Nachweis von Brucella sp

3.2.5.1 PCR

Zum Nachweis von Brucella sp. wurden Primer und eine DNA-Sonde der Fa.

TIB^® MOLBIOL verwendet, die eine Sequenz des 16S rRNA-Gens hybridisieren. Das Primerpaar amplifiziert ein Fragment von 207 bp. Die Untersuchungen wurden im LightCycler^® 2.0 durchgeführt.

Für den folgenden PCR-Ansatz wurde der LightMix^® zur Ermittlung von Brucella sp.

in Kombination mit dem LightCycler^® FastStart DNA Master Hybridization Probes Tab. 7 verwendet. Pro Ansatz (15 µl) wurden die folgenden Lösungen in beschriebener Reihenfolge pipettiert:

Tab. 7: Mastermix-Ansatz für Brucella sp. im LightCycler

Reagenzien µl/Probe*

Enzym-Mix (FastStart) 2

Primermix Brucellen 4,0

Primermix IPC 4,0

MgCl₂ 2,4

Mol. biol. H2O 2,6

*Konzentration im Kit nicht bekannt

Der Mastermix wurde gemischt und kurz anzentrifugiert. Pro Ansatz wurden 15 µl je LightCycler^®-Kapillare eingesetzt. Anschließend wurden 5 µl DNA-Extrakt der jeweiligen Probe hinzugefügt. Für diese PCR wurde derselbe DNA-Extrakt wie für den Nachweis von F. tularensis verwendet. Der Positivkontrolle der PCR wurden 5 µl der Standardreihe der Fa. TIB^® MOLBIOL in der Verdünnung von 10² bzw. 10³ Zielmoleküle zugesetzt. Als Negativkontrolle wurden 5 µl Wasser anstatt des DNA-Extraktes hinzugefügt. Der Primermix IPC (Internal Positive Control) diente hier als interne Kontrolle um eine Inhibition der PCR auszuschließen.

Für die Durchführung der PCR galten folgende Amplifikationsbedingungen:

• Aktivierung der

Polymerase 95°C 10 min

• Denaturierung 95°C 10 sec

• Annealing 55°C 8 sec 45 Zyklen

• Synthese 72°C 15 sec

• Schmelzkurve 95°C 20 sec

• Schmelzkurve 40°C 20 sec

• Schmelzkurve auf 85°C in 0,2°C Schritten

• Kühlen 40°C 30 sec

Ermittlung der Nachweisgrenze; (LightCycler^®)

Zur Ermittlung der Nachweisgrenze wurde eine Standardreihe der Fa. TIB^® MOLBIOL mit Konzentrationen von 10¹ - 10⁶ Kopien verwendet.

3.2.5.2 Sequenzierung von PCR-Produkten

Die Sequenzierung diente der Ermittlung der Basensequenz eines PCR-Produktes.

Die Sequenzierungsreaktion wurde als so genanntes „Cycle-Sequencing“ unter Verwendung des ABI PRISM^® 310 Genetic Analyzer durchgeführt. Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde als Template in die Sequenzierungsreaktion eingesetzt. Der Ansatz wurde mit spezifischen Primern, HotStarTaq^®DNA Polymerase, dNTP´s und Fluoreszenzfarbstoff-markierten didesoxyNTP´s versetzt. Es wurde wiederholt die Template-DNA denaturiert, der Sequenzierprimer angelagert und dNTP´s eingebaut.

Durch den Einsatz von dNTP´s und, entsprechend den vier Basen, mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten didesoxyNTP´s kommt es bei der Synthese nach dem Zufallsprinzip zu Strangabbrüchen. Sobald sich an ein dNTP ein Fluoreszenzfarbstoff-markiertes didesoxyNTP anschließt, wird die Polymerisation gestoppt und das Fragment bleibt in seiner erreichten Größe. Dadurch entstehen Fragmente unterschiedlicher Größen, die jeweils ein an einem Ende mit einem bestimmten Fluoreszenzfarbstoff markiertes Nukleotid tragen (S^EARS et al. 1992).

Das Reaktionsgemisch der Sequenzierungsreaktion wird ebenfalls aufgereinigt.

Anschließend werden die Reaktionsprodukte nach Größe in einer Kapillarsäule aufgetrennt. Die Zuordnung der Basen erfolgt über die Fluoreszenzfarbstoffe, die über einen Laser gescannt werden.

3.2.5.2.1 Aufreinigung der PCR-Produkte

Um eine Sequenzierung zur Ermittlung der Basensequenz durchführen zu können, müssen die Amplifikate aufgereinigt werden. Hierfür wird im Anschluss an die PCR das Produkt von Primern, dNTP’s und Salzen getrennt.

