2 Material und Methoden
2.7 Methode der Literaturrecherche
PubMed (www.pubmed.com) wurde für einen Großteil der Literaturrecherche für die vorliegende Dissertation genutzt. Ferner wurden Herstellerangaben verschiedener zur Anwendung gekommener Substanzen herangezogen. Des Weiteren wurden veterinärmedizinische und humanmedizinische Fachbücher verwendet.
59 3 Ergebnisse und Datenerhebung
3.1 Gewinnung mesenchymaler Stammzellen
Aus dem Knochenmark männlicher Schweine wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation mononukleäre Zellen purifiziert und gewonnen. Die Zellen wurden in Zellkulturflaschen mit einer Grundfläche von 75 cm2 über mehrere Passagen kultiviert.
Je Spendertier konnten mit den unter Punkt 2.2.1 und 2 beschriebenen Methoden bis zu 10 ml Knochenmarklysat aspiriert und für die Aufreinigung gewonnen werden. Nach durchlaufen der Dichtegradientenzentrifugation wurden die Zellen in der Neubauer-Zählkammer ausgezählt. Es wurden je Spendertier für die Passage P0 bis zu 5 Kulturflaschen mit einer Grundfläche von 75 cm2 mit je 1x106 Zellen für die Kultivierung beimpft.
3.2 Charakterisierung der Zellen
Im Anschluss an die Aufreinigung und Kultivierung der Zellen wurden diese unter Beurteilung der Zellmorphologie, mittels Differenzierungsassay und durch Messung spezifischer Oberflächenantigene in der FACS-Analyse, charakterisiert.
3.2.1 Zellmorphologie
Es konnte in Kultur nativ die Morphologie als Parameter zur Zellcharakterisierung herangezogen werden. Die vorliegenden Zellen zeigten hierbei die in der Literatur als zellspezifisch für mesenchymale Stammzellen genannten Eigenschaften.
Die Zellen waren adherent an Kunststoff und wuchsen einschichtig. Die mikroskopische Begutachtung der in Kultur befindlichen Zellen wurde in zwei bis dreitägigem Abstand durchgeführt. Die Zellen zeigten in Kultur, wie auf der folgenden Abbildung 16 lichtmikroskopischen zu erkennen, die für mesenchymale Stammzellen typische spindelförmige Morphologie und wuchsen in fischzugartiger Anordnung.
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Abbildung 16: Zellkultur Schwein MSC 100fach vergrößert, Passage 3, normale Zellmorphologie, fischzugartige Anordnung der Zellen nebeneinander
Bei der Ablösung der Zellen aus der Kulturflasche mit Trypsin zeigten die Zellen sich typischerweise kugelförmig und konnten somit während der Zellzählung nicht hinsichtlich ihrer charakteristischen Spindelform beurteilt werden. Etwa zwei Stunden nach Ausbringen in eine neue Kulturflasche hafteten einige Zellen schon fest am Flaschenboden an und nahmen wieder ihre ursprüngliche Form an.
Kam es im Rahmen der Kultivierung zu einer Veränderung der Zellmorphologie, so musste von einer spontanen Differenzierung der Zellen ausgegangen werden. Zellen, die sich wie auf den folgenden Bildern gezeigt darstellten, hatten eine untypische Morphologie und wurden umgehend verworfen.
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Abbildung 17 + Abbildung 18: links massenhaft Makrophagen; rechts stark veränderte Zellmorphologie, Fädenziehen der Zellleiber
Eine Veränderung der Zellmorphologie (Abbildungen 17 und 18) entstand vor allem, wenn die Zellen Stress erfuhren. Dies konnte zum Beispiel durch Trypsinieren, Aussähen in zu geringer oder zu großer Zellzahl in die Kulturflasche, empfindliche Temperaturschwankungen, falsches Medium, falsche Mediumzusammensetzung oder dergleichen, hervorgerufen worden sein. Haben Zellen Stress erfahren, so wurde ihnen eine Erholungsphase von einer Woche eingeräumt, innerhalb der sie in vielen Fällen zu ihrer typischen Morphologie zurückkehrten, geschah dies nicht, wurden die Zellen verworfen.
3.2.2 Differenzierungsassay
Mittels Differenzierung in chondrogene, adipogene und osteogene Zellen wurde bewiesen, dass die vorliegenden, aus Knochenmark gewonnenen und über mehrere Passagen gezüchteten Zellen multipotent sind, was eine elementare Eigenschaft der mesenchymalen Stammzellen darstellt.
