Tierärztliche Hochschule Hannover
Lokalisationsdiagnostik markierter Stammzellen mittels Fluoreszenzangiographie am Schweineherz in vivo
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae –
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Mandy Verona Vienna Stubbendorff geb. Kolk
Hamburg
Hannover 2009
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Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. rer. Nat. B. Schröder
Physiologisches Institut
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Prof. Dr. med. C. Detter
Universitäres Herzzentrum Hamburg
1. Gutachter: Prof. Dr. rer. Nat. B. Schröder
2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. K.-H. Waldmann
Tag der mündlichen Prüfung: 19.11.2009
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Für meine Eltern
Elke und Wolfgang
und meine Großmutter
Hildegard
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1 Einleitung ... 1
1.1 Einleitende Zusammenfassung der Studie ... 1
1.2 Koronare Herzerkrankung und Herzinfarkt ... 1
1.3 Stammzelleinsatz nach Herzinfarkt ... 5
1.4 Methoden der Zellmarkierung, Zellverfolgung ... 11
1.5 Indocyaningrün (ICG) ... 11
1.6 Tiere ... 11
1.7 Ziel der Studie ... 12
2 Material und Methoden ... 14
2.1 Tiere ... 14
2.1.1 Tierversuchsgenehmigung ... 14
2.1.2 Homologes Tiermodell ... 14
2.1.3 Das Hausschwein: Sus Scrofa domestica ... 14
2.1.4 Versuchstiere in dieser Studie ... 15
2.1.5 Knochenmarkgewinnung/ -isolierung ... 17
2.1.6 Aufbereitung der Stammzellen ... 18
2.1.7 Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen ... 20
2.1.8 Charakterisierung der Zellen ... 23
2.1.9 Zellmarkierung für FA ... 33
2.2 Fluoreszenzangiographie ... 36
2.3 Vorversuche ... 40
2.3.1 In-vitro-Vorversuche ... 40
2.3.2 In-vivo-Vorversuche ... 41
2.4 Hauptversuche ... 42
2.4.1 In-vitro-Hauptversuch zur Zellverträglichkeit des ICG ... 42
2.4.2 In vivo Hauptversuche ... 43
2.5 Versuchsprotokolle ... 52
2.5.1 Vorversuche Tiere ... 52
2.5.2 Hauptversuche Tiere ... 52
2.5.3 Probengewinnung im Rahmen der Tierversuche ... 57
2.6 Statistische Methoden ... 58
2.7 Methode der Literaturrecherche ... 58
3 Ergebnisse und Datenerhebung ... 59
3.1 Gewinnung mesenchymaler Stammzellen ... 59
3.2 Charakterisierung der Zellen ... 59
3.2.1 Zellmorphologie ... 59
3.2.2 Differenzierungsassay ... 61
3.2.3 FACS-Analyse ... 64
3.3 Vorversuche ... 67
3.3.1 In-vitro-Vorversuche ... 67
3.3.2 In-vivo-Vorversuche am Schwein ... 69
3.4 Hauptversuche ... 70
3.4.1 In-vitro-Versuch zur Zellverträglichkeit von ICG ... 70
3.4.2 In-vivo-Versuche ... 72
3.4.3 Versuchsgruppen ... 77
4 Diskussion ... 86
4.1 Stammzelltherapie bei Myokardinfarkten ... 86
4.2 Hintergründe zu mesenchymalen Stammzellen ... 91
4.3 Vorversuche (Protokoll, Probleme, Rückschlüsse für die Hauptversuche) ... 94
4.4 Hauptversuche ... 95
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4.4.1 Gruppe I: Intramyocardiale Applikation ... 95
4.4.2 Gruppe II: Intracoronare Applikation ... 96
5 Zusammenfassung ... 98
6 Summary ... 100
7 Abkürzungsverzeichnis ... 102
8 Literaturverzeichnis ... 104
9 Anhang ... 118
9.1 Vergleichende Zellzählung ... 118
10 Danksagung ... 119
1 1 Einleitung
1.1 Einleitende Zusammenfassung der Studie
Die bisher zur Heilung von durch Myokardinfarkte entstandene, ischämische Gewebeschäden angewendeten Methoden beinhalten den Stammzelleinsatz (STRAUER et al. 2002; TOMITA et al. 1999). In der vorliegenden Studie sollen mesenchymale Stammzellen (MSCs; MSZ) mit dem Fluoreszenzfarbstoff Indocyaningrün (ICG) markiert, und in Echtzeit, während der Applikation über ein Kamerasystem detektiert und auf einem Monitor dargestellt werden.
Eine postoperative Darstellung von applizierten Zellen mittels MRT wurde bereits von verschiedenen Arbeitsgruppen durchgeführt. Es wurden für die Versuche dieser Studie zwei Applikationsrouten, auf denen die Zellen injiziert wurden, gewählt, intramyokardial, wie in der Klinik und in verschiedenen Studien praktiziert, (STRAUER et al. 2002, VAN DER BOGT et al. 2009) und intracoronar. Zur Durchführung der Versuche wurde das Schweinemodell genutzt.
Das Ziel dieser Studie ist die Etablierung einer intraoperativ anwendbaren Methode zur Darstellung injizierter MSCs. Es soll gezeigt werden, in welchem Bereich des Herzmuskels sich die applizierten Stammzellen anlagern.
1.2 Koronare Herzerkrankung und Herzinfarkt
Die ischämische Kardiomyopathie durch Myokardinfarkte ist die Hauptursache des kongestiven Herzversagens und daraus resultierenden Todes in den westlichen Industrienationen (PFEIFFER u. BRAUNWALD 1990, SIEWERT 2001). Der Krankheitskomplex der Koronaren Herzerkrankung (KHK) bildet, nach Angaben des Statistischen Bundesamtes, (STATISTISCHES BUNDESAMT 2006-7) die häufigste Todesursache in der BRD.
Epidemiologisch betrachtet sind Herz-Kreislauferkrankungen die mit Abstand häufigste Todesursache in den Industrienationen, wobei die KHK mit ihren Manifestationen die Todesstatistik anführt. Im Jahr 2005 wurden in Deutschland mehr als 17% aller registrierten Todesfälle durch KHK und Herzinfarkt verursacht. Die Inzidenz der KHK beträgt etwa 0,6%
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über alle Altersklassen hinweg, wobei in 50% der Fälle der Herzinfarkt als Erstereignis eintritt, ohne dass der Patient zuvor Beschwerden gezeigt hat (GOODMAN et al. 2009).
Als Risikofaktoren für die KHK werden Hyperproteinämie, Diabetes mellitus, Adipositas, Alkohol- und Nikotinabusus, arterielle Hypertonie sowie Bewegungsmangel genannt (SIEWERT 2001). Es wird häufig auch von einer Managerkrankheit gesprochen, wobei sich das Krankheitsbild inzwischen durch alle Bevölkerungsschichten zieht. Als ein wichtiger auslösender Faktor kann jede Form dauerhaften Stresses angesehen werden.
Die KHK wird auch als ischämische Herzkrankheit (IHK) bezeichnet. Es kommt im Zuge der IHK zunehmend zu einer Verengung und Versteifung der Herzkranzgefäße sowie einer fortschreitenden Verminderung des Gefäßquerschnitts. Die Folge ist eine Beeinträchtigung der Durchblutung und damit eine verminderte Sauerstoffversorgung der Herzmuskulatur. Es entsteht ein Missverhältnis zwischen Sauerstoffbedarf und Sauerstoffangebot, welches als Ischämie oder Koronarinsuffizienz bezeichnet wird. Die zunehmende Manifestation der IHK erhöht die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von akuten lebensbedrohlichen Komplikationen, wie dem Herzinfarkt.
Akutes Koronarsyndrom (ACS) (ANTMAN et al. 2004) ist ein Sammelbegriff für verschiedene Phasen von Durchblutungsstörungen der Herzkranzgefäße, es wird in der Notfallmedizin vom ACS gesprochen, solange die endgültige Diagnose eines akuten Herzinfarktes oder einer instabilen Angina Pectoris noch nicht gesichert ist.
Allgemein wird als Infarkt ein Pathomechanismus bezeichnet, bei dem es zu einem schnellen Absterben eines Gewebebezirkes nach Verschluss des versorgenden Blutgefäßes kommt (WIESNER u. RIBBECK 2000). Hämorrhagische Infarkte entstehen in Organen, die durch zwei Gefäßsysteme versorgt werden oder deren Arterienverzweigungen reichlich anastomosiert sind, wie Lunge und Leber. Aus den nicht verschlossenen Gefäßen erfolgen beim ischämischen Infarkt Diapedesisblutungen, die dieser Form des Infarktes die rote Farbe verleihen. Im Bereich des Myokards entsteht durch den Verschluss echter oder funktioneller Endarterien ein anämischer Infarkt, der sich makroskopisch als Aufhellung des Gewebes darstellt.
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Der Herzinfarkt oder Myokardinfarkt (AMI, acute myocardial infarction) ist eine akute und lebensbedrohliche Erkrankung des Herzens. Hierbei kommt es zu einer akuten Durchblutungsstörung des Herzmuskels, hervorgerufen durch eine plötzliche Minderdurchblutung des Herzkranzgefäßes, wodurch Zellen des Myokards aufgrund einer Ischämie absterben. Die für den Patienten erlebten Symptome des Herzinfarktes äußern sich von Fall zu Fall sehr unterschiedlich und reichen von Schwächegefühl über Übelkeit und starke Schmerzen im Brustbereich bis zum Bewusstseinsverlust. Selbst bei schneller Wiederherstellung der Blutzufuhr erleiden die Herzmuskelzellen auch während der Reperfusionsphase noch ischämiebedingte Schäden (MATSUMURA et al. 1998). Im Zuge eines Myokardinfarktes kann es zu schweren Herzrhythmusstörungen kommen, die zum Flimmern und schließlich zum Herzstillstand und zum Tode des Patienten führen können.