Die Amplifikationsprodukte wurden mit Hilfe des MinElute PCR Purification Kits aufgereinigt. Dafür wurden 75 µl PBI-Puffer (Binding-Buffer), mit 15 µl des

PCR-Reaktionsansatzes gemischt, auf die Säule gegeben und für 1 min bei 4.300 x g zentrifugiert. Dabei erfolgte die Adsorption der DNA-Fragmente an die Silica-Gel-Matrix der Säulen. Das Eluat wurde verworfen. Der sich anschließende Waschschritt wurde mit 750 µl PE-Puffer durchgeführt, um Verunreinigungen wie Salze, Enzyme, ungebundene Primer und freie Nukleotide, die nicht an die Silica-Matrix gebunden wurden, zu entfernen. Nach zweimaliger Zentrifugation für jeweils 1 min bei 4.300 x g wurde das Eluat erneut verworfen. Anschließend wurden 10 µl Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) auf die Säule gegeben und diese dann nochmals bei 4.300 x g für 1 min zentrifugiert. Das aufgereinigte Eluat wurde für die Sequenzierungsreaktion mit 90 µl mol. biol. Wasser verdünnt und die Konzentration der aufgereinigten PCR-Produkte photometrisch bestimmt. Anschließend konnte das Eluat für die DNA-Sequenzierung verwendet werden.

3.2.5.2.2 DNA-Sequenzierung

Die Sequenzierung wurde mit dem Big Dye^® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit durchgeführt. Zusätzlich wurde das Polymer POP-6 (Performance Optimized Polymer) und die „500 bp“ Kapillarsäule (47 cm x 50 µm) benutzt bzw. ausgewählt.

Abhängig von der Länge werden je 100 bp 1 ng PCR-Produkt eingesetzt (entspricht hier ca. 2 ng). Es wurden die Primern Bru F und Bruc-5 (Tab. 8) als „Hin-“ bzw.

„Rückprimer“ zur Sequenzierung des Amplifikationsproduktes verwendet.

Tab. 8: Sequenzierungsprimer

Bru F („Hinprimer“) 5`- GGC TCG GTT GCC AAT ATC AAT -3`

Bruc-5 („Rückprimer“) 5`- CGC GCT TGC CTT TCA GGT CTG -3`

Die Probe wurde jeweils mit dem Ansatz der Sequenzierungsreaktion mit „Hin-“ bzw.

„Rückprimer“ versetzt. Dementsprechend wurden pro Probe zwei Sequenzierungsreaktionen durchgeführt. Die Reagenzien wurden, wie in Tab. 9 aufgeführt, pipettiert:

Tab. 9: Ansatz der Sequenzierungsreaktion

Reagenzien µl/Probe Konzentration

Sequencing-Puffer 2 k.A.

Premix 4 k.A.

Primer 1 (“Hin-“) bzw.

Primer 2 („Rückprimer“)

0,5 5 pmol

PCR Produkt 100 bp / 1 ng

Mol. biol. H2O ad 20 µl

Ansatz: 6,5 Mix + jeweilige Produktmenge + ad 20 µl H2O (mol. biol.)

Für die DNA-Sequenzierung galten folgende Amplifikationsbedingungen:

• Aktivierung der

Polymerase 96°C 1 min

• Denaturierung 96°C 10 sec

• Annealing 60°C 5 sec 25 Zyklen

• Synthese 60°C 4 min

• Kühlung 10°C

Zur Verringerung der Hintergrundfluoreszenz wurden die Ansätze der Sequenzierungsreaktion im Anschluss mit Centri Sep-Säulen aufgereinigt. Dabei handelt es sich um eine Gelfiltration im Säulenformat, bei der die im Überschuss vorhandenen BigDye^® Terminatoren im Gel zurückgehalten werden, während sich die DNA-Fragmente im Durchfluss befinden.

Die Säulen wurden jeweils mit 750 µl Wasser mit HPLC-Qualität 30 min vorgequollen. Daraufhin wurde die Flüssigkeit abgelassen und 2 min bei 600 x g

zentrifugiert. Das Wasser wurde verworfen. Im Anschluss wurden jetzt 20 µl des Reaktionsansatzes zentral auf die Säule aufgegeben und nochmals 2 min bei 600 x g zentrifugiert. 4 µl des Eluats wurden mit 16 µl HPLC-Wasser verdünnt, das Probengefäß mit einem Gummistopfen versehen und anschließend in den ABI PRISM^® 310 Genetic Analyzer eingesetzt und der Sequenzierungslauf gestartet.

Die Datenanalyse der zwei Sequenzen aus „Hin-“ und „Rückprimer“ wurde mit Hilfe der Datenbank BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) im Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) (Datenstand: 07.05.08) durchgeführt.

Zur Charakterisierung bzw. Typisierung wurde die Probe an das FLI, Jena, gesandt.