In-vivo-Vorversuche

Mit der FA erfolgte bei allen Vorversuchen und Versuchen die Darstellung des Koronargefäßes LAD und seiner Seitenäste, da diese durch ihre anatomische Anordnung auf der Vorderwand des Herzens apparativ am besten erfasst werden können.

Die in den Vorversuchen angewendeten Operationsverfahren entsprechen den in den Hauptversuchen durchgeführten und im Folgenden unter Punkt 2.5.2 beschriebenen. Zum Zeitpunkt der Durchführung der Vorversuche war die Dauer der Nachbeobachtungsphase noch nicht konkret im Protokoll festgelegt. In den ersten beiden Vorversuchen kam der Herzschrittmacher noch nicht zum Einsatz. Ferner wurden in den Vorversuchen zum Teil beide für die Studie geplanten Applikationsrouten an einem Tier angewendet. Die Vorversuche dienten so zur Optimierung der Applikationsverfahren, auch hinsichtlich der Platzierung der Injektionen und des Venenverweilkatheters. Es wurden in kürzeren Intervallen sämtliche hämodynamischen Parameter kontrolliert und Blutgasanalysen durchgeführt. Das für die Versuche und Vorversuche angewendete Narkoseverfahren ist bereits in ähnlich aufgebauten Versuchen etabliert worden (WIPPER 2006) und konnte weitgehend übernommen werden.

42 2.4 Hauptversuche

2.4.1 In-vitro-Hauptversuch zur Zellverträglichkeit des ICG

In einem In-vitro-Versuch, in dem die Zellverträglichkeit von ICG dargestellt werden sollte, wurden 6 Versuchsgruppen mit n = 6 Zellkulturflaschen gewählt. Die 6 Gruppen unterschieden sich in der Passage, also dem Zellalter in Kultur. Innerhalb der Versuchsgruppen mit der Gruppengröße n = 6 blieben 50% unbehandelt, während die anderen 50% mit ICG beimpft wurden. Zur Auswertung erfolgte eine Auszählung der Zellzahl in der Neubauerkammer zu einem festgelegten Zeitpunkt.

Zur Herstellung möglichst identischer Bedingungen bei der vergleichenden Zellzählung wurde eine Vielzahl von Parametern festgelegt. Die Kulturflaschen wurden am Tag 0 der gewählten Passagen mit je 1 ml Zellsuspensat mit einer Konzentration von 4x10⁵ Zellen/ml beimpft und mit 9 ml DMEM-Medium, das mit 12% FCS und 1% P/S versetzt war, auf 10 ml aufgefüllt. Ein Mediumwechsel fand am darauffolgenden Tag und dann strikt an jedem dritten Tag statt, hierbei wurden die Zellen mit genau 10 ml PBS gewaschen und anschließend mit exakt 10 ml Kulturmedium versetzt. Bis zur Zellzählung wurde ein Zeitfenster von genau 10 Tagen eingehalten, dieses beruht auf der Erfahrung im Rahmen der im Versuch durchgeführten Zellkultur, dass die vorliegenden Zellen bei den für dieses Projekt festgelegten Bedingungen zu dem Zeitpunkt Tag 10 bei normaler Wachstumsgeschwindigkeit und Teilungsrate annähernd konfluent sind. Die Beimpfung der Zellkultur geschah 6 Tage vor Zellzählung, zeitgleich zum Mediumwechsel, zugefügt wurden 20 µl ICG pro 75 cm² Kulturflasche, also 2 µl ICG/ml Medium. Die Vergleichsproben wurden identisch gehandhabt, nur wurden hier nicht 20 µl ICG pro Kulturflasche, sondern 20 µl Aqua ad inj, in dem auch das ICG beim Ansetzen gelöst wird, pro Kulturflasche hinzupipettiert. Zur Zellzählung wurden die aus der Kulturflasche entnommenen Zellen in 1 ml PBS gelöst. Ein aliquot von 10 µl wurde mit 10 µl Trypanblau gemischt und in die Neubauerkammer eingebracht. In der Kammer wurden alle vier Eckquadrate wie unter Punkt 2.2.5.3 beschrieben ausgezählt, eine Summe und dann ein Mittelwert ermittelt, der dann zur Berechnung der Zellzahl herangezogen wurde. Das Ergebnis beschreibt nun Zellen pro ml, da

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alle Zellen aus der Kulturflasche gewonnen wurden, und auf 1 ml resuspendiert worden sind, ist das Ergebnis mit der Gesamtzellzahl in der Kulturflasche gleichzusetzen.

