Ziel der Studie

Aus den eingangs genannten Erläuterungen, wird ersichtlich, dass die Applikation von mesenchymalen Stammzellen eine bereits angewandte Behandlungspraxis beim menschlichen Patienten darstellt und zukunftsweisend ist (STRAUER et al. 2002). Eine intraoperative Darstellung der injizierten Zellen in Echtzeit erleichtert dem Operateur die zeitnahe Beurteilung des Erfolges der Stammzellapplikation und ermöglicht somit noch intraoperativ eine Korrektur der Injektatmenge und somit der applizierten Gesamtzellzahl oder der Injektatplazierung durch erneute, fluoreszenzangiographisch überwachte Injektion.

In der vorliegenden Studie wurden die Markierung von Zellen mit ungiftigem Indocyaningrün und die Injektion von ICG-markierten Stammzellen durchgeführt.

Zusammenfassend werden folgende Fragen in der Arbeit diskutiert:

1. Gewinnung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark, deren Kultivierung und Charakterisierung

2. Markierung der Zellen mit ICG

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3. Applikationsrouten der Zellen in den Infarktbereich 4. Auffindbarkeit der Zellen während und nach Applikation

Ziel ist es, mit Hilfe der FA, fluoreszenzmarkierte Stammzellen während und direkt nach Injektion noch intraoperativ darzustellen, wobei die Lokalisation der injizierten Stammzellen bestimmt werden soll und eine semiquantitative Einschätzung der im Infarktgebiet verbleibenden Injektatmenge möglich sein soll. Die Zellen sollen durch ihre Markierung nicht in ihrer Funktion eingeschränkt werden.

Voraussetzung für eine erfolgreiche Stammzelltherapie zur Revitalisierung ischämisch vorgeschädigten Myokards ist die optimale Platzierung der Stammzellen im ischämischen Areal. Ein einfaches bildgebendes Nachweisverfahren für die zeitnahe, intraoperative Qualitätskontrolle der Applikation ist daher von großer Bedeutung für den Therapieerfolg.

Die Fluoreszenzangiographie soll als ein einfach anwendbares Verfahren zur Lokalisationsdiagnostik Indocyaningrün (ICG)-markierter Stammzellen ohne Kontrastmittel- und Strahlenbelastung für den Patienten oder die mit Farbstoff markierte, applizierte Zelle etabliert werden. Ein späterer klinischer Einsatz der hier beschriebenen Methode ist denkbar.

14 2 Material und Methoden

2.1 Tiere

2.1.1 Tierversuchsgenehmigung

Die artgerechte Pflege und Haltung der Versuchstiere erfolgte nach den Richtlinien des deutschen Gesetzblattes für Tierhaltung und Tierernährung; die Genehmigung nach §8 des Tierschutzgesetzes wurde durch die Behörde für Wissenschaft und Gesundheit der Freien und Hansestadt Hamburg erteilt. Die Nummer der Genehmigung zur Durchführung von Versuchen an Wirbeltieren ist Gz: G 21307/591-00.33; der Nachholantrag Nr.19/07 für 2 Tiere wurde ebenfalls genehmigt. Die Haltung und Pflege der Schweine wurden während ihres Aufenthalts durch die Versuchstierhaltung des Universitätsklinikums Hamburg Eppendorf gewährleistet.

Die Tierversuche sowie die Tötung der Tiere erfolgten unter Einhaltung der Richtlinien des Deutschen Tierschutzgesetzes vom 02.07.1972, mit letzter Änderung am 18.12.2007, und unterlagen der ständigen Kontrolle der zuständigen Ethikkomission.

2.1.2 Homologes Tiermodell

In dieser Studie wurde im Tiermodell eine homologe Transplantation von aus Knochenmark isolierten mesenchymalen Stammzellen durchgeführt. Anders als bei der autologen Transplantation wurden Zellen eines anderen Individuums appliziert. Der Spender und der Empfänger gehörten in den vorliegenden Versuchen der gleichen Spezies und auch derselben Hybridlinie an, unterschieden sich jedoch im Geschlecht.