Die Zellen wurden in definierter Anzahl in Kultur gebracht und über mehrere Wochen, unter Nutzung von spezifischen Differenzierungsmedien, bei regelmäßigem Mediumwechsel in 72-stündigem Abstand im Hypoxieschrank kultiviert. Für jede Differenzierung wurde ein eigens auf die letztendlich erwünschten Zellen abgestimmtes Medium verwendet, diese Medien beinhalten Zytokine und Wachstumsfaktoren.
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Zur Begutachtung der Ergebnisse kamen hier verschiedene histologische Färbungen zum Einsatz. Die Färbemethode ist nach dem jeweils vorliegenden Zelltyp gewählt worden, sowohl die Positivprobe als auch die Negativkontrolle der unterschiedlichen Differenzierungsgruppen wurden mit der gleichen Methode gefärbt und im Anschluss lichtmikroskopisch bei 100-facher Vergrößerung begutachtet. Eine kurze Beschreibung der histologischen Methode zur Zellfärbung ist im Abschnitt Material und Methoden unter Punkt 2.2.4.2 zu finden.
3.2.2.1 Chondrogen differenzierte Zellen
Abbildung 19 + Abbildung 20: Chondrogene Zelldifferenzierung ,die Zellen wurden mit Alcian-blau gefärbt
Hier ist in der Positivprobe (Abbildung 19) eine Darstellung chondrogener Zellen durch die Alcian-blau-Färbung deutlich erkennbar, während in der Negativkontrolle (Abbildung 20) keine hellblau angefärbten rundlich erscheinenden Zellen sichtbar sind. Die Morphologie unterscheidet sich deutlich von der Ursprungsform.
63 3.2.2.2 Adipogen differenzierte Zellen
Abbildung 21 + Abbildung 22: Adipogene Zelldifferenzierung, die Zellen sind mit Ölrot O und Hämatoxilin gefärbt
Deutlich ist besonders in der vergleichenden Betrachtung mit der Negativkontrolle (Abbildung 21), die Rotfärbung der Lipidvakuolen in den Zellleiben in der Positivkontrolle (abbildung 22) erkennbar. Die Adipozyten haben eine eher kugelförmige Morphologie und zeigen Vakuolenbildung.
3.2.2.3 Osteogen differenzierte Zellen
Abbildung 23 + Abbildung 24: Osteogene Zelldifferenzierung, die Zellen sind nach van Kossa gefärbt
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In den gezeigten Bildern ist in der Positivprobe (Abbildung 23) eine Schwarzfärbung der Zellen leicht ersichtlich, während sich in der Negativkontrolle (Abbildung 24) lediglich in kleinen Artefakten das Silbernitrat der Färbung nach van Kossa anlagern konnte.
Mittels Differenzierungsassay wurde die Multipotenz der im Versuch befindlichen Zellen bewiesen.
3.2.3 FACS-Analyse
Die dritte im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführte Methode zur Charakterisierung der mesenchymalen Stammzellen ist die FACS-Analyse.
In der FACS Analyse zeigten sich die untersuchten Zellen negativ für haematopoetische Marker wie CD14 und CD45 und positiv für die Marker MHC I, CD90 und CD105.
Abbildung 25: Wolkendiagramm der gemessenen Zellpopulation mit Gate um die Population von Interesse
Aus dem oben gezeigten Bild (Abbildung 25) wird ersichtlich, dass es sich bei den in der FACS-Analyse untersuchten Zellen um eine Zellpopulation handelt. Dies zeigt, dass die Dichtegradientenzentrifugation und die nachfolgende Zellkultivierung mit einer sukzessiven Abnahme von Blutzellvorgängern und anderer Zellpopulationen erfolgreich waren. Es liegt also eine einzige Zellpopulation und keine Zellmischpopulation vor.
In den nachfolgenden Histogrammen ist die Isotypkontrolle grün dargestellt, der zu messende Antikörper ist rot gezeigt.
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Abbildung 26: Histogramm des Antikörpers CD14
Der haematopoetische Marker CD14 ist in der vorliegenden Probe negativ (Abbildung 26).