2.4.2 In vivo Hauptversuche

2.4.2.1 Versuchsaufbau OP Stammzellinjektion

Es wurden 17 Schweine weiblichen Geschlechts mit einem durchschnittlichen Gewicht von 66 kg ± 23kg in den Versuch genommen. Verglichen wurden 2 unterschiedliche Applikationsrouten der mesenchymalen Stammzellen. Die Tiere wurden in zwei Gruppen eingeteilt, Gruppe I intramyocardiale Applikation (n = 5) und Gruppe II intracoronare Applikation (n = 5).

2.4.2.2 Narkoseverfahren

Nach 12-stündiger Nahrungskarenz wurden die Tiere am Operationstag gewogen. Den nüchternen Tieren (66 kg ± 23 kg) wurden zur Prämedikation intramuskulär im Ohrgrundbereich (M. brachiocephalicus) Azaperon (Stresnil^®, Janssen Cilag GmbH, Neuss, 4 mg/kg KGW) und Midazolamhydrochlorid (Dormicum^® Roche Pharma AG, Grenzach Wyhlen, 0,3 mg/kg KGW) sowie Ketamin (Ketanest^® Pfizer Pharma GmbH, 5 mg/kg KGW) und Atropin (Atropinsulfat^® STADA GmbH, 0,15 mg/kg KGW) injiziert.

Über einen Venenverweilkatheter (Abbocath 20 G) in der V. Auricularis caudalis erfolgte die Narkoseeinleitung mit Pentobarbital (Narcoren^® Merial, 8 mg/kg KGW).

Das Schwein wurde aus den Räumlichkeiten für die Narkoseeinleitung in den Großtieroperationssaal transportiert.

Zur Aufrechterhaltung der Narkose und der vollständigen Analgesie wurden Fentanyl^® (Fentanyl-Janssen^® Janssen-Cilag GmbH, 0,01 mg/kg KGW/Std) und Midazolamhydrochlorid (Dormicum^® Roche Pharma AG, 0,1 mg/kg KGW/Std) mittels Perfusor^® fm (Braun Medical AG)kontinuierlich intravenös bis zum Versuchsende verabreicht.

Nach endotrachealer Intubation unter weitgehender Schonung der ventralen Halsmuskulatur, erfolgte eine Fixierung der Tiere in Rückenlage auf dem Operationstisch.

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Die volumenkontrollierte Beatmung erfolgte mit einem Puritan Bennett 7200 Ventilator System bei einer Sauerstoffkonzentration von 30% und einer Atemfrequenz von 16 Hüben pro Minute. Zur Überwachung und Sicherstellung einer adäquaten Oxygenierung wurden in im Versuchsprotokoll festgelegten, regelmäßigen Abständen arterielle und venöse Blutgasanalysen durchgeführt.

Über EKG-Elektroden wurde zu jedem Zeitpunkt die Herzfrequenz beobachtet.

Der Flüssigkeitsverlust wurde durch Volumensubstitution mit kristalloiden (NaCl 0,9%) und kolloidalen (HAES 6%) Infusionslösungen ausgeglichen. Das EKG wurde mit Hilfe eines 5-Kanal-Monitors kontinuierlich aufgezeichnet.

Am Ende des Versuches wurden die Tiere durch intravenöse Injektion von Pentobarbital (Narcoren^® Merial, 60 mg/kg) euthanasiert.