2.1.3 Das Hausschwein: Sus Scrofa domestica

Das Schwein hat mit 0,3% des Körpergewichtes ein kleines relatives Herzgewicht und eine kurze relative Diastolendauer von 45% des Herzzeitzyklus, dem gegenüber stehen eine höhere Herzfrequenz und eine außerordentlich starke Kontraktilität des Myokards und so ein relativ hoher Blutdruck. Die Versorgung der Peripherie ist unter physiologischen Bedingungen gewährleistet. Eine Laufbelastung von 3 km/h wird vom Hausschwein für längere Zeit bei

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einer Herzfrequenz von über 200 Schläge/min toleriert, ohne dass es zu pathologischen Kreislauferscheinungen und metabolischer Acidose kommt. Die häufigen, von Kreislaufsymptomen begleiteten Todesfälle beim Schwein werden oft einer besonderen Disposition des Herz- und Kreislaufsystems zur Last gelegt. Diesen Todesfällen liegen primär meist andere Ursachen zugrunde, diese Primärstörungen führen im Zusammenwirken mit Herzüberbelastung (Tachykardie), kardialem Sauerstoffmangel (Anämie, Pneumonie) und Acidose sekundär zu einer Herzinsuffizienz und schließlich zum Schock. Die vergleichsweise seltenen organischen Herzveränderungen, wie angeborene Missbildungen, Pericarditis, Endocarditis valvularis oder Myocarddegeneration, bedingen unter Umständen unmittelbar eine Herzinsuffizienz. Bei 0,6% der geborenen Schweine treten connatal Herzdefekte auf, die bei etwa 80% der betroffenen Tiere letal sind. Bei diesen congenitalen Herzdefekten handelt es sich häufig um Septumdefekte im Vorkammer- und Kammerbereich oder um Stenosen im Bereich der Artrioventrikularklappen. Die betroffenen Ferkel verhalten sich auffällig ruhig und kümmern, oft sind Dyspnoe, Blässe, ein starker Herzspitzenstoß und ein systolisch-diastolisches Maschinengeräusch oder ein systolisches Geräusch feststellbar. Die Ferkel verenden meist innerhalb der ersten zwei Lebenswochen.

Das gesunde Mastschwein hat ohne Belastung eine Herzfrequenz von 80-100 Schlägen/min, es hat dabei eine Körpertemperatur von 38,5-39,1 °C und ein Plasma-Lactat von bis zu 11mmol/l, unter Belastung steigt die Herzfrequenz auf bis zu 270 Schläge/min an, die Körpertemperatur erhöht sich auf bis zu 40,5 °C, und die Laktatwerte können auf bis zu 13 mmol/l (bei extremer Belastung wie dem Deckakt) ansteigen (BICKHARDT 1988). Unter Normalbedingungen hat das Hausschwein einen Laktatwert von 0-11 mmol/l.

2.1.4 Versuchstiere in dieser Studie

In den Versuchen dieser Studie wurden 17 weibliche allogene Hausschweine (Sus scrofa domestica) mit einem Gewicht von 66 ± 23 kg verwendet. Es wurden für die Auswertung aus den auswertbaren Versuchen zwei Gruppen n = 5 gebildet.

Als Knochenmarkspender wurden männliche allogene Hausschweine (Sus scrofa domestica), die ein Gewicht von 67 ± 10kg hatten, verwendet.

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Bei den verwendeten Tieren handelt es sich um Masthybridschweine, die aus den Rassen Pietrain (Eber) und Deutsches Edelschwein (Sau) oder Deutsche Landrasse (Sau) erzeugt wurden. Die Schweine sind ursprünglich für die Mast gezüchtet worden, es handelt sich nicht um SPF-Tiere.

Die Tiere waren zum Zeitpunkt der Versuche frei von Krankheitsanzeichen und altersgemäß entwickelt. Sie nahmen an ihrer Umgebung teil, hatten eine rosige Hautfarbe und gut durchblutete Schleimhäute, sie hatten Normaltemperatur.

