Ermittlung der Nachweisgrenze von F. tularensis

Festlegung der Nachweisgrenze in Bakterienzellsuspension (Blockcycler) Als Nachweisgrenze wurde die Gesamtkeimzahl definiert, die bei der Auswertung der PCR mittels Agarosegelelektrophorese noch eine deutlich sichtbare Bande von 428 bp erzeugte. Vom Typstamm F. tularensis subsp. holarctica (ATCC 29684) wurde ausgehend von Mc-Farland 0,5 eine Verdünnungsreihe mit Konzentrationen von 15 bis 15 x 10⁷ Bakterien je ml angefertigt. Nach Extraktion der DNA, Amplifikation des entsprechenden Genomfragmentes mittels PCR und Darstellung in der Agarosegelelektrophorese konnten Amplikons bis zu einer Konzentration von 15 x 10³ Bakterien/ml in der Ausgangssuspension entsprechend rechnerisch 75 Bakterien pro PCR-Ansatz sicher nachgewiesen werden (Abb. 3).

Abb. 3: Festlegung der Nachweisgrenze von Francisella tularensis in Zellsuspension 1: 15x10⁷ Bakterien / ml 9: negative Extraktion-Kontrolle 17: 15x10² Bakterien / ml

2: 15x10⁶ Bakterien / ml 10: negative PCR-Kontrolle 18: 15x10¹ Bakterien / ml 3: 15x10⁵ Bakterien / ml 11: positive PCR-Kontrolle 19: 15x10⁰ Bakterien / ml 4: 15x10⁴ Bakterien / ml 12: 15x10⁷ Bakterien / ml 20: negative Extraktion- 5: 15x10³ Bakterien / ml 13: 15x10⁶ Bakterien / ml Kontrolle 6: 15x10² Bakterien / ml 14: 15x10⁵ Bakterien / ml 21: Größenstandard 7: 15x10¹ Bakterien / ml 15: 15x10⁴ Bakterien / ml

8: 15x10⁰ Bakterien / ml 16: 15x10³ Bakterien / ml

Festlegung der Nachweisgrenze in Gewebe (Blockcycler)

Nach Extraktion der Nukleinsäuren aus Geweben, welche mit jeweils 20 µl einer Bakteriensuspension in einer Konzentration von 15 bis 15 x 10⁷ Bakterien/ml versetzt wurden, konnte nach PCR, Auftrennung im Agarosegel und Färbung bis zu einer Konzentration von 15 x 10³ Bakterien/ml eine Bande sicher erkannt werden. Dies entspricht einer Konzentration von 300 Bakterien in 20 µl (75 Bakterien/PCR-Ansatz).

Die Ergebnisse sind in Abb. 4 dargestellt.

Abb. 4: Festlegung der Nachweisgrenze von Francisella tularensis in Gewebe 1: 15x10⁷ Bakterien / ml 9: 15x10⁷ Bakterien / ml 17: positive PCR- 2: 15x10⁶ Bakterien / ml 10: 15x10⁶ Bakterien / ml Kontrolle 3: 15x10⁵ Bakterien / ml 11: 15x10⁵ Bakterien / ml 18: negative PCR- 4: 15x10⁴ Bakterien / ml 12: 15x10⁴ Bakterien / ml Kontrolle 5: 15x10³ Bakterien / ml 13: 15x10³ Bakterien / ml 19: Größenstandard 6: 15x10² Bakterien / ml 14: 15x10² Bakterien / ml

7: 15x10¹ Bakterien / ml 15: 15x10¹ Bakterien / ml 8: negative Extraktionskontrolle 16: negative Extaktionskontrolle

In den weiteren Untersuchungen wurde zur Kontrolle der DNA-Extraktion Gewebe verwendet, dem jeweils 20 µl einer Bakteriensuspension mit einer Konzentration von

15 x 10⁴ Bakterien/ml, entsprechend einer Anzahl von 3000 Bakterien, zugesetzt wurden.

Nachweisgrenze der PCR im LightCycler^®

Zur Festlegung der Nachweisgrenze im LightCycler^® wurde auf die im Kit enthaltene Standardreihe zurückgegriffen. Hierbei handelte es sich um Konzentrationen von 10¹ bis 10⁶ Zielmolekülen. Die Verdünnungsstufen von 10⁶ bis 10² Zielmolekülen lassen ein Signal in den Zyklen 17, 21, 24, 27 und 30 erkennen. Ein positives Signal konnte bis zu der Konzentration von 10 Zielmolekülen (32. Zyklus) je PCR-Ansatz nachgewiesen werden (Abb. 5).