2.4.2.3 Chirurgische Maßnahmen

Venenverweilkatheter in beiden Vv. Auriculares caudales dienten der Gabe von Pentobarbital (Narcoren^® Merial) zur Narkoseeinleitung, sowie des Fluoreszenzfarbstoffs Indocyaningrün (ICG-Pulsion^®, Pulsion München). Weitere venöse Zugänge in der Leiste (V. epigastrica cranialis und V. epigastrica cranialis superficialis) dienten der Aufrechterhaltung der Narkose sowie der Gabe von Infusionslösungen zur Volumensubstitution.

Nach endotrachealer Intubation erfolgte durch die gleiche Inzision die chirurgische Freilegung der rechten Vena jugularis interna und der Arteria carotis communis.

Anschließend wurden eine 5-French-Schleuse (Intradyn venous hemostasis introducer, Braun Medical Incorporation) in die A. carotis interna sowie eine 8-French-Schleuse (Intradyn venous hemostasis introducer, Braun Medical Incorporation) in die V. jugularis gelegt. An beide Schleusen wurden Druckmessleitungen (DPS-Dreifach-Druckmess-System, Medex Medical, Lancashire, Großbritannien) angeschlossen. Über die arterielle Schleuse wurde der Blutdruck gemessen und Blut für die arterielle Blutgasanalyse entnommen. In die venöse Schleuse wurde ein PA-Katheter (Pulmonary artery thermodilution right ventricular ejection fraction catheter, Biosensors international, Hillegom, Niederlande) eingeschwemmt, des

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weiteren wurde sie zur Gewinnung von venösem Blut für die Blutgasanalyse genutzt. Der PA-Katheter (Pulmonalis-PA-Katheter nach Swan-Ganz) diente der Messung des Herzzeitvolumens (HZV), des pulmonalarteriellen Drucks (PA), des linksartrialen Drucks (LA), des mittleren arteriellen Drucks (MAD), des zentralvenösen Drucks (ZVD) sowie der Überwachung der Herzfrequenz (HF).

Zur zusätzlichen kontinuierlichen hämodynamischen Überwachung wurde die linke Arteria femoralis präpariert, um einen PiCCO Katheter (Pulscontour Continous Cardiac Output plus, Pulsion Medical Systems) einzubringen. Der arterielle PiCCO Katheter mit integriertem Thermistor wurde über den venösen Zugang in der Vena jugularis durch Injektion von für die Thermodilution nötiger kalter Kochsalzlösung (20ml NaCl temp < 4°C) kalibriert. Ein kontinuierliches Monitoring von Schlagvolumen (SV), Herzzeitvolumen (HZV), systemischem Gefäßwiderstand (SVR) sowie die arterielle Blutdruckmessung wurden mit Hilfe des PiCCO Systems durchgeführt.

Der Thorax wurde durch mediane Sternotomie unter gewissenhafter Blutstillung eröffnet. Es wurden die Knochenränder mit Knochenwachs verschlossen und ein Thoraxspreizer eingesetzt. Das Perikard wurde längs inzidiert und das Herz mit Perikardhochnähten exponiert, um die LAD (Left Anterior Descending coronary artery; Ramus interventricularis paraconalis der A. Coronaria sinistra) darzustellen. Durch vorsichtige stumpfe Präparation wurde eine Thymektomie vorgenommen und die Aa. mammariae internae wurden craniosternal ligiert und durchtrennt.

Für eine bessere hämodynamische Vergleichbarkeit wurde die Herzfrequenz, unter Zuhilfenahme eines Herzschrittmachers, auf 100 Schläge pro Minute eingestellt. Hierzu wurde das Ende des Schrittmacherkabels, an dem die elektrischen Impulse abgegeben werden, durch das linke Herzohr gelegt.

In Gruppe I (Abbildung 10) wurde mit einer umschlingenden U-Naht ein Seitenast der LAD (6-0 Prolene) umstochen, ein Pledget wurde auf dem Gefäß platziert und mit einem Torniquet fixiert. War das Infarktgebiet nicht groß genug, so wurde an einem weiteren, direkt benachbarten Seitenast der LAD auf die gleiche Weise ein weiterer Infarkt erzeugt. Ein

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deutliches Infarktareal resultierend aus zwei ligierten Seitenästen der LAD ist im folgenden Bild gezeigt.