Abbildung 1: Schwein aufgestallt in der Versuchstierhaltung des UKE, mit Viehmarker markiert

Alle Hausschweine dieser Studie wurden von einer Tierzuchtanstalt in Lüneburg bezogen und nach Anlieferung in der Versuchstierhaltung des Universitätsklinikums Eppendorf tierärztlich untersucht. Die Eingewöhnungszeit betrug mindestens drei Tage. Zur Gewinnung von mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmark (BM-MSCs) wurden ausschließlich männliche Schweine verwendet. In den Infarktversuchen wurde mit weiblichen Tieren gearbeitet.

17 2.1.5 Knochenmarkgewinnung/ -isolierung

Die Haut eines frisch euthanasierten Schweines, das im Rahmen eines anderen Versuchsvorhabens in einem Finalversuch genutzt worden ist, wurde im Bereich der Beckenschaufel gewaschen und großzügig desinfiziert. Das Schwein hatte intraoperativ Heparin erhalten, was eine spätere Aspiration von Knochenmark in ausreichender Menge ermöglichte. Auf Höhe des kranialen Bereiches des Tuber coxae wurde mit einem sterilen Skalpell ein Hautschnitt gesetzt, die Muskulatur in dem Bereich wurde durchtrennt, um sich bis auf den Beckenknochen vorzupräparieren. Der kraniale Rand der Beckenschaufel wurde großzügig von der daran ansetzenden Muskulatur befreit. Mit einer sterilen Knochenmarkspunktionsnadel wurde unter Sicht die Lamina der Beckenschaufel im chondrogenen kranialen Teil durchstochen. Der Mandrin der Punktionsnadel wurde gezogen und mit einer 20ml Spritze, in der ein ml isotone NaCl-Lösung mit 250IE Heparin-Na vorgelegt war, wurde Knochenmark aspiriert. Das so gewonnene Knochenmarkaspirat wurde in ein 50ml Falcon Tube überführt.

Eine Entnahme von Knochenmark am lebenden Tier ist an gleicher Stelle auch beim narkotisierten Schwein unter Nutzung eines C-Bogens zwecks intraoperativer Bestimmung der Punktionsstelle ohne Hautschnitt möglich.

Am Schwein ist auch die Entnahme im caudalen Bereich des Tuber coxae bzw. an der Facies sacropelvina des Ala ossis ilii denkbar, wobei das Schwein hierzu in Bauchlage gebracht werden muss. Nach Palpation des Tuber coxae, die aufgrund der starken Bemuskelung im Kruppenbereich mit vergleichsweise starkem Druck erfolgen muss, kann dann von dorsal senkrecht mit einer langen Knochenmarkpuntionsnadel Knochenmark auf oben beschriebene Weise entnommen werden, ohne dass ein Hautschnitt nötig ist. Eine Punktion des Tuber sacrale, wie beim Hund üblich, ist am Schwein, wegen der schwachen Ausprägung dieses Beckenbereiches sowie der starken Muskelschichten, die ihn bedecken, nicht möglich.

Das Knochenmark wurde direkt nach der Gewinnung in dem fest verschlossenen 50 ml Falcon Tube auf Eis in das Labor verbracht.

18 2.1.6 Aufbereitung der Stammzellen

Die Sterilbank wurde eingeschaltet, für eine gründliche Desinfektion mit UV Licht für 15 min bestrahlt, und anschließend mit 80% Ethanol ausgesprüht und ausgewischt. Kulturmedium wurde angesetzt, hierzu wurden 500 ml DMEM mit 12% hitzeinaktiviertem FCS sowie 1%

Penicillin/Streptomycin versetzt. Das DPBS und das angesetzte Medium wurden bei 37 °C im Wasserbad erwärmt.

Das nach Punkt 2.1.5. gewonnene Knochenmark wurde im Labor nach äußerlicher Sprühdesinfektion des Falcon Tubes unter der Laminar Flow Bench durch eine sterile Pipette mehrfach aufgezogen und abgelassen, um es zu homogenisieren. Nun wurde das Knochenmarklysat eins zu eins mit DPBS-Lösung verdünnt. In einem weiteren 50 ml Falcon Tube wurde eine der Hälfte des verdünnten Knochenmarklysats entsprechende Menge an Ficoll-Paque^® Plus (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) vorgelegt und das Knochenmarkslysat vorsichtig mit einer Pipette und der Nutzung eines Pipettboys bei niedrigster Geschwindigkeit aufgeschichtet.

