4 Diskussion
4.3 Vorversuche (Protokoll, Probleme, Rückschlüsse für die Hauptversuche)
4.4.2 Gruppe II: Intracoronare Applikation
In dieser Gruppe fand eine Applikation von Zellen über die das Infarktgebiet versorgenden arteriellen (i.co.) Wege statt.
Verglichen mit der intramyokardialen Injektion lagen hier nach der Applikation deutlich größere Zellmengen im Ischämiegebiet vor. Das bildgebende Verfahren der Fluoreszenzangiographie ließ bei dieser Applikationsroute keinen Verdacht der venösen Abschwemmung des Injektats zu. Es konnte kein erkennbarer optischer Hinweis auf ein Ausschwemmen der Zellen aus dem Infarktgebiet gewonnen werden. Die Injektion geschah intra arteriell, was dazu führte, dass es nicht zu einer Ansammlung von Injektat im Bereich der Applikationsstelle kam.
Zu bedenken ist bei dieser Applikationsroute jedoch, dass die injizierten Zellen vermutlich im Bereich des kapillären Endstromgebietes, der das Herzgewebe versorgenden Blutgefäße, zum Liegen kommen. Die mesenchymalen Stammzellen des Schweines haben in der abgekugelten Form, in der sie appliziert werden, einen Durchmesser von wenigen µm, die Kapillaren haben in ihren feinsten Verästelungen einen Durchmesser, der geringer ist als die Größe der MSCs.
Der Verdacht eines Verlegens der Kapillaren liegt damit nahe, es ist demnach fraglich, ob der Blutfluss durch das Herzgewebe nach intracoronarer Stammzellapplikation weiterhin gegeben ist. Es besteht daraus resultierend die Befürchtung der Entstehung von Mikroinfarzierungen
97
im Bereich des Herzmuskels, da sich das Blut auf arteriellem Wege sammeln könnte und durch die Verlegung der ableitenden Wege eventuell nicht mehr abfließen kann. Innerhalb der Nachbeobachtungsphase der Versuche konnte kein Hinweis auf eine Störung des Herzens durch verstopfte Kapillaren gewonnen werden. Makroskopisch zeigten sich die Herzen unauffällig, es kam zu keiner unerwarteten Verfärbung im Randgebiet des Infarktes. Eine abschließende Beantwortung der Frage nach nachhaltiger applikationsbedingter Schädigung des Herzens war im Rahmen der vorliegenden Studie nicht möglich, da es sich um Finalversuche handelte.
In der Nachbeobachtungsphase der Versuche, die sich im Anschluss an die Zellapplikation über zwei Stunden erstreckte, konnte kein Hinweis auf eine Blutansammlung im Zuge multipler Mikroinfarzierungen im Infarktgebiet beobachtet werden. Die Fluoreszenz und somit das Vorhandensein der Zellen, konnte zu jedem Messzeitpunke post Applikationem deutlich dargestellt werden.
Die hämodynamischen Parameter waren während der Nachbeobachtungsphase konstant oder haben sich wieder stabilisiert. Bei der Gegenüberstellung der gemessenen Ergebnisse der hämodynamischen Parameter konnte kein Unterschied zwischen den beiden Versuchsgruppen hinsichtlich einer unterschiedlich starken Messwertschwankung während oder nach der Zellapplikation festgestellt werden.
Aus den Ergebnissen der Versuche lässt sich die intracoronare Stammzellapplikation als für den Heilungsprozess am nachhaltigsten deuten. Es liegen hier bei im Ausgang gleicher Injektatmenge mehr Zellen im Ischämiegebiet vor, die zudem homogener über das Infarktareal verteilt sind.
Für eine intraoperative Beurteilung zeigte sich die Verwendung der FA-Technik und die Markierung von Zellen mit Indocyaningrün als sehr gut geeignet.
98 5 Zusammenfassung
Mandy Stubbendorff: Lokalisationsdiagnostik markierter Stammzellen mittels Fluoreszenzangiographie am Schweineherz in vivo
Die Applikation mesenchymaler Stammzellen gilt als geeignete Therapieform für Patienten mit ischämischen Myokardschäden. Durch die Stammzelltherapie nach Myokardinfarkt besteht die Hoffnung, die Herzfunktion nachhaltig verbessern zu können und die durch Narbengewebe bedingten Folgeerscheinungen des Herzinfarktes zu lindern. Bisher gibt es für die Überwachung der therapeutischen Stammzellapplikation kein etabliertes Verfahren, das eine Echtzeitdarstellung der Zellapplikation ermöglicht.
Die Versuche wurden am Schweinemodell durchgeführt. Diese Doktorarbeit beschäftigte sich im Speziellen mit der intraoperativen Bildgebung zur Echtzeitlokalisation der injizierten mesenchymalen Stammzellen sowie mit der geeigneten Platzierung der applizierten Stammzellen. Die Stammzellapplikation fand auf zwei unterschiedlichen Applikationsrouten statt. In einer Versuchsgruppe wurden die Zellen intramyokardial injiziert, in der zweiten Gruppe fand eine intracoronare Applikation statt. Die Markierung von mesenchymalen Stammzellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff Indocyaningrün stellt weiterhin einen wesentlichen Bereich dieser Arbeit dar.
Es ist hier gelungen, mesenchymale Stammzellen aus Knochenmark zu isolieren, eindeutig zu charakterisieren und mit dem ungiftigen Farbstoff ICG (Indocyaningrün) zu markieren. Die Zellen wurden für die Applikation vorbereitet und ließen sich zu jedem Zeitpunkt des Tierversucher fluoreszenzangiographisch darstellen.