Abbildung 10: Bläulich gefärbtes Infarktareal, arterielle Versorgung des Endstromgerbietes zweier Seitenäste der LAD durch Verschluss der Blutgefäße unterbunden

In Gruppe II (Abbildung 11) wurde das letzte Viertel LAD ebenfalls mit einer umschlingenden U-Naht umstochen, ein Pledget wurde auf dem Gefäß platziert und mit einem Torniquet fixiert. Als Resultat ist ein sich über die Herzspitze erstreckender Infarkt sichtbar.

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Abbildung 11: Ischämisches Areal an der Herzspitze, hervorgerufen durch Unterbinden der Blutzufuhr mittels Abbinden des distalen Viertels der LAD

Hier ist es nicht indiziert, ein weiteres Gefäß zu okkludieren, da mit Verschluss des letzten Viertels der LAD alle distal folgenden Seitenäste blutleer bleiben und das Infarkareal infolgedessen eine beachtliche Größe hat.

Nach einer Stunde Ischämiezeit wurde die das Gefäß verschließende Ligatur wieder gelöst.

Ein Öffnen des Torniquets musste langsam erfolgen, da es bei zu schnell einsetzender Reperfusion des Herzmuskelgewebes zu Herzrhythmusstörungen kommen kann.

In der Gruppe I erfolgte 30 min nach Einsetzen der Reperfusion eine intramyokardiale Zellapplikation, hierzu wurde das Zellsuspensat direkt im Ischämiegebiet in das Myokard injiziert. Bei der Injektion war es wichtig, mit der Nadel nicht zu tief in das Herzmuskelgewebe einzudringen, um eine Injektion in den Ventrikel zu vermeiden.

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In der Gruppe II wurde ebenfalls 30 min nach Reperfusion die Zellapplikation vorgenommen.

Hier wurde auf der Hälfte der Strecke der LAD ein Venenverweilkatheter in das Lumen der LAD gelegt. Über den Venenverweilkatheter wurde das Zellsuspensat in Richtung Herzspitze direkt arteriell appliziert. Nach der Applikation wurde der Katheter wieder entfernt.

Die Tiere beider Gruppen wurden nach Stammzellapplikation ohne weitere operative Eingriffe über die im Protokoll als Nachbeobachtungsphase festgelegte Dauer von zwei Stunden beobachtet.

Nach Euthanasie des Tieres wurde das Herz explantiert, hierzu wurden die Venae cavae cranialis und caudalis, sowie die Aorta und die Areteria pulmonalis, ligiert und durchtrennt.

Im Anschluss wurde das gesamte Herz aus dem Thorax entnommen.

Nach Versuchsende wurden bei allen Tieren folgende Gewebeproben entnommen: Myokard LV, Myokard aus dem Infarktgebiet, Lunge, Darmlymphknoten, Leber, Milz, Skelettmuskel.

Je eine Gewebeprobe wurde in 10%igem Formalin fixiert und eine in flüssigem Stickstoff gefroren und später bei -80 °C aufbewahrt.

2.4.2.4 Monitoring der hämodynamischen Parameter

Um standardisierte Versuchsbedingungen zu schaffen bzw. gewährleisten zu können, ist eine kontinuierliche hämodynamische Überwachung unabdingbar. In dieser Studie wurden das PiCCO- System (PiCCO Plus, Pulsion Medical Systems, München) und der Pulmonalis-Katheter nach Swan-Ganz verwendet, des weiteren wurde die Herzfrequenz mit einem Herzschrittmacher auf 100 Schläge pro Minute eingestellt.