Am Herzen selber laufen auf zellulärer Ebene im Herzmuskelgewebe verschiedene Pathomechanismen ab. Die Zellen erfahren nicht nur einen Sauerstoffmangel, unmittelbare Ischämiefolge ist der Zusammenbruch der zellulären Energieversorgung als Ganzes, welcher eine pathophysiologische Kettenreaktion initiiert: Nach Einsetzten der Ischämie bricht die oxidative Phosphorylierung in der Zelle ab, wobei auf energiereiche Phosphatreserven, wie ATP und Phosphokreatin, zurückgegriffen werden muss.
Fortdauernder Sauerstoffmangel aktiviert den anaeroben Glukosestoffwechsel mit dem Endprodukt Laktat, welches zunehmend intrazellulär akkumuliert. Es hebt zum Einen die Gewebeosmolarität erheblich an und unterstützt somit die Ausbildung eines zytotoxischen Ödems, zum Anderen hemmt die Azidose die mitochondriale Phosphorylierung und führt zusätzlich zu einer Denaturierung von Ribonukleinsäuren. Freie Radikal-Reaktionen nehmen zu und setzen mit den Reaktionsprodukten Superoxidanion (-O2), Wasserstoffperoxid (H2O2) und OH- reaktionsfreudige, aggressive Substanzen frei, die sowohl die Zellmembranstruktur, als auch die Nukleinsäuren der Zelle angreifen und schädigen. Sekundär beeinflusst wird zudem der lokale Ionen- und Flüssigkeitshaushalt. Ionengradienten müssen aktiv aufrechterhalten bleiben. Wird die dazu benötigte Energie nicht mehr ausreichend bereitgestellt, steigt der intrazelluläre K+-Spiegel an, wobei die extrazellulären Na+-, Ca2+- und Cl--Ionenkonzentration absinken. Es stellt sich eine erhöhte Membranpermeabilität mit einem daraus resultierenden Ionengleichgewicht ein. Abnahme des extrazellulären
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Flüssigkeitsvolumens und Depolarisation der Zelle sind unmittelbare Folgen. Eine Verschiebung von Serumproteinen und anderen osmotisch aktiven Molekülen in den Extravasalraum verursacht dabei das vasogene Ödem, welches Stunden bis Tage nach dem ischämischen Insult auftritt. Die Schlüsselrolle im intrazellulären Ionenhaushalt spielt das Ca2+. Niedrige intrazelluläre Ca2+-Ionenkonzentrationen sind Voraussetzung für die Funktion als metabolischer Regulator und zellulärer Messenger. Dabei wird physiologischerweise überschüssiges intrazelluläres Ca2+ in Mitochondrien sowie im endoplasmatischen Retikulum (ER) aktiv gespeichert. Fehlt dazu die erforderliche Energie, so wird dieses gespeicherte Ca2+
freigesetzt und führt zu einem intrazellulären Ca2+ Exzess, welcher die Zelle depolarisiert und zusätzliche, spannungsgesteuerte Ca2+-Kanäle öffnet. Begleitende ischämiebedingte strukturelle Zellmembranschäden verursachen einen Niedergang von Phospholipiden, die Inositoltriphosphat (IP3) produzieren, welches ebenfalls die im endoplasmatischen Retikulum gespeicherten Ca2+-Ionen freisetzt. Das sich entwickelnde Missverhältnis zwischen Membranprotein und Membranphospholipid zerstört Eigenschaften wie Permeabilität spezifischer Ionen oder die Funktion membrangebundener Enzyme. Dies führt unmittelbar zum kompletten Funktionsverlust und Tod der Zelle. Ein letzter wichtiger Aspekt, auch im Hinblick auf die Reversibilität der Schäden, ist die Unterdrückung der Proteinsynthese bei Verlust des regionalen Blutflusses (KOOLMAN u. RÖHM 1998).
Exkurs: In der Klinik kann mit dem Troponin-T-Test (NOMURA et al. 2009) eine Schädigung des Myokards bereits 6 Stunden nach Herzinfarkt im peripheren Blut nachgewiesen werden. Troponin ist ein regulatives Protein in den Aktinfilamenten der Muskelzelle, es gibt unterschiedliche Isotypen in den drei Muskelzelltypen. Die Isotypen cTnI und cTnT kommen in den Herzmuskelzellen vor und werden im Falle eines Gewebeschadens freigesetzt. Der standardisierte Troponin-T-Test (cTnT) basiert auf zwei herzspezifischen monoklonalen Antikörpern, wobei einer das Troponin in der Blutprobe hält und der andere es markiert.
Sobald die myokardialen Zellen nicht mehr ausreichend mit Sauerstoff versorgt sind und eine Hypoxie erleiden, beginnt das Zellsterben, apoptotische Zellen und Zellen in Lyse befinden sich im Infarktgebiet. Die freiwerdenden Zellinhaltsstoffe und die im Zuge des Zellsterbens abgegebenen Zytokine können das Absterben benachbarter Zellen auslösen.
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Nach Wiederherstellung der Blutzufuhr können sich einige noch vitale Zellen im Infarktareal wieder erholen. Das Zellsterben im Ischämiegebiet geht dennoch eine Zeit lang weiter, da manche Zellen so stark geschädigt sind, dass sie trotz wiederhergestellter Versorgung nicht mehr gerettet werden können. Je schneller die Reperfusion des betroffenen Areals stattfindet, desto mehr Zellen überleben die temporäre Unterversorgung (KRUTHKUL et al. 2007).
1.3 Stammzelleinsatz nach Herzinfarkt
Die Stammzelltransplantation ist ein vielversprechender Therapieansatz bei Myokardinfarkten (WANG et al. 2009). Eine Vielzahl experimenteller Studien unterstützen die Stammzelltransplantation als eine Strategie, um die myokardiale Funktion nach einer Ischämie zu verbessern (ORLIC et al. 2001 a ,b ,c) und die Beeinträchtigungen durch sich bildendes Narbengewebe im Herzmuskel zu verringern. Es hat sich gezeigt, dass der Einsatz von Stammzellen (BRITTEN et al. 2003, WOLLERT et al. 2004) ein großes therapeutisches Potential (WU et al. 2007) in Hinblick auf die Verringerung der Infarktgröße und die Wiederherstellung der Herzfunktion nach einem irreversiblen ischämischen Schaden besitzen.
Es konnte sogar gezeigt werden, dass nach einer Ischämie im Myokard eine nachweisbare Rekrutierung von Knochenmark-Stammzellen von statten geht (KAMOTA et al. 2009).
Dieses sogenannte Homing von MSCs wird durch Zytokine, die im Infarktgebiet freiwerden, bedingt. Die Menge an ausgeschütteten Zytokinen ist jedoch nicht groß genug, um ausreichend MSCs zum Infarktgebiet zu führen, welche eine Ausheilung des Herzmuskels ermöglichen würden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Zytokine selbst unterstützend bei der Heilung von Geweben agieren, indem sie beispielsweise die Einsprossung von Gefäßen und somit die Versorgung des geschädigten Gewebes fördern (HORWITZ et al.
2009). Mesenchymale Stammzellen werden therapeutisch bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen angewendet (BARRY 2003).
Der größte Anteil der in-vivo-Forschung im Bereich der Stammzelltherapie wird am Tiermodell durchgeführt. Es gibt bisher nur sehr wenige Studien, die sich mit direkten klinischen Belangen nach Einsatz von Stammzellen zur Therapie myokardialer Schäden befassen (SATIJA et al. 2009). Die Stammzellanwendung ist eine sehr neue Strategie zur Behandlung verschiedenster Erkrankungen und Krankheitskomplexe. In vielen Bereichen
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wird Grundlagenforschung betrieben, in der es ein Ziel ist, neue, innovative Therapiestrategien zu etablieren. Es spielt sich ein großer Anteil der Stammzellforschung an in-vitro-Studien in der Zellkultur ab, hier werden häufig immunologische Fragestellungen bearbeitet oder Stammzellen, die aus verschiedenen Geweben stammen, hinsichtlich ihres Potentials vergleichend charakterisiert. Die meisten Methoden, die im Tierversuch dazu dienen, den Verbleib von Stammzellen nach Transplantation in den Körper zu klären, erfordern eine Immunhistologische Untersuchung des Gewebes. Für diese Art der Untersuchung ist eine Probengewinnung aus verschiedenen Geweben in einem nicht mit einem Weiterleben zu vereinbarendem Umfang notwendig.
Die Fluoreszenzangiographie (FA) konnte für die visuelle Beurteilung und Quantifizierung der Myokardperfusion (WIPPER 2006) bei flusslimitierenden Stenosen sowie zur Infarktdiagnostik bereits validiert werden. Die FA ist ein hoch sensitives, einfach anwendbares und gut reproduzierbares bildgebendes Verfahren, das zur intraoperativen Darstellung von Koronargefäßen und der Myokardperfusion (DETTER et al. 2007) ohne Kontrastmittel- und Strahlenbelastung für den Patienten verwendet werden kann. Die Myokardperfusion kann anhand von Intensitätsdifferenzen oder im zeitlichen Verlauf des Fluoreszenzanstiegs quantifiziert werden, so können selbst kleinste Perfusionsunterschiede des Myokards intraoperativ detektiert werden.