Das im Verhältnis 2 Teile Knochenmarkslysat auf 1 Teil Ficoll-Paque^® Plus gefüllte Falcon Tube wurde bei 800 rpm für 20 min ohne Bremse zentrifugiert.

Die Auftrennung des Knochenmarkes geschieht mittels Dichtegradientenzentrifugation (Abbildung 2) mit Ficol-Paque^® Plus (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) nach Angaben des Herstellers. Das Prinzip beruht auf einer von Böyum (1968) entwickelten Methode. Die unterschiedliche Migration während der Zentrifugation aufgrund unterschiedlicher Dichten führt zur Bildung von Schichten verschiedener Zelltypen.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung eines 50 ml Falcon Tubes vor Zentrifugation mit auf Ficoll-Paque^® aufgeschichtetem Knochenmarklysat und nach Zentrifugation mit Phasentrennung durch die Dichtegradienten.

Nach der Zentrifugation sind die 4 einzelnen Phasen Plasma-Phosphatpuffer-Gemisch, Interphase mit mononukleären Zellen, Ficoll-Paque^® Plus und Erythrozyten/Granulozyten/tote Zellen deutlich zu erkennen. Die Interphase der mononukleären Zellen wurde vorsichtig abpipettiert und im Verhältnis 1:10 mit DPBS-Puffer verdünnt. Die so verdünnte Zellsuspension wurde zunächst mit Hilfe eines Vortexers gründlich durchmischt und anschließend bei 1500 rpm für 10 min mit Bremse herunterzentrifugiert. Auf diese Weise wurden Reste des Ficoll-Paque^® Plus entfernt und ein rein zelluläres Pellet erzeugt. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das Pellet in 10 ml DMEM Medium aufgenommen.

Für eine Zellzählung wurden 10 µl des Zellsuspensats mit 10 µl Trypanblau versetzt und in der Neubauerkammer ausgezählt. Trypanblau, auch als Benzaminblau oder Direkt Blau 14 bezeichnet, ist ein anionischer Diazofarbstoff. Der Grundkörper des Farbstoffes ist das o-Tolidin. Die Substanz wird in der Mikrobiologie für die Vitalfärbung von Zellen verwendet.

Trypanblau wird von lebenden Zellen nicht aufgenommen. In abgestorbene Zellen wird der Farbstoff dagegen durch die in ihrer Integrität gestörte Zellmembran aufgenommen und die

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Zellen werden dadurch dunkelblau angefärbt. Eine genauere Beschreibung der Zellzählung wird in Abschnitt 2.2.5.3 gegeben.

2.1.7 Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen

Für die Kultivierung von Zellen ist eine zelltyp- und tierartspezifische sowie eine den Bedingungen in dem jeweiligen Forschungslabor individuell angepasste Zusammensetzung des Kulturmediums nötig. Die, wie oben beschrieben, gewonnenen Zellen wurden in einem DMEM (Dubblecos Eagles modified Medium) Medium mit 12% hitzeinaktiviertem fetalem bovinen Serum (FBS, auch als FCS, fetal calf serum bezeichnet) und 1%

Penicillin/Streptomycin (P/S) ohne Zugabe anderer Zytokine kultiviert. Die Mediumzusammensetzung zeigte sich bereits bei anderen Arbeitsgruppen als gut zur Unterhaltung mesenchymaler Stammzellen geeignet.

Das wie oben beschriebene in 10 ml Medium resuspendierte Zellpellet wurde auf mehrere Zellkulturflaschen mit einer Bodenfläche von je 75 cm² verteilt, zu jeder Kulturflasche wurden weitere 8 ml Medium zugefügt. In jede Flasche wurden 1x10⁵ Zellen vorgelegt, ein erster Mediumwechsel fand nach 24 Stunden statt, danach wurde das Medium in einem 72 Stundenrhythmus gewechselt. Der erste Mediumwechsel 24 h nach Inkulturbringen dient der Entfernung von Zellen, die während der Aufbereitung abgestorben sind. Zu Grunde gehende und tote Zellen setzten in Kultur verschiedene Substanzen, wie zum Beispiel Zytokine, in das Medium frei, die den apoptotischen Zelltod von bis dahin vitalen Zellen auslösen können.