2.4.2.5 Kontinuierliche Pulskonturanalysen mit dem PiCCO-System

Wie im Abschnitt chirurgische Maßnahmen beschrieben, sind für die Überwachung mittels PiCCO-System sowohl ein arterieller Zugang in der A. femoralis, in den der PiCCO-Katheter gelegt wurde, als auch ein zentraler venöser Zugang (V. jugularis), in den für die Kalibrierung physiologische Kochsalzlösung injiziert wird, geschaffen worden( Abbildung 12).

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Die Messmethode des PiCCO-Systems beruht auf dem Prinzip der Thermodilution, zur Kalibrierung werden 20 ml (definierte Menge) Kochsalzlösung mit einer Temperatur < 4 °C als thermischer Indikator in die V. jugularis injiziert. An dem Zugang in der V. jugularis wird die gekühlte Kochsalzlösung über einen Temperaturfühler injiziert und gemessen. Dem Blutfluss folgend wird die Flüssigkeit durch das rechte Atrium über den rechten Ventrikel in die Lungengefäße (transpulmonale Thermodilution), über das linke Atrium und den linken Ventrikel in die arterielle Blutbahn des Körperkreislaufes geleitet. In der A. femoralis wird dann die durch die kalte Kochsalzlösung hervorgerufene Temperaturveränderung durch den Thermistor des PiCCO-Katheters gemessen und auf dem Monitor als Druckkurve dargestellt.

Das Area under the curve des systolischen Abschnittes der Kurve ist dem Schlagvolumen gegenüber direkt proportional, welches multipliziert mit der Herzfrequenz das Herzzeitvolumen (HZV) ergibt. Nach der Kalibrierung wird die Pulskonturanalyse (GOEDJE et al. 2008) kontinuierlich abgelesen. Neben den gemessenen Werten Herzfrequenz, Schlagvolumen und Herzzeitvolumen werden die Parameter mittlerer arterieller Druck (MAD), der aus systolischem und diastolischem Blutdruck (RRs/RRd) resultiert, linksartrieller Druck (LA), mittlerer Pulmonalisdruck (MPD), systemischer und peripherer Widerstand (SVR und PVR), berechnet.

Das PiCCO-System (Abbildung 17) ermöglicht eine verlässliche Überwachung wichtiger hämodynamischer Parameter (STUBBE et al. 2006, GÖDJE et al. 1999).

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Abbildung 12: PiCCO System Übersicht (Quelle: Pulsion Medical Systems AG) Das System wird venös über einen Zugang an der V. Jugularis und arteriell über einen Zugang an der A. Femoralis intraluminal in die Blutgefäße eingebracht.

2.4.2.6 Hämodynamisches Monitoring via Swan-Ganz-Katheter

In die in der V. jugularis interna befindliche 8-French-Schleuse wurde zur Rechtsherzkatheterisierung ein Katheter nach Swan-Ganz (PV2047 VoLEF Catheter 7 F , Pulsion Medical Systems, München) mit einer Gesamtlänge von 110cm eingeschwemmt.

Durch den Blutstrom geführt wurde der Katheter unter Beobachtung des Druckpulses auf einem 5-Kanal-Monitor über den rechten Vorhof, den rechten Ventrikel so weit in die Pulmonalarterie vorgeschoben, bis die durch eine deutliche Änderung der Kurve auf dem Monitor erkennbare, so genannte „Wedge“-Position erreicht war. Die Wedge-Position ist durch einen Abfall des Mitteldruckes charakterisiert, hierbei dichtet der Katheter mit aufgeblasenem Ballon das Gefäßlumen der A. pulmonalis gänzlich ab (ZELLER et al. 2003).

Der in den Versuchen verwendete Rechtsherzkatheter hat eine Gesamtlänge von 110 cm, besitzt vier Kanäle und einen Ballon mit einem Fassungsvermögen von 1,5ml an der Spitze.