Eine bisher angewendete Methode zur Bestimmung des Verbleibs von injizierten Stammzellen beinhaltet die Verwendung von Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT). Die Kennzeichnung von Zellen mit Superparamagnetic-iron-oxide-Nanopartikeln (SPIO) lässt eine nichtinvasive MRT-Darstellung von transplantierten Stammzellen zu. Die Zellen stellen sich bei dieser Methode als dunkle Bereiche im MRT dar, der Nachweis von SPIO markierten Zellen ist für mehrere Wochen postoperativ möglich (AMSALEM et al. 2007). Die eisenmarkierten Zellen erscheinen im MRT als Bereiche mit einer reduzierten Signalstärke und können somit gut von dem umliegenden Gewebe unterschieden werden. Die Zellen wurden in verschiedenen Studien (AMSALEM et al. 2007) über 24 Stunden mit den SPIO inkubiert und ein Nachweis des Überlebens der Zellen wurde mittels Trypanblaufärbung getroffen. In der histologischen Auswertung dieser genannten Studie (AMSALEM et al.
2007) zeigte sich jedoch, dass eine Vielzahl der SPIO nach 4 Wochen von kardialen
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Makrophagen aufgenommen worden waren. Ein weiterer Anteil der SPIO befand sich in verschiedenen anderen Körperregionen in den im Blut befindlichen Makrophagen. Mittels Realtime PCR konnte daneben über eine Y-Chromosomenanalyse das Vorhandensein von injizierten Zellen nachgewiesen werden. Hierzu wurden in den Versuchen männliche Zellen in ein weibliches Tier transplantiert. Um eventuell für spätere Fragestellungen Y- Chromosomenanalysen bezugnehmend auf die für die vorliegende Dissertation vollzogenen Experimente durchführen zu können, wurden hier ebenfalls männliche Stammzellen in weibliche Empfängertiere appliziert und eine Vielzahl verschiedener Blut- und Gewebeproben entnommen und asserviert.
In bestehenden klinischen (SCHULERI et al. 2009) und experimentellen (SATIJA et al. 2009) Studien konnte bereits gezeigt werden, dass der Einsatz von Stammzellen in ischämisch geschädigten Myokardarealen zu einem positiven Verlauf der Heilung geführt hat.
In jüngster Zeit sind multipotente mesenchymale Stammzellen (MSCs) aufgrund ihrer einzigartigen Charakteristika zu einem beliebten therapeutischen Werkzeug avanciert. Sie können leicht gewonnen werden, sind einfach zu kultivieren und zeigen ex vivo ein hohes Expansionspotential (QIAO et al. 2007). Es gibt verschiedene Stammzellpopulationen, die je nach Art und Herkunft multi- bis pluripotent sind. Stammzellen können aus Embryonen gewonnen werden, wobei dies nur sehr restriktiv geschieht und sich weltweit strengen Auflagen unterwirft. Es sind nur sehr wenige humane embryonale Stammzelllinien erhältlich.
Aufgrund der vorherrschenden internationalen Rechtslage ist es nicht möglich, neue humane embryonale Stammzelllinien aus Embryonen zu isolieren und zu etablieren. Für die Arbeit mit embryonalen Stammzellen unterschiedlicher Säugetiere bedarf es weltweit länderspezifischer Genehmigungen. Embryonale Stammzellen sind pluripotent und somit wissenschaftlich für einige Fragestellungen von großem Interesse. Die Pluripotenz der embryonalen Stammzellen (KOLLE et al. 2009; OHNUKI et al. 2009) lässt eine Differenzierung der Zellen in jedes gewünschte Gewebe, ungeachtet des Keimblattes, zu.
Eine Isolation früher mesenchymaler Stammzellen ist aus verschiedenen Anteilen der Nabelschnur möglich, und adulte mesenchymale Stammzellen können aus vielen Geweben des Körpers, wie zum Beispiel Knochenmark und Fettgewebe, gewonnen werden. In der internationalen Literatur werden aus Knochenmark isolierte mesenchymale Stammzellen als
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„bonemarrow-derived mesenchymal stem cells“ bezeichnet und mit BM-MSCs abgekürzt.
Anders als embryonale Stammzellen sind mesenchymale Stammzellen nur multipotent. Die aus Knochenmark gewonnenen Stammzellen können aufgereinigt, ex vivo vermehrt (REYES et al. 2001) und anschließend biologisch charakterisiert werden (BARRY 2004). In der vorliegenden Studie wurde mit aus Knochenmark isolierten adulten mesenchymalen Stammzellen (MSC) gearbeitet. Die aus Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen beinhalten eine Population von multipotenten Progenitorzellen, die die Fähigkeit besitzen, Haematopoese zu unterstützen und sich in eine Vielzahl verschiedener Gewebe zu differenzieren (PITTENGER et al. 1999). Adulte mesenchymale Stammzellen stehen nicht im Blickfeld ethischer Diskussionen und erfahren in ihrem Einsatz keine ethischen Beschränkungen (LE BLANC et al. 2003).
Bisher konnte gezeigt werden, dass die Implantation von aus Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) die Funktion des geschädigten Herzens unterstützt und das nekrotische Gewebe sowie die Narbenausdehnung verringert (MANGI et al. 2003;
AMANDO et al. 2005; ZIMMET u. HARE 2005, LERI et al. 2005).
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) – auch mesenchymale stromale Zellen genannt – kommen als adulte, multipotente Stammzellen in für eine Isolation ausreichender Zahl, zum Beispiel im Knochenmark, Fettgewebe und in sämtlichen Bestandteilen der Nabelschnur, genauer im Wharton´s Jelly, einem gallertartigen Bindegewebe, dem die Nabelschnurvenen umgebenden Gewebe, dem Nabelschnurblut, und des weiteren in der maternalen Plazenta, vor. Der aus unterschiedlichen Anteilen der Nabelschnur stammende, frühe mesenchymale Stammzelltyp steht aufgrund seiner Plastizität und guten Zugänglichkeit für Anwendungen in der regenerativen Medizin seit einigen Jahren im Fokus der adulten Stammzellforschung.
Stammzellen aus dem Mesenchym werden zurzeit vor allem aus Knochenmark gewonnen, sie haben eine hohe Teilungsrate und können primär in Gewebezellen mesenchymalen Ursprungs (Knochen, Knorpel, Sehnen, Muskel, Bindegewebe, Blutzellen) differenzieren. Seit einigen Jahren werden Versuche unternommen, diese mesenchymalen Stammzellen auch in Zelltypen anderer Gewebe (Nervenzellen, Leber-, Epithel-, ß-Zellen und Nierentubuluszellen) zu differenzieren, um sie auf ihr therapeutisches Potential entsprechender organspezifischer Erkrankungen in diesem Bereich zu untersuchen. Die Differenzierung in andere, nicht direkt
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durch den Zellursprung im mittleren Keimblatt, dem die MSCs zugeordnet werden, vorgegebene Zelltypen nennt man Transdifferenzierung. In vitro konnten aus Knochenmark gewonnene MSCs bereits in cardiomyozytenartige Zellen transdifferenziert werden (MARTIN-RENDON et al. 2008).
Die Differenzierung von MSCs, also die Entwicklung im Sinne einer morphologischen und funktionellen Reifung und Spezialisierung, kann durch Zugabe von verschiedenen Substanzen, wie zum Beispiel Zytokinen und Wachstumsfaktoren, in Gang gesetzt werden.
Eine solche gezielte Differenzierung in bestimmte Zelltypen kann zur Charakterisierung und Identifizierung der Ausgangszelle herangezogen werden. Diese Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen in Chondrozyten, Adipozyten und Osteozyten ist mit verschiedenen Protokollen ein gängiger, für die Charakterisierung von Zelllinien genutzter Nachweis.
Der Weg der Differenzierung, also die Entscheidung, zu welchem Zelltyp eine Zelle sich entwickelt, hängt von verschiedenen äußeren und inneren Faktoren, wie beispielsweise dem Einfluss von Wachstumsfaktoren, Hormonen, Gewebehormonen (Zytokinen), Nachbarzellen (Zell-Zell-Kontakte) und der Herkunft (Determination) der Spenderzelle ab, um nur einige zu nennen. Da die Herkunft der Zellen einen wesentlichen Einfluss auf die Differenzierungsmöglichkeiten hat, kann die Differenzierung als Methode herangezogen werden, um Rückschlüsse auf die Ausgangszelle zu ziehen.
In der embryologischen Entwicklung entstehen drei Keimblätter. Keimblätter sind eine schichtenartige Anordnung der Zellen durch die Gestaltungsvorgänge während der Gastrulation. Zunächst entstehen das äußere Keimblatt, Ektoblast und das innere Keimblatt, Entoblast, zwischen die sich in der Folge das mittlere Keimblatt, Mesoblast, einschiebt. Aus dem Mesoblast, auch Mesoderm genannt, gehen vorwiegend Binde und Stützgewebe des Körpers, der Kreislaufapparat, die Muskulatur, der Harn- und Geschlechtsapparat, die Nebennierenrinde und das Mesothel der serösen Häute hervor. Als Mesenchym bezeichnet man sogenanntes embryonales Bindegewebe, das im Wesentlichen einen Verband sternförmig verzweigter Mesenchymzellen darstellt und eine Vielzahl von Organen und Geweben (z.B.:
Knochen, Muskulatur, Sehnen, Bindegewebe,…) hervorbringt. (WIESNER u. RIBBECK
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2000) Die mesenchymalen Stammzellen verhalten sich ähnlich den embryonalen Mesenchymzellen, sind aber nicht mehr pluripotent, sondern nur noch multipotent.