CD 14 ist als Oberflächenantigen auf verschiedenen Vorgängerzellen der haematopoetischen Zelllinien ausgebildet. Bei negativem Ergebnis wurde gezeigt, dass die vorliegenden Zellen nicht zu den CD14-positiven Blutvorläuferzellen gehören.
Abbildung 27: Histogramm des Antikörpers CD45
Der haematopoetische Leukozyten Marker CD45 ist ebenfalls negativ (Abbildung 27).
CD45, auch als PTPRC (proteine tyrosine phosphatase, receptor type, C) bezeichnet, hat in seinen multiplen Isoformen eine Größe von 180-240 kD. Er kommt in seinen Isoformen auf sämtlichen haematopoetischen Zellen vor und agiert in der T- und B-Zell antigen-Signalgebung. Dieses Oberflächenantigen ist streng spezifisch für haematopoetische Zellen.
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Abbildung 28: Histogramm MHCI
MHC I ist positiv (Abbildung 28).
Der Major Histokompatibility Complex I entspricht dem humanen HLA ABC und ist auf mesenchymalen Stammzellen exprimiert. MHCI entspricht einem Fingerabdruck der Zelle, die Untereinheiten, aus denen sich MHCI zusammensetzt, sind immer gleich, es gibt jedoch individuelle Unterschiede hinsichtlich der Exprimierungs-Häüfigkeit und der antigenpräsentierenden Fähigkeiten. MHCI ist besonders bei Transplantationen betreffenden Fragestellungen relevant.
Abbildung 29: Histogramm CD90
CD90 ist positiv (Abbildung 29).
CD90 Thymocyte differentiation antigen-1 (Thy-1) wurde ursprünglich als Thymozytenantigen entdeckt. Es hat eine Größe von 25-35 kD. CD90 ist ein gängiger kombinatorischer Marker für Stammzellen zusammen mit CD34. Bei Thy-1 handelt es sich um einen Marker der typischerweise auf mesenchymalen Stammzellen ausgebildet ist. Die Ausprägung variiert speziesabhängig, generell ist dieser Marker jedoch auf Thymozyten, Neuronen, MSC, NK-Zellen und einigen anderen Zelltypen zu finden.
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Abbildung 30: Histogramm CD105
CD105 ist positiv (Abbildung 30).
CD105 wird auch als Endoglin bezeichnet und ist 95 kD groß. Er ist auf Endothelzellen, aktivierten Makrophagen, Fibroblasten und glatten Muskelzellen sowie auf vielen mesenchymalen Zellen aus dem Knochenmark ausgebildet.
Die Ergebnisse der FACS-Analyse decken sich mit den für mesenchymale Stammzellen publizierten oberflächenantigen-Eigenschaften.
3.3 Vorversuche
3.3.1 In-vitro-Vorversuche
3.3.1.1 Eignung von ICG zur Markierung von Zellen
Aus der Literatur (Cherrick et al. 1960) ist bekannt, dass ICG nicht toxisch ist und im lebergesunden Patienten hepatobiliär ausgeschieden wird.
In Vorversuchen wurde eine Verdünnungsreihe des ICG genutzt, um eine ICG-Konzentration zu ermitteln, bei der sich die Zellen noch gut darstellen lassen und das ICG sein Signal nicht selbst auslöscht. Eine ICG-Konzentration im Zellmedium von 0,2 µl ICG/ml bis 20 µl ICG/ml zeigte sich als mit der genutzten Kameratechnik gut darstellbar.
In den Vorversuchen zur Beimpfung von Zellkulturen mesenchymaler Stammzellen konnte gezeigt werden, dass ICG in einer Konzentration von 2 µl ICG/ml DMEM-Zellmedium, Zellen in Kultur nicht negativ beeinflusst und zugleich gut detektierbar ist( Abbildung 31).
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Abbildung 31: Zellen in PBS, die übernacht mit 2 µl ICG/ml DMEM-Zellmedium inkubiert wurden in einer Konzentration von 1x106/ml, dargestellt mit dem CCD-Kamerasystem.