Bei korrekter Plazierung des Swan-Ganz-Katheters liegt dessen Spitze mit ihrem Ballon und der Öffnung des distalen Lumens in der A. pulmonalis („wedge“-Position, s.o.). Die Öffnung des proximalen Lumens, welche sich 29 cm vor der Katheterspitze befindet, liegt bei

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korrekter Katheterposition im rechten Vorhof. Die zur Kalibrierung des PiCCO-Systems benötigte kalte Flüssigkeit (20 ml NaCl) wurde dort als Bolus bei der Thermodilution in den Blutkreislauf des Tieres entlassen. Ein Temperaturfühler (Thermistor) befand sich dabei in dem Swan-Ganz-Katheter 3,5 cm von der Spitze entfernt. Mit dem Swan-Ganz-Katheter wurden folgende Parameter gemessen: Herzfrequenz (HF), systolischer, diastolischer, mittlerer arterieller Druck (MAP), zentralvenöser Druck (ZVD), systolischer, diastolischer, mittlerer pulmonalarterieller Druck (PAMP), Die Berechnung des HZV erfolgte durch Analyse der Veränderung der Bluttemperatur in der A. pulmonalis.

Aufgrund erhöhter Komplikationsraten wird der Swan-Ganz-Katheter (Abbildung 13) in der Intensivmedizin, abgesehen von Ausnahmeindikationen, zunehmend von weniger invasiven Verfahren abgelöst (STUBBE et al. 2006). In dem vorliegenden Versuchsvorhaben war der Katheter nach Swan-Ganz als Methode der Wahl anzusehen, da er ein zur Messung der hämodynamischen Parameter im Schweinemodell ethabliertes Verfahren darstellt.

Abbildung 13: Bestandteile des Katheters: Katheterspitze mit distalem Lumen und luftgefülltem Ballon, Zugang mit Ventil für Spritze mit 1,5 ml Volumen für Ballon, Katheter mit Markierungen, Zugang für das proximale Lumen , Zugang für das distale Lumen, Anschluss für HZV-Computer mit Verbindung zum Thermistor, Anschluss für Temperatursonde für das PiCCO-System (Quelle: A.Zowislo )

2.4.2.7 Blutgasanalyse arteriell und venös

Zu festgelegten Zeitpunkten des Versuches wurden über die French-Schleusen Blutproben aus der A. carotis interna und der V. jugularis entnommen.

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Vor Messbeginn wurde eine Blutgasanalyse durchgeführt, um die adäquate Oxygenierung, ausreichende Volumensubstitution und einen stabilen Elektrolytstatus zu überprüfen und eventuell korrigieren zu können. Erst im Anschluss an diese Messung, die der Optimierung der Parameter unter Narkose diente, wurde mit der Datenerhebung für das Versuchsvorhaben begonnen.

Es wurden weiterhin Blutentnahmen für die Blutgasanalyse zu den im Protokoll festgelegten Messzeitpunkten Baseline (T0), 55 Rest Fl (T3), 65min (T5), 85min (T6), 120min (T8), 210min (T11) entnommen. Mit dem Radiometer (Radiometer GmbH, Kopenhagen) wurden folgende Parameter bestimmt: arterieller und venöser Sauerstoffpartialdruck( Pa/Pv O²), arterieller und venöser CO²–Partialdruck (Pa/Pv CO²),die venöse Sauerstoffsättigung ( Sv O²), sowie der Blut-pH, der Hämoglobinwert (Hb), der HCO^3- -Wert, der Base Excess (BE), der Lactatspiegel, der Kalium(K⁺)- und der Natriumspiegel (N⁺).

2.5 Versuchsprotokolle 2.5.1 Vorversuche Tiere

In 3 Vorversuchen am Schwein wurden die Methoden der Injektion von ICG-markierten mesenchymalen Stammzellen über verschiedene Applikationsrouten am Herzen erprobt und das unten gezeigte und geschilderte Protokoll aus einem vorläufigen Protokoll erarbeitet und definiert. Die Vorversuche wurden ähnlich dem untenstehenden Protokoll für die Hauptversuche durchgeführt.

2.5.2 Hauptversuche Tiere

Die tierexperimentellen Untersuchungen wurden an 17 weiblichen Masthybridschweinen durchgeführt.