Sind mesenchymale Stammzellen für lange Zeit in Kultur, erfahren sie, wie die im Körper befindlichen Zellen, einen Alterungsprozess, der sich in einer Veränderung des Zellmetabolismus zeigt und zu einer ungewollten Differenzierung der Zellen führen kann (VACANTI et al. 2005).
Die Anwendung mesenchymaler Stammzellen zur Heilung verschiedenster Erkrankungen, besonders des blutbildenden Systems, ist eine seit über 30 Jahren erfolgreich durchgeführte Praxis (GRATWOHL et al. 2003). Ein klinischer Einsatz mesenchymaler Stammzellen findet seit einigen Jahren erfolgreich, auch bei Erkrankungen wie zum Beispiel der Osteogenesis imperfecta, Anwendung (HORWITZ et al. 1999). Diese Erfolge basieren auf dem Wissen um die immunologischen und physiologischen Eigenschaften der haematopoetischen Stammzellen (METCALF 2001; MC CULLOCH 2003). Vor mehr als drei Dekaden identifizierte Friedenstein mesenchymale Stammzellen im Knochenmark (FRIEDENSTEIN et al. 1976). Inzwischen weiß man, dass sich diese Zellen in vitro unter geeigneten Kulturbedingungen in mindestens drei Zelllinien differenzieren können, osteogene, adipogene und chondrogene Linien (FRIEDENSTEIN et al. 1976; COLTER et al. 2001). Mesenchymale Stammzellen stellen Zellen für Haematopoese und Angiogenese, sie bilden eine starke immunsupressive Aktivität aus, welche die Häufigkeit der graft-versus-host-disease (GvHD) nach allogener humaner Stammzell-Transplantation (HSC) reduziert (LE BLANC et al. 2004;
RINGDEN et al. 2006). Des Weiteren kommen MSCs bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen in der Klinik zum Einsatz (GERDONI et al. 2007; AUGELLO et al. 2007). Studien zeigten, dass Stammzelleinsatz nach Verletzungen einen positiven Effekt auf den Heilungsverlauf auf zellulärer Ebene auf Skelettmuskulatur, Hepatozyten, Neuronen, Epithel- und Endothelzellen sowie Kardiomyozyten ausübt (LAFLAMME u. MURRY 2005;
KRABBE et al. 2005; JIANG et al. 2002).
Mesenchymale Stammzellen zeigten sich in verschiedenen Studien als immunprivilegiert und sogar immunmodulatorisch (LE BLANC et al. 2003, 2004, 2006). MSCs sind über verschiedene Mechanismen in der Lage, die T-Zell-Reaktion des Empfängers zu unterdrücken
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(YANG et al. 2009). Mesenchymale Stammzellen sind aufgrund ihrer Eigenschaften nach bisherigem Kenntnisstand erfolgversprechende und zukunftsweisende Therapeutika zur Heilung vieler verschiedener Erkrankungen.
1.4 Methoden der Zellmarkierung, Zellverfolgung
Die bisher angewendeten Methoden zur Bestimmung der Lokalisation applizierter Stammzellen in vivo sind sehr begrenzt, sie umfassen die Markierung von Zellen mit Superparamagnetic iron oxide (SPIO) und das Bioluminescense imaging (BLI). Beide Methoden sind für eine klinische Anwendung nicht geeignet oder apparativ zu aufwändig und dienen der postoperativen Darstellung applizierter Zellen. Die gängigen Methoden der Histologie und Immunhistochemie sowie die Y-Chromosomenanalyse lassen ein Auffinden der applizierten Zellen in Gewebeproben zu, sind jedoch sehr zeitaufwändig und können nicht für eine Echtzeitdarstellung während der Applikation herangezogen werden.
1.5 Indocyaningrün (ICG)
Indocyaningrün findet in der Herz-, Kreislauf- und Mikrozirkulationsdiagnostik, aber auch in der Leberfunktionsdiagnostik sowie der Ophthalmologie Anwendung. Es dient der Messung von Kreislaufzeiten, des Herzvolumens und des Schlagvolumens, des enddiastolischen und endsystolischen Ventrikelvolumens, ferner der Messung des intrathorakalen Blutvolumens, des zirkulierenden Blutvolumens, partieller Volumina, wie dem Lungenblutvolumen, sowie der Messung von Organdurchblutungen und peripherer Durchblutungen (Pulsion ICG).
Für die Markierung von Zellen wurde ICG bis dato noch nicht angewendet, jedoch ist es ein für in vivo Messungen am Patienten zugelassener Farbstoff, der diagnostisch in einem breiten Feld von Indikationen Einsatz findet.
1.6 Tiere
Für die vorliegende Studie ist das Schweinemodell zur Beantwortung der Fragestellung am besten geeignet.
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Das Herz des Hausschweins ähnelt in seinem anatomischen Aufbau, seiner Physiologie und seiner Größe dem des Menschen. Durch diese Tatsache erklärt sich, dass das Schwein für zahlreiche, das Herz betreffende Studien herangezogen wird (CHOY u. KASSAB 2009;
RANAYAKA et al. 2009; SU et al. 2009). Komplexe Krankheitsbilder einer Arteriosklerose treten beim Schwein schon in einem Alter von etwa vier bis acht Jahren auf, was infolge der Haltung als Nutztier allerdings meist weit über der erreichten Lebensspanne der Tiere liegt (BICKHARDT 1988). Im Erkrankungsfall kommt es zu, mit dem Menschen vergleichbaren, ischämischen Veränderungen und Schäden im Bereich der Blutgefäße. Die Herzkranzgefäße des Schweines neigen, in noch geringerem Umfang als die des Menschen, zur Ausbildung von Kollateralgefäßen, was die Lokalisation und Eingrenzung von Infarktgebieten sowohl klinisch als auch im Tierversuch erleichtert. Durch diese Eigenschaften eignet sich das Schweineherz besonders gut als Modell zur Untersuchung menschlicher ischämischer Krankheitsbilder.
1.7 Ziel der Studie
Aus den eingangs genannten Erläuterungen, wird ersichtlich, dass die Applikation von mesenchymalen Stammzellen eine bereits angewandte Behandlungspraxis beim menschlichen Patienten darstellt und zukunftsweisend ist (STRAUER et al. 2002). Eine intraoperative Darstellung der injizierten Zellen in Echtzeit erleichtert dem Operateur die zeitnahe Beurteilung des Erfolges der Stammzellapplikation und ermöglicht somit noch intraoperativ eine Korrektur der Injektatmenge und somit der applizierten Gesamtzellzahl oder der Injektatplazierung durch erneute, fluoreszenzangiographisch überwachte Injektion.
In der vorliegenden Studie wurden die Markierung von Zellen mit ungiftigem Indocyaningrün und die Injektion von ICG-markierten Stammzellen durchgeführt.
Zusammenfassend werden folgende Fragen in der Arbeit diskutiert:
1. Gewinnung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark, deren Kultivierung und Charakterisierung
2. Markierung der Zellen mit ICG
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3. Applikationsrouten der Zellen in den Infarktbereich 4. Auffindbarkeit der Zellen während und nach Applikation
Ziel ist es, mit Hilfe der FA, fluoreszenzmarkierte Stammzellen während und direkt nach Injektion noch intraoperativ darzustellen, wobei die Lokalisation der injizierten Stammzellen bestimmt werden soll und eine semiquantitative Einschätzung der im Infarktgebiet verbleibenden Injektatmenge möglich sein soll. Die Zellen sollen durch ihre Markierung nicht in ihrer Funktion eingeschränkt werden.
Voraussetzung für eine erfolgreiche Stammzelltherapie zur Revitalisierung ischämisch vorgeschädigten Myokards ist die optimale Platzierung der Stammzellen im ischämischen Areal. Ein einfaches bildgebendes Nachweisverfahren für die zeitnahe, intraoperative Qualitätskontrolle der Applikation ist daher von großer Bedeutung für den Therapieerfolg.
Die Fluoreszenzangiographie soll als ein einfach anwendbares Verfahren zur Lokalisationsdiagnostik Indocyaningrün (ICG)-markierter Stammzellen ohne Kontrastmittel- und Strahlenbelastung für den Patienten oder die mit Farbstoff markierte, applizierte Zelle etabliert werden. Ein späterer klinischer Einsatz der hier beschriebenen Methode ist denkbar.
14 2 Material und Methoden
2.1 Tiere
2.1.1 Tierversuchsgenehmigung
Die artgerechte Pflege und Haltung der Versuchstiere erfolgte nach den Richtlinien des deutschen Gesetzblattes für Tierhaltung und Tierernährung; die Genehmigung nach §8 des Tierschutzgesetzes wurde durch die Behörde für Wissenschaft und Gesundheit der Freien und Hansestadt Hamburg erteilt. Die Nummer der Genehmigung zur Durchführung von Versuchen an Wirbeltieren ist Gz: G 21307/591-00.33; der Nachholantrag Nr.19/07 für 2 Tiere wurde ebenfalls genehmigt. Die Haltung und Pflege der Schweine wurden während ihres Aufenthalts durch die Versuchstierhaltung des Universitätsklinikums Hamburg Eppendorf gewährleistet.
Die Tierversuche sowie die Tötung der Tiere erfolgten unter Einhaltung der Richtlinien des Deutschen Tierschutzgesetzes vom 02.07.1972, mit letzter Änderung am 18.12.2007, und unterlagen der ständigen Kontrolle der zuständigen Ethikkomission.