Die Kultivierung der Zellen erfolgte in einem Wärmeschrank (Heraeus, Hanau, Hera cell 240) bei 37 °C und einem CO₂ Gehalt von 5%. Es wurde sorgsam darauf geachtet, dass keine Schwankungen in den Kulturbedingungen vorkommen. Zur Begutachtung unter dem Mikroskop wurden die Zellkulturflaschen nur für kurze Zeit aus dem Wärmeschrank entnommen und schnellstmöglich wieder zurückverbracht.

Generell ist auch die Bebrütung der Zellen unter Normoxie in einem angepassten Medium möglich, jedoch wachsen sie im Hypoxieschrank schneller und differenzieren weniger schnell aus. Das Medium für die Zellkultur unter Normoxie muss zudem angepasst werden.

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Ein Mediumwechsel muss bei der Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen mindestens alle 72 h stattfinden. Dem in der vorliegenden Studie verwendeten Medium ist ein Indikator beigefügt, welcher von rot nach gelb umschlägt, wenn die Inhaltsstoffe des Mediums weitgehend verstoffwechselt sind und sich somit der Medium-pH-Wert ändert. Die Geschwindigkeit, in der das Medium verbraucht wird, steigt proportional mit der Dichte des Zellrasens in der Kulturflasche.

Für den Mediumwechsel wurden Medium und DPBS im Wasserbad auf eine Temperatur von 36-38 °C gebracht, anschließend wurde das alte Medium aus der Zellkulturflasche abgesaugt, wobei die adhärenten Zellen in der Flasche verblieben und abgestorbene, frei in der Flüssigkeit treibende Zellen mit entfernt werden. Es erfolgte zum Waschen der Zellen eine Zugabe von 10 ml DPBS, welches nach einer Minute wieder zu entfernen war. Zuletzt wurden 10 ml frischen Mediums hinzupipettiert.

Unter dem Mikroskop wurde das Wachstum der Zellen bei einer 100-fachen Vergrößerung regelmäßig bei jedem Mediumwechsel kontrolliert. Es ist in der Zellkultur von MSC wichtig, dass die Zellen nicht überkonfluent wachsen, da sie sonst ihre Morphologie ändern können.

Eine Veränderung der Antigenexprimierung ist bei überkonfluenten Zellen ebenfalls möglich.

Sobald die Zellen in der Kulturflasche annähernd konfluent (ca. 80-90%) waren, erfolgte eine Aufteilung (Passagieren, Splitten) in mehrere neue Zellkulturflaschen. Um die Zellen aus der Kulturflasche zu lösen, wurde das Medium abgesaugt und eine Waschung mit DPBS durchgeführt. Nach Zugabe von 2ml 0,05% Trypsin/EDTA erfolgte eine 5-minütige Inkubation bei 37 °C, wobei die Kulturflaschen zwischendurch vorsichtig gegen den Handballen geklopft wurden, um die Zellen dazu zu bringen sich abzukugeln und sich besser von dem Flaschenboden zu lösen. Um die Trypsinaktivität nach der Inkubation zu inhibieren, erfolgte eine Zugabe von 8 ml hitzeinaktiviertem FCS, durch die Eintrübung der Flüssigkeit war deutlich zu erkennen, dass die Zellen sich abgekugelt und von dem Boden der Kulturflasche gelöst hatten und in dem FCS gelöst vorlagen. Mit einem Zellschaber löste man zunächst die restlichen noch am Boden der Kulturflasche anhaftenden Zellen, die Zellsuspension wurde mit einer Pipette in 15 ml Falcon Tubes überführt und für 5min bei 1500 rpm abzentrifugiert. Unter dem Mikroskop wurde die erfolgreiche Entnahme der Zellen