3.3.1.2 Fluoreszenzmikroskopische Darstellung ICG-markierter Zellen
Abbildung 32 + Abbildung 33: Zellen in 200x Vergrößerung, übernacht inkubiert unter 2µl ICG/ml DMEM-Zellmedium, mittels Cytospin auf einen Objektträger aufgebracht in Fluoreszenzmikroskopischer Darstellung
In den hier gezeigten Bildern ist eine Anfärbung der Zellen mit ICG unter dem Fluoreszenzmikroskop (Abbildungen 32 und 33) zu sehen. Die Zellen wurden hier 200-fach vergrößert dargestellt. Die Zellen zeigen sich morphologisch rund und nicht spindelförmig, da sie zuvor mit Trypsin aus der Kulturflasche gelöst und dann mittels Zytospin auf den Objektträger aufgebracht worden sind, sie wurden anschließend mikroskopiert und fotografiert.
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Auch im Anschluss an die Beimpfung mit ICG konnten die Zellen weiterhin kultiviert werden, selbst nach mehreren Passagen wuchsen die Zellen unverändert.
Abbildungen 34 bis 36: MSCs 100x vergrößert, nach ICG-Beimpfung und Passage von links: Passage 1 post ICG, Mitte P2, rechts P3
In den Abbildungen 34 bis 36 sind Zellen gezeigt, die mit ICG beimpft und 12 Stunden inkubiert wurden, sie wurden einem Mediumwechsel unterzogen, erhielten ihr normales Kultur-Medium und wurden weiter kultiviert. Selbst nach 3 Passagen war morphologisch keine Veränderung erkennbar. Es gibt keinen morphologischen Hinweis auf einen negativen Einfluss des ICG auf das Zellwachstum in Kultur.
3.3.2 In-vivo-Vorversuche am Schwein
In den in-vivo-Vorversuchen am Schweinemodell wurden beide für die Studie angestrebten Applikationsrouten getestet, es wurde eine intracoronare und eine intramyokardiale Injektion markierter Stammzellen durchgeführt. Ziel der Vorversuche war unter Anderem die Ermittlung der für das Versuchsvorhaben geeigneten Applikationstechniken der Stammzellen in den Herzmuskel. Es wurden letztendlich wie geplant zwei Applikationsrouten vergleichend in die Studie aufgenommen. Die Zellen wurden unter Verwendung einer 26 G Nadel direkt in den Herzmuskel appliziert, oder über einen kleinlumigen Venenverweilkatheter in die LAD injiziert.
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Der Verlauf der LAD ist im nachfolgenden Bild (Abbildung 37) skizziert.
Abbildung 37: Schematische Darstellung des Herzens mit Herzkranzgefäßen (Quelle:Klinikum Do)
Des Weiteren wurden im Rahmen der Vorversuche die genauen Parameter und die optimale Platzierung der Messsonden und sämtlicher Zugänge angepasst. Das für die Vorversuche erstellte vorläufige Versuchsprotokoll wurde modifiziert und für die Hauptversuche optimiert.
3.4 Hauptversuche
3.4.1 In-vitro-Versuch zur Zellverträglichkeit von ICG
Durch Vergleichszählung von Zellen, die mit ICG beimpft worden sind und nativen Zellen der identischen Zelllinie und Passage wurde ersichtlich, dass die Kulturflaschen zeitgleich dem gleichen Zellwachstum unterliegen. Die ermittelten Daten der Vergleichszählung zur Zellproliferation werden im Folgenden gezeigt.
Wurde während der Passage eine morphologische Veränderung der Zellen festgestellt, gelangten die veränderten Zellen nicht in die vergleichende Zählung, sondern wurden
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verworfen. Das Auftreten der Veränderung wurde mit dem Tag der Passage notiert. Bei einer Häufung von Veränderungen der Zellmorphologie sollte dieser Parameter als Messwert in die Beurteilung der Ergebnisse einfließen.
Daten der Vergleichszählung der Zellkultur
Tabelle 6: Zellzahlen in der Neubauerkammer ermittelt, P: Passage, J: ICG-Beimpft, N: ohne ICG Passage ICG Morphologie Durchschnittliche Zellzahl in der
Kulturflasche negativ beeinflusst. Eine durch ICG hervorgerufene Änderung der Zellmorphologie konnte auch nach weiterer längerfristiger Kultivierung der Zellen im Anschluss an die ICG-Beimpfung nicht beobachtet werden. Bei der weiteren Passagierung nach ICG-ICG-Beimpfung zeigte sich keine Abweichung in der Wachstumsgeschwindigkeit oder der Teilungsrate der Zellen im Vergleich mit der nativen Zellkultur.