Abb. 5: Standardreihe zur Ermittlung der Nachweisgrenze von Francisellen im LightCycler^® 6: Std 10*6: 10⁶ Zielmoleküle / ml

7: Std 10*5: 10⁵ Zielmoleküle / ml 8: Std 10*4: 10⁴ Zielmoleküle / ml 9: Std 10*3: 10³ Zielmoleküle / ml 10: Std 10*2: 10² Zielmoleküle / ml 11: Std 10*1: 10 Zielmoleküle / ml

4.1.2 Ermittlung der Nachweisgrenze von Brucella sp.

Nachweisgrenze der PCR im LightCycler^®

Zur Ermittlung der Nachweisgrenze von Brucellen im LightCycler^® wurde die im Kit mitgelieferte Standardreihe, die 10¹ bis 10⁶ Kopien enthält, verwendet. Die Verdünnungsstufen von 10⁶ bis 10² Zielmolekülen lassen ein Signal in den Zyklen 17, 21, 24, 28 und 30 erkennen. Eine Reaktion konnte bis zu einer Konzentration von 10 Zielmolekülen nachgewiesen werden (Abb. 6). In dieser Verdünnungsstufe konnte eine Amplifikation ab dem 32. Zyklus festgestellt werden.

Abb. 6: Standardreihe zur Ermittlung der Nachweisgrenze von Brucellen im LightCycler^® 1: Standard 10E1: 10 Zielmoleküle/ Reaktion

2: Standard 10E2: 10² Zielmoleküle/ Reaktion 3: Standard 10E3: 10³ Zielmoleküle/ Reaktion 4: Standard 10E4: 10⁴ Zielmoleküle/ Reaktion 5: Standard 10E5: 10⁵ Zielmoleküle/ Reaktion 6: Standard 10E6: 10⁶ Zielmoleküle/ Reaktion

7: neg PCR: negative PCR-Kontrolle

8-12: negative Proben

13: neg Aufarb Hasenleber: negative Kontrolle der DNA-Extraktion

4.2 Nachweis von F. tularensis und Brucella sp. mittels PCR

4.2.1 Nachweis von F. tularensis

Bei insgesamt sieben der 930 Proben konnten F. tularensis-spezifische Genomfragmente sowohl im Blockcycler (Abb. 7) als auch im LightCycler^® nachgewiesen werden. Der Vollständigkeit halber soll hier der Nachweis F. tularensis-spezifischer DNA bei einem Wildkaninchen, welcher bei den Reihenuntersuchungen ebenfalls festgestellt wurde, angegeben werden.

Zur Differenzierung der Subspezies und weiteren Charakterisierung wurden die PCR-positiven Proben zum Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen, FLI, Jena, und zum Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr nach München gesandt. Bei allen Proben konnte der Nachweis von F. tularensis mittels PCR bestätigt werden.

Durch die Subspeziesdifferenzierung mittels 30 bp-Delections-PCR konnte bei drei der sieben Proben F. tularensis subsp. holarctica nachgewiesen werden. Aus zwei Proben konnte im Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr in München F. tularensis angezüchtet werden. Zur weiteren Differenzierung des Erregers wurde hier eine Resistenztestung gegenüber dem Antibiotikum Erythromycin durchgeführt (SPLETTSTOESSER et al. 2005). Eines der beiden F. tularensis-Isolate konnte aufgrund der Resistenz gegenüber Erythromycin dem Biovar 2 zugeordnet werden. Das andere Isolat erwies sich sensibel gegen Erythromycin und ist somit dem Biovar 1 zugehörig. Die übrigen Proben konnten nicht weiter differenziert werden.

Abb. 7: Nachweis Francisella tularensis-spezifischer DNA-Fragmente im Blockcycler 1: Mol 9358: positive Probe 7: Mol 3336 positive Probe

2: Mol 9359 negative Probe 8: negative Extraktionskontrolle 3: Mol 9497: positive Probe 9: positive Extraktionskontrolle 4: Mol 9498 positive Probe 10: negative PCR-Kontrolle 5: Mol 9499 negative Probe 11: positive PCR-Kontrolle

6: Mol 797 positive Probe 12: Größenstandard

Bei positiv getesteten Organproben wurden die DNA-Extraktionen und die PCR im Blockcycler sowie im LightCycler^® jeweils zweimal wiederholt. Die Reaktionen konnten bestätigt werden (Abb. 8 und Abb. 9).