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aus der Zellkulturflasche überprüft. Nach Verwerfen des Überstandes lag das Zellpellet vor und wurde im Anschluss zweimal mit DPBS (Dubblecos phosphate buffered saline) gewaschen. Hierzu resuspendierte man das Pellet mit je 10 ml DPBS, zentrifugierte es erneut ab, wobei wiederum der Überstand verworfen wurde, um die Zellen von Trypsin- und FCS-Resten zu befreien. Das so gereinigte Pellet wurde in 1ml des mit FCS und P/S versetzten DMEM-Medium aufgenommen und die Zellen wurden, wie unter Punkt 2.2.5.3 beschrieben, unter Anwendung der Neubauerkammer ausgezählt. Eine Verdünnung der Zellen fand nun in dem Maße statt, dass die Zellsuspension eine Konzentration von 4x10⁵ Zellen pro ml hatte. Je ein ml des Suspensats wurde in eine neue Kulturflasche pipettiert, zu der im Anschluss 9 ml des angesetzten Kultur-Mediums hinzugefügt wurden.

Ist bei der mikroskopischen Begutachtung eine Veränderung der Zellmorphologie aufgefallen, so musste von einer spontanen Differenzierung der Zellen durch Noxen, wie Stress, durch falsch temperiertes Medium, überkonfluentes Wachstum oder ähnlichem ausgegangen werden. Unter Punkt 3.2.1 in der Datenerhebung wird näher auf die Gründe zum Verwerfen von Zellen eingegangen.

Da für die Versuche ausschließlich mesenchymale undifferenzierte Stammzellen verwendet werden sollten, wurden jegliche ausdifferenzierte oder morphologisch veränderte Zellen umgehend verworfen.

In den Passagen 4 und 5 gelangten die Zellen in den Versuch. Da sich im nativen Knochenmark neben den mesenchymalen Stammzellen nicht nur Vorgängerstadien der roten haematopoetischen Zellen, sondern auch der weißen Blutzellen, also der lymphatischen Linien befinden, und sich diese über mehrere Passagen in der Kultur halten können, wurde in den durchgeführten Versuchen mit den Passagen 4 und 5 eine spätere Passage gewählt.

Zudem nimmt auch mit steigender Passagennummer der Anteil an Gewebsmakrophagen in der Zellkultur ab.

Das Kryokonservieren von Zellen ist auch möglich, hierzu erfolgte eine Lösung der Zellen aus der Kulturflasche und zweimaliges Waschen, bis ein sauberes Pellet, wie beim Splitten beschrieben, vorlag. Das Pellet wurde dann in 1ml sogenanntem Kryomedium, bestehend aus hitzeinaktivierten FCS und 10% DMSO bei einer Temperatur von 4 °C gelöst. Die Zellen im

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Kryomedium wurden in Kryoröhrchen überführt und in mit Isopropanol (IPA, C₃H₈O) gefüllte Kryobehälter (Nalgene TM cryo 1 °C Freezing Container, Cat.No.5100-0001) gestellt. Der Kryobehälter wurde in einen -80 °C kalten Gefrierschrank gestellt, wobei das Isopropanol eine kontrollierte und zellschonende Abkühlung mit einem Temperaturabfall von 1 °C pro Minute bewirkt. Nach 24 h bei -80 °C wurden die Kryoröhrchen in einen Kühlbehälter mit flüssigem Stickstoff bei -196 °C umgelagert. Die so konservierten Zellen können über Jahre hinweg gelagert und jederzeit wieder aufgetaut und in Kultur gebracht werden. Da das Einfriermedium bei Temperaturen über 0 °C zelltoxisch ist, muss beim Einfrieren zügig gearbeitet werden, um die Zellen möglichst kurz dem toxischen Stress des DMSO (Dimethylsulfoxid) auszusetzen.

Zum Auftauen wurden die Kryoröhrchen aus dem flüssigen Stickstoff entnommen und zügig im Wasserbad bei 37 °C aufgetaut. Wegen der Zytotoxizität des DMSO in nichtgefrohrenem Zustand erfolgten umgehend eine Lösung der Zellsuspension in 10 ml hitzeinaktiviertem FCS, ein Mischen mit dem Vortexer und eine Zentrifugation bei 1500 rpm für 5 min. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen, wie beim Splitten beschrieben, in Kulturflaschen ausgebracht.