Wie der obenstehenden Tabelle zu entnehmen, wurden 15 Zellkulturflaschen in unterschiedlichen Passagen (5 Gruppen n = 3) mit ICG beimpft, zugleich wurden genauso viele Kulturflaschen unbeimpft (5 Gruppen n = 3) als Blindproben kultiviert. Die Zellzahlen in den Kulturflaschen wurden zu definierten Zeitpunkten ermittelt und vergleichend beurteilt.
Bezüglich des Parameters Zellzahl zum Zeitpunkt Tag 10 konnten keine signifikanten Unterschiede erkannt werden. Die in der Zellzählung ermittelten Daten sind in tabellarischer Form im Anhang 1 dieser Arbeit zu finden.
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Grafik 1: Zellproliferation vergleichend: petrol = native Zellen; grün = Zellen mit ICG, P: Passage,
Die leichte Verringerung der Gesamtzellzahl in Passage 5 ist dem Zellalter zuzuschreiben. Je länger eine Zelle in Kultur ist, je älter sie also ist und je häufiger sie passagiert wurde, desto langsamer ist auch ihre Proliferationsrate. In der obenstehenden Grafik wird deutlich, dass es innerhalb der einzelnen Passagen zwischen den ICG-beimpften und den nativen Zellen keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich ihrer Proliferationsrate gibt.
3.4.2 In-vivo-Versuche
Für die Hauptversuche wurden 2 Gruppen gebildet, die einander gegenüberzustellen waren.
Der Unterschied in den Gruppen bestand in der Infarktlokalisation und der Applikationsroute der ICG-markierten mesenchymalen Stammzellen. In beiden Gruppen wurden nach nachstehendem Protokoll die Daten dokumentiert. Das in Tabelle 3 zusammengefasste Versuchsprotokoll ist ausformuliert unter Punkt 2.6.2 dargestellt. Die Tiere wurden fortlaufend numerisch benannt, eine Aufzählung der Tiere ist im Folgenden in Tabelle 7 gegeben.
Es ist verzeichnet, welche Applikationsroute bei dem jeweiligen Tier gewählt worden ist, wie die Zellen injiziert wurden, ob es zu einem kardiologischen Zwischenfall gekommen ist und
Zellzahl
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wie gravierend dieser war. Vor Versuchsbeginn wurde jeweils eine Applikationsroute geplant, diese wurde jedoch erst nach Betrachtung des vom Herzbeutel befreiten Herzens am offenen Thorax endgültig festgelegt. Stellte sich die LAD stark verzweigt dar oder war massenhaft in Fettgewebe eingebettet, so wurde das Tier für die intramyokardiale Applikationsroute vorbereitet, indem der Infarkt an einem oder zwei Seitenästen der LAD erzeugt wurde.
Tabelle 7: Im Versuchsvorhaben verwendete Tiere, RIVA: Ramus intraventrikularis paraconalis der A. coronaria sinistra, i.m.: intramuskulär, i.co.: intracoronar LA: links atrial, R. diag.: Ramus diagonalis paraconalis
Tier Datum Infarktareal SZ Injektion
Tod Ursache
1 22.05.2008 RIVA i.m. nein Keine Herzrhythmusstörungen 2 05.06.2008 RIVA LA nein mehrfach erfolgreiche
Defibrillation bei Kammerflimmern 3 12.06.2008 RIVA i.c. nein mehrfach erfolgreiche
Defibrillation bei Kammerflimmern 6 19.06.2008 RIVA keine ja Kammerflimmern 5 18.06.2008 RIVA keine ja Kammerflimmern
4 25.06.2008 RIVA i.c. ja mehrfach Defibrillation bei
Kammerflimmern, z.T. erfolgreich 7 02.07.2008 RIVA i.c. nein 2x erfolgreiche Defibrillation 8 16.07.2008 R. diag. i.m. nein Keine Herzrhythmusstörungen 9 19.07.2008 RIVA i.c nein Keine Herzrhythmusstörungen 10 22.07.2008 R. diag. i.m. nein Keine Herzrhythmusstörungen 11 27.08.2008 R.diag. i.m. nein Keine Herzrhythmusstörungen 12 26.07.2008 RIVA keine ja Kammerflimmern während op.