Die Darstellung der mit ICG markierten injizierten Stammzellen erfolgte mittels FA am schlagenden Herzen. Hierfür wurde das CCD-Kamerasystem in einem Abstand von 20 cm über der Herzoberfläche positioniert und fokussiert. Während der gesamten Messung war ein Lichtfilter dem Okular der Kamera vorgeschaltet.

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Die Datenerhebung der Hauptversuche wurde nach folgendem Versuchsprotokoll durchgeführt.

Tabelle 3: Versuchsprotokoll, T0-11: Messzeitpunkte, FA: Fluoreszenzangiographie, Rest FL: Restfluoreszenz, Rep:

Reperfusion, SZFA: Stammzellapplikation fluoreszenzangiographisch überwacht, HZV: Herzzeitvolumen, RR Blutdruck, MAD: mittlerer arterieller Blutdruck, HF: Herzfrequenz, ZVD: zentralvenöser Druck, LA: linksartrialer Druck, MPD:

mittlerer Pulmonalisdruck, SVR: systemischer Gefäßwidertand, BG: Blutgas Bestimmung, SVC: Sinus venosus coronarius, LV linker Ventrikel; RA: rechtes Atrium

Versuchsprotokoll Schwein SZ_______ Datum___________ Gewicht______ Ohrmarke ________ M / W

Time HZV RRs RRd MAD HF ZVD LA MPD SVR Laborentnahmen Sauerstoffgehalt, pH: Blut pH-Wert, K⁺: Kaliumgehalt

BGA FiO₂ P0₂ PCO₂ SVO₂ pH Lactat K⁺

Eine tabellarische Darstellung des Versuchsprotokolls ist in den Tabellen 3 und 4 gezeigt. Die Versuchsprotokolle für beide Versuchsgruppen unterschieden sich lediglich hinsichtlich der

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Lokalisation des Infarktes und der Applikationsroute des Zellsuspensats. Zunächst wurde nach Legen sämtlicher Zugänge, Einbringen der benötigten Schleusen und Eröffnung des Thorax sowie Freilegung des Herzens durch Eröffnen des Perikards und Exponierung mittels Perikardhochnähte, eine Baselinemessung durchgeführt. Der Baseline wurde der Zeitpunkt T0 zugeordnet, es wurden die Blutgaswerte (FiO2, PO2, PCO2, SVO2, pH, Laktat, Kalium) und hämodynamische Parameter (HZV, RRS, RRD, MAD, HF, ZVD, LA, MPD, SVR) bestimmt.

Nach Baselinemessung wurde der Infarkt, wie unter Punkt 2.5.2.3 beschrieben, mittels umschlingender U-Naht erzeugt. Die Größe und Lokalisation des Infarktes wurden dokumentiert. Eine erste Fluoreszenzangiographie wurde zum Zeitpunkt T1, 15 min nach Infarkterzeugung durchgeführt, hierzu wurde initial eine ICG Dosis von 0,06 mg/kg KG verwendet, die Applikation erfolgte über die Ohrvene des Tieres. Dies entspricht einer ICG Konzentration von 1,2 µM bei einer Blutmenge von 65 ml/kg KG beim Schwein. Zum Messzeitpunkt T2, 30 min nach Infarkterzeugung wurden wiederum die hämodynamischen Parameter bei bestehendem Infarkt bestimmt. Zum Messzeitpunkt T3, 55 min nach Infarkterzeugung wurden neben der Messung der hämodynamischen Parameter die Blutgaswerte bestimmt und mittels Fluoreszenzangiographie die Restfluoreszenz der ICG-Applikation von T1 aufgezeichnet. Zum Zeitpunkt T4 wurde die Reperfusionsphase 60 min nach Infarkterzeugung durch Eröffnen der ligierten Gefäße eingeleitet. Eine Bestimmung der hämodynamischen Parameter und eine Blutgasmessung fanden zum Messzeitpunkt T5, 5 min nach Öffnung des Infarktes statt. Zum Messzeitpunkt T6, 25 min nach Reperfusion wurden die hämodynamischen Parameter abgelesen und die Blutgase gemessen. Die Stammzellsuspension wurde auf 1 ml Spritzen aufgezogen und so für die Applikation im Schritt T7, 90 min nach Infarkterzeugung und 30 min nach Reperfusionsbeginn unter FA-Aufzeichnung intramyokardial (Gruppe I) oder intracoronar (Gruppe II), vorbereitet. Eine Blutgasanalyse wurde durchgeführt, und die hämodynamischen Parameter wurden bestimmt.