2.1.8 Charakterisierung der Zellen

Um den Nachweis zu treffen, dass es sich bei den vorliegenden, in der Studie verwendeten Zellen tatsächlich um mesenchymale Stammzellen handelt, war es notwendig eine Charakterisierung der Zellen durchzuführen. Zur Charakterisierung wurden drei verschiedene, in der Forschung gängige Methoden gewählt (DOMINICI et al. 2006). Nativ konnte eine lichtmikroskopische Beurteilung der Zellmorphologie vorgenommen werden, ein Differenzierungsassay wurde von einer kolaborierenden Forschungsgruppe, der AG Brunswig im Zentrum für molekulare Neurobiologie Hamburg (ZMNH) freundlicherweise durchgeführt, und eine FACS-Analyse hinsichtlich der Oberflächenantigene der Zellen wurde vorgenommen.

24 2.1.8.1 Beurteilung der Zellmorphologie

Die Zellen wurden lichtmikroskopisch bei einer 100-fachen Vergrößerung betrachtet. Hierbei wurde auf die in der Literatur genannten zellspezifischen Eigenschaften geachtet (PITTENGER et al. 1999). Mesenchymale Stammzellen entsprechen in ihrer Morphologie den Fibroblasten, zeigen eine Spindelform, sind mononukleär, adhäsiv zu Kunststoff und haben Selbsterneuerungspotential (REBELATTO et al. 2008).

2.1.8.2 Differenzierung

Für die Charakterisierung der aus Knochenmark gewonnenen Zellen wurde auch eine Differenzierungs-Kultivierung durchgeführt.

Es wurden jeweils die Adipogene Differenzierung, Chondrogene Differenzierung und Osteogene Differenzierung sowie eine Negativprobe durchgeführt. Die Färbung der differenzierten Zellen wurde mit zelllinienspezifischen Färbemethoden vorgenommen.

Chondrogene Differenzierung Färbung

Der Nachweis des Vorhandenseins chondrogener Zellen wurde mittels Alcian-Blau-Färbung vorgenommen. Die Chondrozyten sind rund und zeigen eine bläuliche Färbung.

Adipogene Differenzierung Färbung

Der Nachweis des Vorhandenseins adipogener Zellen wurde mittels Ölrot-O-Färbung erbracht. Ölrot O ist ein Farbstoff, der alle Lipide darstellt. In der Färbung nehmen Lipide eine rote Farbe an. In der Gegenfärbung mit Hämatoxillin stellen sich die Zellkerne blau dar, des Zytoplasma zeigt sich blassrosa.

Osteogene Differenzierung Färbung

Die osteogene Differenzierung wurde mittels Van-Kossa-Färbung dargestellt, bei dieser histologischen Färbung wird bei einer positiven Anfärbung der Probe der Nachweis kalkhaltiger Strukturen erbracht. Es handelt sich hierbei um eine Versilberung, bei der sich knöcherne Strukturen aufgrund ihres Kalkgehaltes schwarz darstellen. Eine positive Färbung

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nach Van Kossa erbrachte den Nachweis kalkhaltiger und kalkproduzierender Zellen und ist spezifisch für Osteoblasten.

Die Van-Kossa-Färbung ist eine Kombination aus einer Anfärbung mit Silbernitrat und einer Gegenfärbung mit Kernechtrot. Durch das Silbernitrat nehmen kalkhaltige Substanzen eine dunkelgraue bis tiefschwarze Farbe an. Mit der Kerngegenfärbung werden die nichtverkalkten Zellen, aber vor allem die Zellkerne sämtlicher Zellen, rötlich angefärbt.

Die Van-Kossa-Färbung ist eine Kombination aus einer Anfärbung mit Silbernitrat und einer Gegenfärbung mit Kernechtrot. Durch das Silbernitrat nehmen kalkhaltige Substanzen eine dunkelgraue bis tiefschwarze Farbe an. Mit der Kerngegenfärbung werden die nichtverkalkten Zellen, aber vor allem die Zellkerne sämtlicher Zellen, rötlich angefärbt.

Im Dokument Lokalisationsdiagnostik markierter Stammzellen mittels Fluoreszenzangiographie am Schweineherz in vivo (Seite 18-0)