2.1.2 Homologes Tiermodell
In dieser Studie wurde im Tiermodell eine homologe Transplantation von aus Knochenmark isolierten mesenchymalen Stammzellen durchgeführt. Anders als bei der autologen Transplantation wurden Zellen eines anderen Individuums appliziert. Der Spender und der Empfänger gehörten in den vorliegenden Versuchen der gleichen Spezies und auch derselben Hybridlinie an, unterschieden sich jedoch im Geschlecht.
2.1.3 Das Hausschwein: Sus Scrofa domestica
Das Schwein hat mit 0,3% des Körpergewichtes ein kleines relatives Herzgewicht und eine kurze relative Diastolendauer von 45% des Herzzeitzyklus, dem gegenüber stehen eine höhere Herzfrequenz und eine außerordentlich starke Kontraktilität des Myokards und so ein relativ hoher Blutdruck. Die Versorgung der Peripherie ist unter physiologischen Bedingungen gewährleistet. Eine Laufbelastung von 3 km/h wird vom Hausschwein für längere Zeit bei
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einer Herzfrequenz von über 200 Schläge/min toleriert, ohne dass es zu pathologischen Kreislauferscheinungen und metabolischer Acidose kommt. Die häufigen, von Kreislaufsymptomen begleiteten Todesfälle beim Schwein werden oft einer besonderen Disposition des Herz- und Kreislaufsystems zur Last gelegt. Diesen Todesfällen liegen primär meist andere Ursachen zugrunde, diese Primärstörungen führen im Zusammenwirken mit Herzüberbelastung (Tachykardie), kardialem Sauerstoffmangel (Anämie, Pneumonie) und Acidose sekundär zu einer Herzinsuffizienz und schließlich zum Schock. Die vergleichsweise seltenen organischen Herzveränderungen, wie angeborene Missbildungen, Pericarditis, Endocarditis valvularis oder Myocarddegeneration, bedingen unter Umständen unmittelbar eine Herzinsuffizienz. Bei 0,6% der geborenen Schweine treten connatal Herzdefekte auf, die bei etwa 80% der betroffenen Tiere letal sind. Bei diesen congenitalen Herzdefekten handelt es sich häufig um Septumdefekte im Vorkammer- und Kammerbereich oder um Stenosen im Bereich der Artrioventrikularklappen. Die betroffenen Ferkel verhalten sich auffällig ruhig und kümmern, oft sind Dyspnoe, Blässe, ein starker Herzspitzenstoß und ein systolisch- diastolisches Maschinengeräusch oder ein systolisches Geräusch feststellbar. Die Ferkel verenden meist innerhalb der ersten zwei Lebenswochen.
Das gesunde Mastschwein hat ohne Belastung eine Herzfrequenz von 80-100 Schlägen/min, es hat dabei eine Körpertemperatur von 38,5-39,1 °C und ein Plasma-Lactat von bis zu 11mmol/l, unter Belastung steigt die Herzfrequenz auf bis zu 270 Schläge/min an, die Körpertemperatur erhöht sich auf bis zu 40,5 °C, und die Laktatwerte können auf bis zu 13 mmol/l (bei extremer Belastung wie dem Deckakt) ansteigen (BICKHARDT 1988). Unter Normalbedingungen hat das Hausschwein einen Laktatwert von 0-11 mmol/l.
2.1.4 Versuchstiere in dieser Studie
In den Versuchen dieser Studie wurden 17 weibliche allogene Hausschweine (Sus scrofa domestica) mit einem Gewicht von 66 ± 23 kg verwendet. Es wurden für die Auswertung aus den auswertbaren Versuchen zwei Gruppen n = 5 gebildet.
Als Knochenmarkspender wurden männliche allogene Hausschweine (Sus scrofa domestica), die ein Gewicht von 67 ± 10kg hatten, verwendet.
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Bei den verwendeten Tieren handelt es sich um Masthybridschweine, die aus den Rassen Pietrain (Eber) und Deutsches Edelschwein (Sau) oder Deutsche Landrasse (Sau) erzeugt wurden. Die Schweine sind ursprünglich für die Mast gezüchtet worden, es handelt sich nicht um SPF-Tiere.
Die Tiere waren zum Zeitpunkt der Versuche frei von Krankheitsanzeichen und altersgemäß entwickelt. Sie nahmen an ihrer Umgebung teil, hatten eine rosige Hautfarbe und gut durchblutete Schleimhäute, sie hatten Normaltemperatur.
Abbildung 1: Schwein aufgestallt in der Versuchstierhaltung des UKE, mit Viehmarker markiert
Alle Hausschweine dieser Studie wurden von einer Tierzuchtanstalt in Lüneburg bezogen und nach Anlieferung in der Versuchstierhaltung des Universitätsklinikums Eppendorf tierärztlich untersucht. Die Eingewöhnungszeit betrug mindestens drei Tage. Zur Gewinnung von mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmark (BM-MSCs) wurden ausschließlich männliche Schweine verwendet. In den Infarktversuchen wurde mit weiblichen Tieren gearbeitet.
17 2.1.5 Knochenmarkgewinnung/ -isolierung
Die Haut eines frisch euthanasierten Schweines, das im Rahmen eines anderen Versuchsvorhabens in einem Finalversuch genutzt worden ist, wurde im Bereich der Beckenschaufel gewaschen und großzügig desinfiziert. Das Schwein hatte intraoperativ Heparin erhalten, was eine spätere Aspiration von Knochenmark in ausreichender Menge ermöglichte. Auf Höhe des kranialen Bereiches des Tuber coxae wurde mit einem sterilen Skalpell ein Hautschnitt gesetzt, die Muskulatur in dem Bereich wurde durchtrennt, um sich bis auf den Beckenknochen vorzupräparieren. Der kraniale Rand der Beckenschaufel wurde großzügig von der daran ansetzenden Muskulatur befreit. Mit einer sterilen Knochenmarkspunktionsnadel wurde unter Sicht die Lamina der Beckenschaufel im chondrogenen kranialen Teil durchstochen. Der Mandrin der Punktionsnadel wurde gezogen und mit einer 20ml Spritze, in der ein ml isotone NaCl-Lösung mit 250IE Heparin-Na vorgelegt war, wurde Knochenmark aspiriert. Das so gewonnene Knochenmarkaspirat wurde in ein 50ml Falcon Tube überführt.
Eine Entnahme von Knochenmark am lebenden Tier ist an gleicher Stelle auch beim narkotisierten Schwein unter Nutzung eines C-Bogens zwecks intraoperativer Bestimmung der Punktionsstelle ohne Hautschnitt möglich.
Am Schwein ist auch die Entnahme im caudalen Bereich des Tuber coxae bzw. an der Facies sacropelvina des Ala ossis ilii denkbar, wobei das Schwein hierzu in Bauchlage gebracht werden muss. Nach Palpation des Tuber coxae, die aufgrund der starken Bemuskelung im Kruppenbereich mit vergleichsweise starkem Druck erfolgen muss, kann dann von dorsal senkrecht mit einer langen Knochenmarkpuntionsnadel Knochenmark auf oben beschriebene Weise entnommen werden, ohne dass ein Hautschnitt nötig ist. Eine Punktion des Tuber sacrale, wie beim Hund üblich, ist am Schwein, wegen der schwachen Ausprägung dieses Beckenbereiches sowie der starken Muskelschichten, die ihn bedecken, nicht möglich.
Das Knochenmark wurde direkt nach der Gewinnung in dem fest verschlossenen 50 ml Falcon Tube auf Eis in das Labor verbracht.
18 2.1.6 Aufbereitung der Stammzellen
Die Sterilbank wurde eingeschaltet, für eine gründliche Desinfektion mit UV Licht für 15 min bestrahlt, und anschließend mit 80% Ethanol ausgesprüht und ausgewischt. Kulturmedium wurde angesetzt, hierzu wurden 500 ml DMEM mit 12% hitzeinaktiviertem FCS sowie 1%
Penicillin/Streptomycin versetzt. Das DPBS und das angesetzte Medium wurden bei 37 °C im Wasserbad erwärmt.
Das nach Punkt 2.1.5. gewonnene Knochenmark wurde im Labor nach äußerlicher Sprühdesinfektion des Falcon Tubes unter der Laminar Flow Bench durch eine sterile Pipette mehrfach aufgezogen und abgelassen, um es zu homogenisieren. Nun wurde das Knochenmarklysat eins zu eins mit DPBS-Lösung verdünnt. In einem weiteren 50 ml Falcon Tube wurde eine der Hälfte des verdünnten Knochenmarklysats entsprechende Menge an Ficoll-Paque® Plus (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) vorgelegt und das Knochenmarkslysat vorsichtig mit einer Pipette und der Nutzung eines Pipettboys bei niedrigster Geschwindigkeit aufgeschichtet.
Das im Verhältnis 2 Teile Knochenmarkslysat auf 1 Teil Ficoll-Paque® Plus gefüllte Falcon Tube wurde bei 800 rpm für 20 min ohne Bremse zentrifugiert.
Die Auftrennung des Knochenmarkes geschieht mittels Dichtegradientenzentrifugation (Abbildung 2) mit Ficol-Paque® Plus (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) nach Angaben des Herstellers. Das Prinzip beruht auf einer von Böyum (1968) entwickelten Methode. Die unterschiedliche Migration während der Zentrifugation aufgrund unterschiedlicher Dichten führt zur Bildung von Schichten verschiedener Zelltypen.
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Abbildung 2: Schematische Darstellung eines 50 ml Falcon Tubes vor Zentrifugation mit auf Ficoll-Paque® aufgeschichtetem Knochenmarklysat und nach Zentrifugation mit Phasentrennung durch die Dichtegradienten.