Nun folgten in 30 minütigem Abstand die Messzeitpunkte T8 bis T11, bei denen im Rahmen der Nachbeobachtung die hämodynamischen Parameter bestimmt wurden und fluoreszenzangiographisch der Verbleib der applizierten Zellen dokumentiert wurde. Weitere Blutgasanalysen fanden zu den Zeitpunkten T8 und T11 statt.

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In der ersten Gruppe (n = 5) wurden komplette Gefäßokklusionen an Seitenästen der LAD angelegt. Die Stenosen wurden durch U-Nähte erzeugt und mit einem Torniquet bis zum Verschluss angezogen.

Abbildung 14: Ödembildung im Infarktareal nach Reperfusion

Nach einer Okklusionsphase von einer Stunde wurde der infarzierte Bereich durch Öffnen der Okklusionsnähte reperfundiert. Die Stammzellsuspension wurde intramyokardial direkt durch intramuskuläre Injektion appliziert.

In der zweiten Gruppe (n = 5) wurde die Myokardperfusion bei okkludiertem distalen Viertel der LAD dargestellt.

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Abbildung 15: Infarkt an der Herzspitze, Reperfusionsphase, mit eingebrachtem Katheter zur Stammzellapplikation, das Infarktareal ist leicht bläulich gefärbt

Nach einer 30-minütigen Reperfusionsphase wurden die mit ICG markierten Stammzellen intrakoronar über einen in die Koronararterie LAD eingebrachten Venenverweilkatheter (Abbildung 15) arteriell appliziert.

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2.5.3 Probengewinnung im Rahmen der Tierversuche

Von verschiedenen Geweben wurden im Rahmen der in dieser Studie durchgeführten Tierversuche Proben gewonnen und asserviert. Die Gewebeproben sollen für eventuelle spätere Fragestellungen, die in ihrem Umfang über die hier vorgelegte Studie hinausgehen, konserviert werden.

Histologische Proben:

Tabelle 5: Histologische Proben, SZ: Stammzellapplikation, LV: linker Ventrikel, LK: Lymphknoten Organ Proben ID Zeit Kryo Paraffin Sonstiges

Bemerkungen: Skelettmuskel als Negativreferenz für SZ, gluteal Beckenkamm bds.

Nach dem Experiment wurden von dem euthanasierten Tier je zwei Proben von folgenden Geweben gewonnen: Lunge, Myokard LV, Myokard Infarkt, Lnn. jejunales, Leber, Milz und M. gracilis. Intraoperativ wurden vor Stammzellapplikation je zwei Proben des M. gracilis und der Lunge gewonnen. Eine der Gewebeproben wurde in 4% Formaldehyd (Formalin Roti- Histofix, Roth) konserviert und so für spätere Paraffinschnitte vorbereitet, die andere

Nach dem Experiment wurden von dem euthanasierten Tier je zwei Proben von folgenden Geweben gewonnen: Lunge, Myokard LV, Myokard Infarkt, Lnn. jejunales, Leber, Milz und M. gracilis. Intraoperativ wurden vor Stammzellapplikation je zwei Proben des M. gracilis und der Lunge gewonnen. Eine der Gewebeproben wurde in 4% Formaldehyd (Formalin Roti- Histofix, Roth) konserviert und so für spätere Paraffinschnitte vorbereitet, die andere

Im Dokument Lokalisationsdiagnostik markierter Stammzellen mittels Fluoreszenzangiographie am Schweineherz in vivo (Seite 47-0)