Abb. 8: Bestätigungen der Reaktionen im LightCycler^®

1-8, 10: Verschiedene Proben, die nach der Amplifikation keine Francisella tularensis-spezifische DNA-Fragmente aufwiesen.

9: (9498): positive Probe (Mol 9498) 11: (9358): positive Probe (Mol 9358) 12: pos PCR: positive PCR-Kontrolle 13: neg Auf: negative Extraktions-Kontrolle 14: neg PCR: negative PCR-Kontrolle

Eine positive Extraktions-Kontrolle wurde bei den Wiederholungen aufgrund der bekannten, positiven Proben nicht mitgeführt.

Abb. 9: Bestätigungen der Reaktionen im LightCycler^® 1: 9360: negative Probe (Mol 9360)

2: 9497: positive Probe (Mol 9497) 3: 9498: positive Probe (Mol 9498) 4: 9499: negative Probe (Mol 9499)

5: posPCR 10*3: positive PCR-Kontrolle (entsprechend 10³ Bakterien) 6: negPCR: negative PCR-Kontrolle

Graphisch sind die Fundorte in (Abb. 10) dargestellt.

4.2.1.1 Prävalenzratio

Von 930 untersuchten Hasen konnte siebenmal F. tularensis-spezifische DNA nachgewiesen werden. Der 95 %-Vertrauensbereich für die erwartete Prävalenz von 0,75 % liegt zwischen 0,30 % und 1,54 %.

Die positiven Befunde traten sowohl in der Gruppe der Fallwildhasen als auch in der Gruppe der erlegten Hasen auf. Beim Fallwild konnte viermal F. tularensis-spezifische DNA nachgewiesen werden. Dreimal gelang dieser Nachweis bei den erlegten Hasen.

Abb. 10: Fundorte mit positiven Tularämie- und Brucellosenachweisen

4.2.2 Nachweis von Brucella sp.

Es wurden 927 Lebergewebeproben sowie 3 Milzgewebeproben auf Brucellen untersucht. Bei einem Tier konnten mittels der Genus-spezifischen PCR entsprechende Genomfragmente von Brucellen im LightCycler^® nachgewiesen werden (Abb. 11). Es folgte eine zweimalige erneute DNA-Extraktion und PCR-Untersuchung der positiv getesteten Organprobe. Das Ergebnis war reproduzierbar.

Bei den Proben der übrigen Tiere verlief die PCR-Untersuchung negativ. Der Fundort der positiven Probe ist in Abb. 10 dargestellt.

Die positive PCR-Kontrolle wurde mit einer Konzentration von 10³ Zielmolekülen in der PCR eingesetzt. Ab dem 28. Zyklus zeigte sich das Signal der positiven PCR-Kontrolle, wohingegen sich das Signal bei der positiven Probe bereits ab dem 23. Zyklus darstellte.

Abb. 11: Nachweis Brucella-spezifischer DNA-Fragmente im LightCycler^®

1-20, 22-30: Die Proben wiesen nach der Amplifikation keine Brucella-spezifischen DNA-Fragmente auf.

21: (1567): positive Probe/Reaktion (TB 633, W 6922/07, Mol 1567) 31: pos PCR 10*3: positive PCR-Kontrolle (entsprechend 10³ Zielmoleküle) 32: neg PCR: negative PCR-Kontrolle

4.2.2.1 Prävalenzratio

Von 930 untersuchten Hasen konnte ein Nachweis Brucella-spezifischer DNA erbracht werden. Der 95 %-Vertrauensbereich für die erwartete Prävalenz von 0,11 % liegt zwischen 0,003 % und 0,6 %.

Der positive Befund trat in der Gruppe der Fallwildhasen auf, d.h. jagdlich erlegte Hasen waren frei von erregerspezifischer DNA. Wird die Prävalenzratio nur für die Gruppe des Fallwildes berechnet, ergibt sich ein Erwartungswert von 0,4 % sowie das 95 %-Konfidenzintervall zwischen 0,01 % und 2,21 %.