Vorbereitung
13 28.08.2008 RIVA i.c. nein mehrfach erfolgreiche Defibrillation bei Kammerflimmern
14 28.08.2008 R. diag. i.m. nein Keine Herzrhythmusstörungen 15 14.01.2009 R. diag. i.m. nein 1x Erfolgreiche Defibrillation
direkt nach SZ-Applikation 16 04.02.2009 RIVA i.c. nein leichte Herzrhythmusstörungen 17 11.03.2009 R. diag. i.m. nein Keine Herzrhythmusstörungen
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In den Versuchsprotokollen werden zwei Applikationsrouten unterschieden, die beiden zu vergleichenden Versuchsgruppen wurden nach diesen Routen eingeteilt. Es wurden aus den in den Versuchen erhobenen Daten je Gruppe fünf repräsentative Tiere ausgewählt, an denen die Auswertung der Hauptversuche der Studie durchgeführt wurde.
Sämtliche ermittelte hämodynamische Werte sind im Anhang 2 in tabellarischer Auflistung angefügt.
Im Rahmen der Versuche kam es bei vier Tieren zum Tod durch kardiale Zwischenfälle, die mit dem erzeugten Herzinfarkt in Verbindung zu bringen waren. Die unter Durchführung des Versuches verendeten Tiere wurden keiner der beiden Gruppen zugeordnet. Die bis zum Eintreten der Komplikationen erhobenen Daten fanden keine Verwendung.
3.4.2.1 Betrachtung der hämodynamischen Parameter
In die Betrachtung der hämodynamischen Parameter fließen pro Gruppe 5 Tiere ein. In die Gruppe I, die Tiere mit intramyokardialer Stammzellapplikation, gehen die Tiere 1, 8, 10, 11 und 14 ein, für die Gruppe II, Tiere mit intracoronarer Stammzellapplikation, wurden die Tiere 3, 7, 9, 13 und 16 herangezogen.
Die im Rahmen der Versuche durchgeführten Blutgasanalysen dienten im Wesentlichen der Überwachung der Narkose. Kam es zu Abweichungen in den gemessenen Blutwerten, so wurde mittels Infusion oder Medikamentengabe eine Stabilisierung der Werte herbeigeführt.
Die in Tabelle 3 aufgeführten hämodynamischen Parameter sind von hoher Bedeutung für die Einhaltung standardisierter Versuchsbedingungen.
Wie aus der Tabelle 8 ersichtlich ist, waren die interaoperativ ermittelten hämodynamischen Werte bei den einzelnen Tieren individuell verschieden. Betrachtet man jedoch das Einzeltier im Versuch, so zeigt die geringe Standardabweichung, dass die hämodynamischen Parameter im Versuchsverlauf konstant waren.
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Tabelle 8: Hämodynamische Mittelwerte der Tiere im Versuch
Mittelwerte ± Standardabweichung, HZV: Herzzeitvolumen, HF: Herzfrequenz, SV: Schlagvolumen, SD: Systolischer Blutdruck, DD: Diastolischer Blutdruck, MD: Mittlerer Blutdruck, SVR: Systemischer Gefäßwiderstend
Tier HZV
Der Systemische Gefäßwiderstand (SVR) blieb in Betrachtung der Messwerte der Einzelversuche in beiden Gruppen nach Stammzellapplikation weitgehend konstant.
0
Grafik 2: Der systemische Gefäßwiderstand (SVR) der einzelnen Versuchstiere ist einander gegenübergestellt. Verglichen werden die mit ihren laufenden Nummern bezifferten in die Auswertung eingegangenen Tiere
Stellt man nun die Mittelwerte des systemischen Gefäßwiderstandes der beiden nach Applikationsrouten eingeteilten Versuchsgruppen, so kann gezeigt werden, dass sich nur ein geringer Unterschied bezüglich des Anstieges des Gefäßwiderstandes zwischen den beiden Gruppen darstellen lässt.
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Grafik 3: Systemischer Gefäßwiderstand (SVR) Versuchsgruppe I und II (n = 5)
Betrachtet man das Schlagvolumen der einzelnen Tiere während des gesamten Versuchsablaufes zeigt sich zwischen den beiden Gruppen über den Versuchsverlauf kein deutlicher Unterschied. Das Schlagvolumen berechnet sich wie folgt:
SV = HZV / HF
Ein geringfügiges Absinken des Schlagvolumens ist zum Zeitpunkt des Ischämiebeginnes, sowie der Stammzellapplikation (T7) bei beiden Gruppen gleichermaßen zu beobachten.