Nach der Zentrifugation sind die 4 einzelnen Phasen Plasma-Phosphatpuffer-Gemisch, Interphase mit mononukleären Zellen, Ficoll-Paque® Plus und Erythrozyten/Granulozyten/tote Zellen deutlich zu erkennen. Die Interphase der mononukleären Zellen wurde vorsichtig abpipettiert und im Verhältnis 1:10 mit DPBS-Puffer verdünnt. Die so verdünnte Zellsuspension wurde zunächst mit Hilfe eines Vortexers gründlich durchmischt und anschließend bei 1500 rpm für 10 min mit Bremse herunterzentrifugiert. Auf diese Weise wurden Reste des Ficoll-Paque® Plus entfernt und ein rein zelluläres Pellet erzeugt. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das Pellet in 10 ml DMEM Medium aufgenommen.
Für eine Zellzählung wurden 10 µl des Zellsuspensats mit 10 µl Trypanblau versetzt und in der Neubauerkammer ausgezählt. Trypanblau, auch als Benzaminblau oder Direkt Blau 14 bezeichnet, ist ein anionischer Diazofarbstoff. Der Grundkörper des Farbstoffes ist das o- Tolidin. Die Substanz wird in der Mikrobiologie für die Vitalfärbung von Zellen verwendet.
Trypanblau wird von lebenden Zellen nicht aufgenommen. In abgestorbene Zellen wird der Farbstoff dagegen durch die in ihrer Integrität gestörte Zellmembran aufgenommen und die
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Zellen werden dadurch dunkelblau angefärbt. Eine genauere Beschreibung der Zellzählung wird in Abschnitt 2.2.5.3 gegeben.
2.1.7 Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen
Für die Kultivierung von Zellen ist eine zelltyp- und tierartspezifische sowie eine den Bedingungen in dem jeweiligen Forschungslabor individuell angepasste Zusammensetzung des Kulturmediums nötig. Die, wie oben beschrieben, gewonnenen Zellen wurden in einem DMEM (Dubblecos Eagles modified Medium) Medium mit 12% hitzeinaktiviertem fetalem bovinen Serum (FBS, auch als FCS, fetal calf serum bezeichnet) und 1%
Penicillin/Streptomycin (P/S) ohne Zugabe anderer Zytokine kultiviert. Die Mediumzusammensetzung zeigte sich bereits bei anderen Arbeitsgruppen als gut zur Unterhaltung mesenchymaler Stammzellen geeignet.
Das wie oben beschriebene in 10 ml Medium resuspendierte Zellpellet wurde auf mehrere Zellkulturflaschen mit einer Bodenfläche von je 75 cm² verteilt, zu jeder Kulturflasche wurden weitere 8 ml Medium zugefügt. In jede Flasche wurden 1x105 Zellen vorgelegt, ein erster Mediumwechsel fand nach 24 Stunden statt, danach wurde das Medium in einem 72 Stundenrhythmus gewechselt. Der erste Mediumwechsel 24 h nach Inkulturbringen dient der Entfernung von Zellen, die während der Aufbereitung abgestorben sind. Zu Grunde gehende und tote Zellen setzten in Kultur verschiedene Substanzen, wie zum Beispiel Zytokine, in das Medium frei, die den apoptotischen Zelltod von bis dahin vitalen Zellen auslösen können.
Die Kultivierung der Zellen erfolgte in einem Wärmeschrank (Heraeus, Hanau, Hera cell 240) bei 37 °C und einem CO2 Gehalt von 5%. Es wurde sorgsam darauf geachtet, dass keine Schwankungen in den Kulturbedingungen vorkommen. Zur Begutachtung unter dem Mikroskop wurden die Zellkulturflaschen nur für kurze Zeit aus dem Wärmeschrank entnommen und schnellstmöglich wieder zurückverbracht.
Generell ist auch die Bebrütung der Zellen unter Normoxie in einem angepassten Medium möglich, jedoch wachsen sie im Hypoxieschrank schneller und differenzieren weniger schnell aus. Das Medium für die Zellkultur unter Normoxie muss zudem angepasst werden.
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Ein Mediumwechsel muss bei der Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen mindestens alle 72 h stattfinden. Dem in der vorliegenden Studie verwendeten Medium ist ein Indikator beigefügt, welcher von rot nach gelb umschlägt, wenn die Inhaltsstoffe des Mediums weitgehend verstoffwechselt sind und sich somit der Medium-pH-Wert ändert. Die Geschwindigkeit, in der das Medium verbraucht wird, steigt proportional mit der Dichte des Zellrasens in der Kulturflasche.
Für den Mediumwechsel wurden Medium und DPBS im Wasserbad auf eine Temperatur von 36-38 °C gebracht, anschließend wurde das alte Medium aus der Zellkulturflasche abgesaugt, wobei die adhärenten Zellen in der Flasche verblieben und abgestorbene, frei in der Flüssigkeit treibende Zellen mit entfernt werden. Es erfolgte zum Waschen der Zellen eine Zugabe von 10 ml DPBS, welches nach einer Minute wieder zu entfernen war. Zuletzt wurden 10 ml frischen Mediums hinzupipettiert.
Unter dem Mikroskop wurde das Wachstum der Zellen bei einer 100-fachen Vergrößerung regelmäßig bei jedem Mediumwechsel kontrolliert. Es ist in der Zellkultur von MSC wichtig, dass die Zellen nicht überkonfluent wachsen, da sie sonst ihre Morphologie ändern können.
Eine Veränderung der Antigenexprimierung ist bei überkonfluenten Zellen ebenfalls möglich.
Sobald die Zellen in der Kulturflasche annähernd konfluent (ca. 80-90%) waren, erfolgte eine Aufteilung (Passagieren, Splitten) in mehrere neue Zellkulturflaschen. Um die Zellen aus der Kulturflasche zu lösen, wurde das Medium abgesaugt und eine Waschung mit DPBS durchgeführt. Nach Zugabe von 2ml 0,05% Trypsin/EDTA erfolgte eine 5-minütige Inkubation bei 37 °C, wobei die Kulturflaschen zwischendurch vorsichtig gegen den Handballen geklopft wurden, um die Zellen dazu zu bringen sich abzukugeln und sich besser von dem Flaschenboden zu lösen. Um die Trypsinaktivität nach der Inkubation zu inhibieren, erfolgte eine Zugabe von 8 ml hitzeinaktiviertem FCS, durch die Eintrübung der Flüssigkeit war deutlich zu erkennen, dass die Zellen sich abgekugelt und von dem Boden der Kulturflasche gelöst hatten und in dem FCS gelöst vorlagen. Mit einem Zellschaber löste man zunächst die restlichen noch am Boden der Kulturflasche anhaftenden Zellen, die Zellsuspension wurde mit einer Pipette in 15 ml Falcon Tubes überführt und für 5min bei 1500 rpm abzentrifugiert. Unter dem Mikroskop wurde die erfolgreiche Entnahme der Zellen
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aus der Zellkulturflasche überprüft. Nach Verwerfen des Überstandes lag das Zellpellet vor und wurde im Anschluss zweimal mit DPBS (Dubblecos phosphate buffered saline) gewaschen. Hierzu resuspendierte man das Pellet mit je 10 ml DPBS, zentrifugierte es erneut ab, wobei wiederum der Überstand verworfen wurde, um die Zellen von Trypsin- und FCS- Resten zu befreien. Das so gereinigte Pellet wurde in 1ml des mit FCS und P/S versetzten DMEM-Medium aufgenommen und die Zellen wurden, wie unter Punkt 2.2.5.3 beschrieben, unter Anwendung der Neubauerkammer ausgezählt. Eine Verdünnung der Zellen fand nun in dem Maße statt, dass die Zellsuspension eine Konzentration von 4x105 Zellen pro ml hatte. Je ein ml des Suspensats wurde in eine neue Kulturflasche pipettiert, zu der im Anschluss 9 ml des angesetzten Kultur-Mediums hinzugefügt wurden.
Ist bei der mikroskopischen Begutachtung eine Veränderung der Zellmorphologie aufgefallen, so musste von einer spontanen Differenzierung der Zellen durch Noxen, wie Stress, durch falsch temperiertes Medium, überkonfluentes Wachstum oder ähnlichem ausgegangen werden. Unter Punkt 3.2.1 in der Datenerhebung wird näher auf die Gründe zum Verwerfen von Zellen eingegangen.
Da für die Versuche ausschließlich mesenchymale undifferenzierte Stammzellen verwendet werden sollten, wurden jegliche ausdifferenzierte oder morphologisch veränderte Zellen umgehend verworfen.
In den Passagen 4 und 5 gelangten die Zellen in den Versuch. Da sich im nativen Knochenmark neben den mesenchymalen Stammzellen nicht nur Vorgängerstadien der roten haematopoetischen Zellen, sondern auch der weißen Blutzellen, also der lymphatischen Linien befinden, und sich diese über mehrere Passagen in der Kultur halten können, wurde in den durchgeführten Versuchen mit den Passagen 4 und 5 eine spätere Passage gewählt.
Zudem nimmt auch mit steigender Passagennummer der Anteil an Gewebsmakrophagen in der Zellkultur ab.
