H2O2
• H2O2 + Leukofarbstoff (+ Peroxidase) → Farbstoff + 2 H2O
• 37 °C, 540 nm
Enzyme linked immunosorbent assay (ADN und Leptin)
Mittels enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) wurden die Parameter Leptin, Adiponektin untersucht. Als Probenmaterial wurden hierfür die bei -80°C gelagerten Plasmaaliquots herangezogen.
Zur Leptinbestimmung diente ein mouse Leptin-ELISA-Test-Kit (Fa. R&D, Katalognummer:
DY 498, Minneapolis, USA). Im ersten Schritt wurden die entsprechenden Stoffe rekonstituiert und in die benötigte Arbeitskonzentration überführt. Der erste Antikörper (Capture Antibody, goat anti mouse Leptin) wurde mit 1 ml PBS rekonstituiert. Daraus resultierte eine Konzentration von 360 µg/ml. Diese Lösung wurde mit PBS zu einer
MATERIAL UND METHODEN
Arbeitskonzentration von 2 µg/ml verdünnt. Der zweite Antikörper (Detection Antibody, bionylated goat anti mouse Leptin) wurde in 1 ml Reagent Diluent (0,05 % Tween® 20 in PBS) gelöst. Die entstandene Lösung enthielt eine Konzentration von 36 µg/ml und wurde in einem zweiten Schritt mit Reagent Diluent zu einer Arbeitskonzentration von 200 ng/ml verdünnt. Die Rekonstitution des Standards erfolgt mit 0,5 ml Reagent Diluent. Damit erhielt man eine Lösung mit 95 ng/ml. Die benötigte Konzentration von 8000 pg/ml wurde mit Reagent Diluent hergestellt und im Anschluss eine zweifache Serienverdünnung mit Reagent Diluent durchgeführt, die zu einer Konzentrationsreihe von 8000, 4000, 2000, 1000, 500, 250 pg/ml führte. Danach erfolgte die Plattenpräparation. Dazu wurden 100 µl des 1. Antikörpers auf die 96-Well-Platte (MaxiSorp, Fa. NUNC) aufgetragen und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Am darauf folgenden Tag wurden alle Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht. Die Mikroplatte wurde mit Waschpuffer dreimal gewaschen und dann mit einer Blocklösung (Fetales Kälberserum 5 %, verdünnt mit PBS) 60 min bei Raumtemperatur geblockt. Nach dem erneuten Waschvorgang wurden pro Well 100 µl Standardlösung, die 1:
3 mit PBS verdünnte Probe oder PBS als Negativkontrolle aufgetragen und für 120 min inkubiert. Nach dem Waschen der Platte wurden pro Well 100 µl vom zweiten Antikörper zugefügt und 120 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Platte erneut gewaschen wie oben beschrieben und mit 100 µl Streptavidin-HRP (strepavidin conjugated with horseradish-peroxidase) für 20 min beschichtet. Die Platte wurde gewaschen und 100 µl Substrat-Lösung (H2O2:Tetramethylbenzidine = 1:1) für 20 min hinzugegeben. Die Farbreaktion wurde dann mit 50 µl Säure (2 N H2SO4) unterbrochen und die Platte direkt im Mikroplatten-Lesegerät (Sunrise, Fa. Tecan Austria) bei 450 nm ausgelesen.
Zur Auswertung wurde mittels der Standardverdünnungsreihe eine Standardkurve erstellt und so die Stoffmenge in den einzelnen Proben bestimmt.
Die Bestimmung der Adiponektinkonzentration wurde mit einem ELISA-Kit (AssayMax Human Adiponektin (Acrp30), Katalog-Nr. EA 2500-1, Fa. Assay Pro St. Charles, USA) durchgeführt. Für die ELISA-Durchführung wurden die nötigen Verdünnungen und Rekonstitutionen durchgeführt. Das zehnfach konzentrierte MIX Diluent Konzentrat (gepufferte Proteinbase) wurde mit reagent grade water in die einfache Arbeitskonzentration
MATERIAL UND METHODEN
1:10 gemischt, um den benötigten einfach konzentrierten Waschpuffer zu erhalten. Die nötige Verdünnung des Streptavidin-Peroxidase-Konjugates betrug 1:100 und wurde mit MIX Diluent durchgeführt. Zur Erstellung der Standardlösung wurden 50 ng des Adiponektin-Standards mit 1 ml des einfach konzentrierten MIX Diluents rekonstituiert. Damit enthielt die Standardlösung 50 ng Adiponektin pro ml. Daraus wurde eine Standardverdünnungsreihe angelegt. Der Antikörper wurde im Verhältnis 1:150 mit MIX Diluent zur erforderlichen Arbeitskonzentration verdünnt.
Alle Reagenzien wurden vor Versuchsbeginn auf Raumtemperatur gebracht. Die Proben wurden aufgetaut und 1:150 mit dem MIX Diluent verdünnt. Anschließend wurden die Proben, die Standardverdünnungsreihe mit den Konzentrationen 50, 25, 12,5, 6,25 und 3,125 ng/ml und PBS als Negativkontrolle auf die Mikroplatte mit 96 Wells aufgebracht (50 µl pro Well) und für 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde die Platte viermal mit Wasch-Puffer gewaschen. Im Anschluss wurden vom Adiponektin-Antikörper 50 µl pro Well auf die Mikroplatte aufgetragen und wiederum für 60 min inkubiert. Nach erneutem viermaligem Waschen mit Waschpuffer wurden 50 µl Streptavidin-Peroxidase-Konjugat pro Well hinzugefügt und für 30 min inkubiert. Wiederum wurde viermal mit Waschpuffer gewaschen. Danach wurde 50 µl Chromogen-Substrat (stabilized peroxidase chromogen substrate tetramethylbenzidine) und 8 min später die Stopsäure (0,5 N hydoxychloric acid) hinzugegeben, um die Farbreaktion zu unterbrechen. Die Platte wurde direkt im Anschluss in ein Mikroplatten-Lesegerät (Sunrise, Fa. Tecan Austria) verbracht und die Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm ausgelesen.
Zur Auswertung wurde mittels der Standardverdünnungsreihe eine Standardkurve erstellt und so die Stoffmenge in den einzelnen Proben bestimmt.
Sowohl bei dem ADN- als auch bei dem Leptinnachweis wurden Doppelwerte bestimmt.
Innerhalb eines Geschlechts wurden alle Proben auf einer Platte aufgetragen und gleichzeitig bestimmt. Es wurden ebenfalls zwei Messungen der Absorption durchgeführt, um die Messwerte zu bestätigen.
MATERIAL UND METHODEN