Tabelle 9: SV (Schlagvolumen) in Liter, Mittelwerte beider Versuchsgruppen zu den jeweiligen Messzeitpunkten T0 bis T11 Messzeitpunkt Gruppe I i.m. (Liter) Gruppe II i.co. (Liter)
T0 0,067 0,052
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0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08
T0 T1 T2 T3 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11
i.m.
i.co.
Grafik 4: Schlagvolumen in Liter, Mittelwerte beider Versuchsgruppen zu den jeweiligen Messzeitpunkten T0 bis T11
3.4.3 Versuchsgruppen
Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Markierung der mesenchymalen Stammzellen mit ICG möglich ist, wurden die markierten Zellen in den Versuch genommen.
Die für die Auswertung der Gruppe 1, also der intramyokardialen Applikation, ausgewählten Tiere sind in der obenstehenden Tabelle in blauer Farbe hervorgehoben. Die für die Gruppe 2, intracoronare Applikationsroute, ausgewählten, in die Auswertung einfließenden Tiere sind in der Tabelle in grüner Farbe kenntlich gemacht.
3.4.3.1 Intramyocardiale Gruppe
Die intramyokardiale Gruppe bestand aus 7 Tieren, von denen 5 in die Auswertung einfließen. Die in die Auswertung genommenen Tiere tragen die laufenden Nummern Tier 1, 8, 10, 11 und 14. Der Infarkt wurde jeweils an einem bis zwei den Ventrikel versorgenden Seitenästen der LAD (left anterior descendens, auch als RIVA bezeichnet) durch eine Ligation induziert. Auf den unten gezeigten Bildern Abbildung 38 und Abbildung 41 ist das Infarktareal makroskopisch deutlich erkennbar.
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Abbildung 38: Zwei Seitenäste der LAD sind abgebunden, das Myokard im Infarktgebiet zeigt eine bläuliche Verfärbung.
Auch in der Fluoreszenzangiographie konnte das Infarktareal eindeutig bestimmt werden (Abbildungen 44 und 45). Zum Messzeitpunkt T1 wurde dem Tier hierzu ICG über die Ohrvene appliziert, welches etwa 7-12 Sekunden später mittels Fluoreszenzangiographie am Herzen darstellbar war.
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Abbildung 39 + Abbildung 40: Fluoriszenzangiographische Darstellung des Infarktgebietes.
Der Infarkt wurde für eine Stunde belassen, wonach sich eine Reperfusionsphase (Abbildung 41) des Infarktgebietes anschloss.
Abbildung 41: Ödematöse, makroskopisch sichtbare Veränderung des Infarktareals in der Reperfusionsphase.
Die markierten Stammzellen wurden dann in mehrere 1 ml-Spritzen aufgezogen (Abbildung 42) und mit 26 G Nadeln an verschiedenen Stellen direkt in das Myokard über das Infarktgebiet verteilt injiziert.
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Abbildung 42: ICG-markierte Zellen in einer 1 ml-Spritze aufgezogen, dargestellt unter dem Licht des Kamerasystems
In den mit dem Kamerasystem mitgeschnittenen Bildern der intramyocardialen Injektion der mit ICG markierten mesenchymalen Stammzellen, ist ein venöses Abfließen (Abbildung 44) der injizierten Zellen direkt im Anschluss an die Applikation deutlich sichtbar. Dies stellt sich auch an der unten exemplarisch gezeigten Fluoreszenzdarstellung einer intramyokardialen Injektion deutlich dar.
Abbildungen 43 bis 45: links: Applikation von Stammzellen, Mitte: Venöses Abfließen schon während der Injektion, rechts:
Fokale Aufhellungen im Herzmuskelgewebe
Anhand der Aufnahmen des Kamerasystems ist zudem eine Bildung von Hohlräumen, in denen Zellsuspensat vorliegt, im Bereich der Injektionsstelle zu erahnen (Abbildung 45).
Diese Injektatgefüllten Zusammenhangstrennungen des ischämiegeschädigten Myokards bilden eine weitere Belastung für den Herzmuskel.
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Abbildungen 46 bis 48: links: Fokale Aufhellung schon unter der Zellapplikation, Mitte & rechts: Aufhellung weiterhin
Abbildungen 46 bis 48: links: Fokale Aufhellung schon unter der Zellapplikation, Mitte & rechts: Aufhellung weiterhin