Das Kryokonservieren von Zellen ist auch möglich, hierzu erfolgte eine Lösung der Zellen aus der Kulturflasche und zweimaliges Waschen, bis ein sauberes Pellet, wie beim Splitten beschrieben, vorlag. Das Pellet wurde dann in 1ml sogenanntem Kryomedium, bestehend aus hitzeinaktivierten FCS und 10% DMSO bei einer Temperatur von 4 °C gelöst. Die Zellen im
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Kryomedium wurden in Kryoröhrchen überführt und in mit Isopropanol (IPA, C3H8O) gefüllte Kryobehälter (Nalgene TM cryo 1 °C Freezing Container, Cat.No.5100-0001) gestellt. Der Kryobehälter wurde in einen -80 °C kalten Gefrierschrank gestellt, wobei das Isopropanol eine kontrollierte und zellschonende Abkühlung mit einem Temperaturabfall von 1 °C pro Minute bewirkt. Nach 24 h bei -80 °C wurden die Kryoröhrchen in einen Kühlbehälter mit flüssigem Stickstoff bei -196 °C umgelagert. Die so konservierten Zellen können über Jahre hinweg gelagert und jederzeit wieder aufgetaut und in Kultur gebracht werden. Da das Einfriermedium bei Temperaturen über 0 °C zelltoxisch ist, muss beim Einfrieren zügig gearbeitet werden, um die Zellen möglichst kurz dem toxischen Stress des DMSO (Dimethylsulfoxid) auszusetzen.
Zum Auftauen wurden die Kryoröhrchen aus dem flüssigen Stickstoff entnommen und zügig im Wasserbad bei 37 °C aufgetaut. Wegen der Zytotoxizität des DMSO in nichtgefrohrenem Zustand erfolgten umgehend eine Lösung der Zellsuspension in 10 ml hitzeinaktiviertem FCS, ein Mischen mit dem Vortexer und eine Zentrifugation bei 1500 rpm für 5 min. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen, wie beim Splitten beschrieben, in Kulturflaschen ausgebracht.
2.1.8 Charakterisierung der Zellen
Um den Nachweis zu treffen, dass es sich bei den vorliegenden, in der Studie verwendeten Zellen tatsächlich um mesenchymale Stammzellen handelt, war es notwendig eine Charakterisierung der Zellen durchzuführen. Zur Charakterisierung wurden drei verschiedene, in der Forschung gängige Methoden gewählt (DOMINICI et al. 2006). Nativ konnte eine lichtmikroskopische Beurteilung der Zellmorphologie vorgenommen werden, ein Differenzierungsassay wurde von einer kolaborierenden Forschungsgruppe, der AG Brunswig im Zentrum für molekulare Neurobiologie Hamburg (ZMNH) freundlicherweise durchgeführt, und eine FACS-Analyse hinsichtlich der Oberflächenantigene der Zellen wurde vorgenommen.
24 2.1.8.1 Beurteilung der Zellmorphologie
Die Zellen wurden lichtmikroskopisch bei einer 100-fachen Vergrößerung betrachtet. Hierbei wurde auf die in der Literatur genannten zellspezifischen Eigenschaften geachtet (PITTENGER et al. 1999). Mesenchymale Stammzellen entsprechen in ihrer Morphologie den Fibroblasten, zeigen eine Spindelform, sind mononukleär, adhäsiv zu Kunststoff und haben Selbsterneuerungspotential (REBELATTO et al. 2008).
2.1.8.2 Differenzierung
Für die Charakterisierung der aus Knochenmark gewonnenen Zellen wurde auch eine Differenzierungs-Kultivierung durchgeführt.
Es wurden jeweils die Adipogene Differenzierung, Chondrogene Differenzierung und Osteogene Differenzierung sowie eine Negativprobe durchgeführt. Die Färbung der differenzierten Zellen wurde mit zelllinienspezifischen Färbemethoden vorgenommen.
Chondrogene Differenzierung Färbung
Der Nachweis des Vorhandenseins chondrogener Zellen wurde mittels Alcian-Blau-Färbung vorgenommen. Die Chondrozyten sind rund und zeigen eine bläuliche Färbung.
Adipogene Differenzierung Färbung
Der Nachweis des Vorhandenseins adipogener Zellen wurde mittels Ölrot-O-Färbung erbracht. Ölrot O ist ein Farbstoff, der alle Lipide darstellt. In der Färbung nehmen Lipide eine rote Farbe an. In der Gegenfärbung mit Hämatoxillin stellen sich die Zellkerne blau dar, des Zytoplasma zeigt sich blassrosa.
Osteogene Differenzierung Färbung
Die osteogene Differenzierung wurde mittels Van-Kossa-Färbung dargestellt, bei dieser histologischen Färbung wird bei einer positiven Anfärbung der Probe der Nachweis kalkhaltiger Strukturen erbracht. Es handelt sich hierbei um eine Versilberung, bei der sich knöcherne Strukturen aufgrund ihres Kalkgehaltes schwarz darstellen. Eine positive Färbung
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nach Van Kossa erbrachte den Nachweis kalkhaltiger und kalkproduzierender Zellen und ist spezifisch für Osteoblasten.
Die Van-Kossa-Färbung ist eine Kombination aus einer Anfärbung mit Silbernitrat und einer Gegenfärbung mit Kernechtrot. Durch das Silbernitrat nehmen kalkhaltige Substanzen eine dunkelgraue bis tiefschwarze Farbe an. Mit der Kerngegenfärbung werden die nichtverkalkten Zellen, aber vor allem die Zellkerne sämtlicher Zellen, rötlich angefärbt.
Fotos der differenzierten Zellen zum Nachweis der noch vorhandenen Multipotenz, sowie dazugehörige Negativkontrollen sind im Ergebnisteil dieser Arbeit unter Punkt 3.2.2 zu finden.
2.1.8.3 FACS-Analyse
FACS-Geräte sind Laboranalysatoren, die die Fluoreszenz von Partikeln messen während diese von einem Laser bestrahlt durch ein Glasröhrchen fließen. Diese Geräte werden auch Durchflusszytometer genannt. FACS ist die Abkürzung für Fluorescence-Activated-Cell- Sorter.
Die Durchflusszytometrie ermöglicht das Zählen und die Analyse von physikalischen und molekularen Eigenschaften von Partikeln (Zellen, Kunststoffkügelchen, usw.) in einem Flüssigkeitsstrom. Eine Hauptanwendung besteht darin, mit Hilfe von fluoreszenzfarbstoff- markierten Proben (Antikörper, Rezeptoren, Streptavidin, usw.) bestimmte Eigenschaften von Zellen oder Zellpopulationen auf Einzelzellebene zu dokumentieren.
In dem FACS-Durchflusszytometer werden einzelne Zellen, die durch einen Laserstrahl hindurchströmen, erkannt und gezählt. (MURPHY et al. 2008) Diese Art von Durchflusszytometern werden genutzt, um die Eigenschaften von bestimmten Zellpopulationen darzulegen, die Identifikation wird mittels monoklonaler Antikörper, die an den Oberflächenproteinen der Zellen binden, durchgeführt. Bei Zellmischpopulationen, oder auch Reinkulturen, werden die zu messenden Zellen eines bestimmten Typs zunächst mit spezifischen monoklonalen Antikörpern markiert, die wiederum Fluoreszenzfarbstoffe tragen, oder mit spezifischen Antikörpern markiert, wonach ein weiterer Markierungsvorgang mit
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fluoreszenzfarbstoff-tragenden anti-immunglobulin Antikörpern folgt. Die Mischung aus antikörpermarkierten Zellen, die in einer Salzlösung (PBS/FACS-Puffer) suspendiert sind, wird durch eine Düse geleitet, wobei ein feiner Flüssigkeitsstrahl entsteht, der in Intervallen Zellen enthält. Bei der Passage jeder Zelle durch den im Gerät erzeugten Laserstrahl kommt es zu einer Streuung des Laserlichtes, wobei jedes an die Zelle gebundene Farbstoffmolekül angeregt wird und fluoresziert. Ein sehr sensitiver Photomultiplyer detektiert sowohl das gestreute Licht, welches Rückschlüsse auf Zellgröße und Granulation der Zelle zulässt, als auch das emittierte Licht der Fluoreszenz-Farbstoffmoleküle, woraus sich Informationen zur Bindung der farbstoffmarkierten monoklonalen Antikörper und demzufolge der Expression von Zelloberflächenproteinen ablesen lassen. Die fluoreszenzaktivierte Zellanalyse ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen. Grundlage ist eine Antigen-Antikörper-Reaktion, die mit fluoreszenzfarbstoff- markierten Antikörpern durchgeführt wird.
Abbildung 3: Stilisierte Zellen (blau, gelb und rot dargestellt) mit gebundenen farbstofftragenden Antikörpern (grün dargestellt), die durch das FACS-Gerät geführt werden (Quelle: Molecular Station; www.molecularstation.com)
Zur Analyse werden die Zellen einer Einzelzellsuspension durch hydrodynamische Fokussierung, wie an einer Perlenkette, an einem gebündelten Laserstrahl geeigneter Wellenlänge vorbeigeleitet (Abbildungen 7 + 8). Die gewählte Wellenlänge des Lichtes richtet sich nach dem Farbstoff, mit dem der zum Nachweis genutzte Antikörper konjugiert
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ist. Der konjugierte Farbstoff emittiert, angeregt durch den Laserstrahl ein Lichtsignal spezifischer Wellenlänge, das von Photosensoren detektier wird.
Abbildung 4: Stilisiert wird hier die Messung innerhalb des FACS-Gerätes dargestellt, die Zellen werden einzeln mit Laserlicht bestrahlt und emittieren einen Lichtstrahl, der detektiert wird (Quelle: Molecular Station;
www.molecularstation.com)
Auf dem Bildschirm des an das Gerät angeschlossenen Computers wird die detektierte Fluoreszenz als Punktediagramm (Abbildung 9) dargestellt. Innerhalb der Punktewolke können einzelne Zellpopulationen unterschieden werden. Mit Hilfe verschiedener Analyseprogramme ist es möglich, die Zellen als Histogramm darzustellen und verschiedene Messungen untereinander zu vergleichen.