Die intraoperative Bildgebung und Darstellung der Stammzellen zeigt eindrucksvoll, wie sich das Zellsuspensat während und direkt nach einer Applikation routenabhängig verhält. Eine deutliche Restfluoreszenz ist während der Nachbeobachtungsphase gut zu erkennen, die Darstellbarkeit der Zellen verlängert sich durch den im Zellleib befindlichen Farbstoff ICG.
Das ICG verlässt die Zelle nur langsam und wird dann hepatobiliär unverändert ausgeschieden.
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Für die Zukunft ist die Fluoreszenzmarkierung von zu transplantierenden Zellen mit ICG als vielversprechende Methode für die intraoperative Überwachung der Applikation anzusehen.
Für Fragestellungen, die eine intraoperative Darstellung einer Zellapplikation benötigen, ist die Flouriszenzangiographie ein zukunftsweisendes bildgebendes Verfahren.
Mit der Entwicklung eines OP-tauglichen Kamerasystems zur Echtzeitbildübertragung ist es dem Operateur dann möglich, Parameter, wie das venöse Abfließen des Injektats, zu beurteilen, die individuell im Patienten unterschiedlich sein können und in ihrem Einfluss auf das Operationsergebnis nicht von dem operativen Können des Chirurgen abhängen.
Die Fluoreszenzangiographie als Weg der intraoperativen Darstellung von Zellen kann als geeignete Methode angesehen werden und ist auf eine Vielzahl anderer Operationsmethoden mit Stammzellanwendung übertragbar.
100 6 Summary
Mandy Stubbendorff: Lokalisation of marked stem cells via fluoreszenzangiography on pigs heart in vivo
The application of mesenchymal stem cells is a newly used therapy for patients suffering from ischemic myocardial injury. Stem cell therapy after myocardial infarction gives new hope to alleviate the consequences of myocardial ischemia and to increase the function of the heart by forming a tissuereplacement for the myocytes that died. So far there is no method to give real time images to show therapeutical application of stem cells.
All experiments were performed in pigs. This doctoral thesis is about an intraoperative method to detect the applied stem cells. The labelling of mesenchymal stem cells using indocyanine green dye (ICG) is an important part of this study. Two routes of stem cell application have been shown in the experiments. In one experimental group, the cells were injected intramyocardial, in a second group an intracoronary application was performed.
Mesenchymal stem cells could be isolated from bone marrow and were than characterized and labelled using ICG.
The intraoperative fluorescent detection shows an impressive way how the cells behave while and directly after cell application according to the route of application chosen.
For cell labelling and use in future stem cell therapies the use of ICG dye is a promising method.
With the development of a convenient OR usable camera system, the surgeon is then able to see in the surgery if another stem cell application is indicated in the patient to have a sufficient amount of cells in the infarction zone.
The fluorescent angiographic detection of cells is a good method for stem cell application and could be applied in many other stem cell therapies.
101
102 7 Abkürzungsverzeichnis
ACS Akutes Koronarsyndrom (acute coronar syndrom) AMI Acute myocardial infarction
ATP Adenosin triphosphat
CCD Charge coupeled device Kamerasystem CD Cluster of Differentiation
Cl- Chloridanion
CWL Lichtfilter
DMEM Dubleccos Modified Eagles Medium DMSO Dimethyl sulfoxid
DPBS Dubleccos Phosphate Buffered Saline dyn Krafteinheit 1dyn = 10-5N
EDTA ethylendiamintetraessigsäure EKG Elektrokardiographie
ER Endoplasmatisches Retikulum FA Fluoreszenz Angiographie FACS Fluorescence activated cell sorter FCS Fetal Calf Serum
FITC Fluoresceinisothiocyanat FWHM Lichtfilter
G gage
GvHD Graft versus Host Disease H2O2 Wasserstoffperoxid
h Stunde/Stunden
Hb Hämoglobin
HF Herzfrequenz
HI Herzindex
HLA Human Lymphocyte Antigenpresenting molecule HZV Herzzeitvolumen
103
l Liter
LA Linksartrialer Druck
LAD Left anterior descending coronary artery LV linker Ventrikel
MAD Mittlerer arterieller Druck MAP Mittlerer arterieller Druck
MHC Major Histocompatibility Complex
min Minute Pa CO2 Arterieller CO2-Partialdruck Pv CO2 Venöser CO2-Partialdruck
Pa O2 Arterieller Sauerstoff-Partialdruck Pv O2 Venöser Sauerstoff-Partialdruck PAMP Pulmonalarterieller Druck PCR Polimerase Kettenreaktion
PiCCO Pulscontour Continous Cardiac Output
PTPRC Proteine thyrosine phosphatase receptor type C PVR Peripherer Gefäßwiderstand
RA rechtes Atrium
RIVA Ramus intraventricularis paraconalis der A. coronaria sinistra rpm rounds per minute
RRd diastolischer Blutdruck RRs systolischer Blutdruck SPF Spezifisch pathogenfrei SPIO Superparamagnetic iron oxide SPSS Statistical Software Package Std Stunde/Stunden
SV Schlagvolumen
SVC Sinus venosus coronarius Sv O2 Venöse Sauerstoffsättigung SVR Systemischer Gefäßwiderstand
TnT Troponin T
ZMNH Zentrum für Molekulare Neurobiologie Hamburg ZVD Zentralvenöser Druck
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