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Abbildung 5: Exemplarische Darstellung eines Wolkenhistogrammes, jeder Punkt entspricht einem detektierten Luchtsignal (Quelle: Molecular Station; www.molecularstation.com)
Eine weitere Funktion des FACS-Gerätes ist das Sortieren von Zellen, wodurch es möglich ist, eine bestimmte Zellpopulation aus einer Zellmischpopulation zu isolieren. In dem Cell Sorter werden die Signale, die der Computer ausliest genutzt, um eine elektrische Aufladung zu erzeugen, die von der Düse durch den sie durchfließenden Flüssigkeitsstrom geleitet wird.
An der Stelle, an der der Flüssigkeitsstrom in eine Tröpfchenwolke aufbricht, und jeder Tropfen maximal eine Zelle beinhaltet, können alle Tröpfchen, die eine Ladung haben, während der Passage durch den Zwischenraum zwischen zwei Platten entgegengesetzter Ladung von dem Hauptstrom gezielt abgelenkt werden. Die positiv geladenen Tröpfchen werden von der negativ geladenen Platte angezogen und die negativ geladenen Tröpfchen von der positiv geladenen Platte. Auf diese Art können bestimmte Subpopulationen von Zellen, die sich durch die Bindung von markierten Antikörpern charakterisieren lassen, aus einer Mischpopulation von Zellen purifiziert werden.
Die Messungen, die im FACS-Gerät durchgeführt werden, müssen nicht zwangsweise mit einem Cell Sorter kombiniert sein. In dem FACS-Gerät befindet sich ein ständiger Fluß einer Trägerflüssigkeit (sheath fluid), in der die Probe in Form einer Zellsuspension in FACS- Puffer gelöst eingebracht wird. Durch die höhere Strömungsgeschwindigkeit der Trägerflüssigkeit werden die Zellen vereinzelt und in einer fixen Position am Laserlicht
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vorbeigeführt. Das Argon-Laserlicht führt zu einer Exitation der Fluoreszenzfarbstoffe, die wiederum Fluoreszenzlicht emittieren, das durch verschiedene Photozellen detektiert wird.
Wenn zu untersuchende Proben von Zellen mit einem einzigen Fluoreszenzantikörper gekennzeichnet sind, werden die Daten des Durchflusszytometers üblicherweise in Form eines Histogrammes dargestellt, in dem die Fluoreszenzintensität der Zellzahl gegenübergestellt wird. Werden zwei oder mehr Antikörper verwendet, an die jeweils unterschiedliche Fluoreszenzfabstoffe gekoppelt sind, werden die erhobenen Daten üblicherweise als zweidimensionales Wolkendiagramm oder als Konturdiagramm dargestellt, in dem die Fluoreszenz des einen farbstofftragenden Antikörpers der eines anderen gegenübergestellt wird. Bei dem Wolkendiagramm kann also die Zellpopulation, die mit einem Antikörper gelabelt ist, weiterhin durch seine Bindungseigenschaften mit einem zweiten Antikörper unterteilt werden. Durch die Messung großer Zellzahlen kann das Durchflusszytometer also eine quantitative Aussage über die prozentuale Verteilung von Zellen, die verschiedene Oberflächenmoleküle exprimieren, geben. So können beispielsweise Oberflächen-Immunglobuline, die B-Zellen charakterisieren, T-Zellrezeptor assoziierte Moleküle, wie CD3, und die CD4 und CD8 Co-rezeptorproteine, die sich auf T-Zellen befinden, bestimmt werden. Bei den modernen Geräten ist eine Messung auf bis zu 5 Kanälen möglich. Des Weiteren sind eine Vielzahl gelabelter und ungelabelter Antikörper erhältlich, die an Oberflächenmoleküle verschiedenster Zellen binden können, was eine Identifizierung bestimmter Zelltypen zulässt.
In der vorliegenden Studie wurde die FACS-Analyse genutzt, um spezifische Oberflächenmoleküle von mesenchymalen Stammzellen des Schweines nachzuweisen.
Bei der Auswahl der Antikörper war es wichtig, für den zu untersuchenden Zelltyp gängige Marker zu wählen, die durch einen positiven oder negativen Nachweis Rückschlüsse auf die Zellpopulation zulassen. Die Marker müssen eine Aussage über das Freisein der Zellkultur von hematopoetischen Zellen treffen, des Weiteren sollen auf mesenchymalen Stammzellen spezifische Oberflächen-Antigene nachweisbar sein. Die Auswahl der Marker geschah nach Literaturangaben (DELORME u. CHARBORD 2007). Hieraus ging hervor, dass purifizierte mesenchymale Stammzellen des Schweines positiv für MHC I, CD105 und CD90 und negativ
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für CD14 und CD45 sind. Bei der Auswahl des Antikörpers war vor allem die Eignung für das Schwein als Spezies relevant. Um die Messungen möglichst gut vergleichen zu können und den apparativen Messaufwand gering zu halten, wurde außerdem darauf geachtet, dass alle Antikörper als Label FITC (Fluoreszeinisothiocyanat) hatten. Der untenstehenden Tabelle 1 ist zu entnehmen, welche Antikörper Verwendung fanden.
Tabelle 1: Angaben zu den verwendeten Antikörpern
Antikörper Spezies Klon Isotyp Label Erwartetes
Ergebnis
CD 45 Maus-anti pig 252-1E4 IgG1 FITC -
MHC I Maus-anti porcine JM1E3 IgG2ß FITC +
CD 90 Maus-anti pig 5E10 IgG1κ FITC +
CD 105 Maus-anti human (Pig Kreuzreaktiv)
MEM-229 IgG2α +
CD 14 Maus-anti human (Pig Kreuzreaktiv)
TüK4 IgG2α FITC -
Zu den jeweiligen Antikörpern wurden die in der Tabelle genannten Isotypkontrollen gemessen. Es kann je nach Zellart und Färbeprotokoll zu unspezifischen Bindungen der Antikörper kommen, weshalb parallel zur eigentlichen Messung der Probe Isotypenkontrollen durchgeführt werden müssen, auf die das Messergebnis anschließend normiert wird. Bei den Isotypen handelt es sich um Antikörper des gleichen Subtyps wie der spezifische Antikörper, mit dem Unterschied, dass die Isotypenkontrolle gegen ein Antigen gerichtet ist, das auf der Zelle nicht exprimiert ist. Viele Zellen zeigen auch eine gewisse Eigenfluoreszenz, die durch das Färben möglicherweise noch verstärkt wird. Um falschpositiven Ergebnissen vorzubeugen, wird die Isotypenkontrolle quasi als Leerwert betrachtet und vom Ergebnis der Probe abgezogen.
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Probenaufbereitung: Die Zellen wurden nach der 2. Passage, als sie annähernd konfluent gewachsen waren, wie unter Punkt 2.2.5.3 beschrieben, aus der Kulturflasche gelöst. Nun wurde das Zellsuspensat in drei Schritten gewaschen. Zunächst geschah dies mit reinem FCS, um das Trypsin zu inhibieren, dann folgte eine Waschung mit DMEM-Medium und eine weitere mit DPBS pH 7,4, um die Probe vom Medium zu reinigen, die Zentrifugation wurde bei jedem Schritt bei 1500 rpm für 5 min durchgeführt. Das nach dem letzten Waschschritt erhaltene Pellet wurde in 1 ml FACS-Puffer gelöst. Die Zellen wurden in der Neubauerkammer, wie unter Punkt 2.2.5.3 beschrieben, ausgezählt. Mit FACS-Puffer (Zusammensetzung wird unten beschrieben) wurde die Zellsuspension so verdünnt, dass die Zellen in einer Konzentration von 1x107 Zellen/ml vorlagen. Der FACS-Puffer besteht aus DPBS (Gibco 14190), 2% hitzeinaktiviertem FCS und 0,1% NaN3.
Für den FACS-Ansatz wurden je 100 µl der im FACS-Puffer gelösten Zellen, also 1x106 Zellen in 1 ml Eppendorf-Tubes vorgelegt. Es wurden mehrere verschiedene gelabelte und ungelabelte Antikörper für die Analyse verwendet.
1. Die nicht gelabelten Antikörper und Isotypkontrollen (CD 105, IgG2a) wurden in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration zu den vorgelegten Zellen pipettiert und für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubationsphase wurde der Ansatz mit 500 µl FACS-Puffer gewaschen und bei 3000 rpm für 3 min abzentrifugiert, der Überstand wurde verworfen. In einem nächsten Schritt wurde das vom Hersteller empfohlene Volumen des Sekundärantikörpers (F(ab)2-FITC) (gelabelt) hinzugefügt und erneut für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Es schloss sich ein weiterer Waschschritt mit 500 µl FACS- Puffer an. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand erneut verworfen und im Anschluss wurde das Pellet in 500 µl FACS-Puffer gelöst. FITC steht für Fluoreszeinisothiozyanat.
2. Die FITC gelabelten Antikörper wurden zu den vorgelegten 100 µl Zellsuspension in der vom Hersteller empfohlenen Menge zugegeben und bei Raumtemperatur im Dunkeln für 20 min inkubiert. Nach der Inkubation wurden die FACS-Ansätze mit 500 µl FACS-Puffer gewaschen und bei 3000 rpm für 3 min abzentrifugiert, das Pellet wurde anschließend in 500 µl FACS-Puffer aufgenommen.
