Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen

Für die Kultivierung von Zellen ist eine zelltyp- und tierartspezifische sowie eine den Bedingungen in dem jeweiligen Forschungslabor individuell angepasste Zusammensetzung des Kulturmediums nötig. Die, wie oben beschrieben, gewonnenen Zellen wurden in einem DMEM (Dubblecos Eagles modified Medium) Medium mit 12% hitzeinaktiviertem fetalem bovinen Serum (FBS, auch als FCS, fetal calf serum bezeichnet) und 1%

Penicillin/Streptomycin (P/S) ohne Zugabe anderer Zytokine kultiviert. Die Mediumzusammensetzung zeigte sich bereits bei anderen Arbeitsgruppen als gut zur Unterhaltung mesenchymaler Stammzellen geeignet.

Das wie oben beschriebene in 10 ml Medium resuspendierte Zellpellet wurde auf mehrere Zellkulturflaschen mit einer Bodenfläche von je 75 cm² verteilt, zu jeder Kulturflasche wurden weitere 8 ml Medium zugefügt. In jede Flasche wurden 1x10⁵ Zellen vorgelegt, ein erster Mediumwechsel fand nach 24 Stunden statt, danach wurde das Medium in einem 72 Stundenrhythmus gewechselt. Der erste Mediumwechsel 24 h nach Inkulturbringen dient der Entfernung von Zellen, die während der Aufbereitung abgestorben sind. Zu Grunde gehende und tote Zellen setzten in Kultur verschiedene Substanzen, wie zum Beispiel Zytokine, in das Medium frei, die den apoptotischen Zelltod von bis dahin vitalen Zellen auslösen können.

Die Kultivierung der Zellen erfolgte in einem Wärmeschrank (Heraeus, Hanau, Hera cell 240) bei 37 °C und einem CO₂ Gehalt von 5%. Es wurde sorgsam darauf geachtet, dass keine Schwankungen in den Kulturbedingungen vorkommen. Zur Begutachtung unter dem Mikroskop wurden die Zellkulturflaschen nur für kurze Zeit aus dem Wärmeschrank entnommen und schnellstmöglich wieder zurückverbracht.

Generell ist auch die Bebrütung der Zellen unter Normoxie in einem angepassten Medium möglich, jedoch wachsen sie im Hypoxieschrank schneller und differenzieren weniger schnell aus. Das Medium für die Zellkultur unter Normoxie muss zudem angepasst werden.

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Ein Mediumwechsel muss bei der Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen mindestens alle 72 h stattfinden. Dem in der vorliegenden Studie verwendeten Medium ist ein Indikator beigefügt, welcher von rot nach gelb umschlägt, wenn die Inhaltsstoffe des Mediums weitgehend verstoffwechselt sind und sich somit der Medium-pH-Wert ändert. Die Geschwindigkeit, in der das Medium verbraucht wird, steigt proportional mit der Dichte des Zellrasens in der Kulturflasche.

Für den Mediumwechsel wurden Medium und DPBS im Wasserbad auf eine Temperatur von 36-38 °C gebracht, anschließend wurde das alte Medium aus der Zellkulturflasche abgesaugt, wobei die adhärenten Zellen in der Flasche verblieben und abgestorbene, frei in der Flüssigkeit treibende Zellen mit entfernt werden. Es erfolgte zum Waschen der Zellen eine Zugabe von 10 ml DPBS, welches nach einer Minute wieder zu entfernen war. Zuletzt wurden 10 ml frischen Mediums hinzupipettiert.

Unter dem Mikroskop wurde das Wachstum der Zellen bei einer 100-fachen Vergrößerung regelmäßig bei jedem Mediumwechsel kontrolliert. Es ist in der Zellkultur von MSC wichtig, dass die Zellen nicht überkonfluent wachsen, da sie sonst ihre Morphologie ändern können.

Eine Veränderung der Antigenexprimierung ist bei überkonfluenten Zellen ebenfalls möglich.

Sobald die Zellen in der Kulturflasche annähernd konfluent (ca. 80-90%) waren, erfolgte eine Aufteilung (Passagieren, Splitten) in mehrere neue Zellkulturflaschen. Um die Zellen aus der Kulturflasche zu lösen, wurde das Medium abgesaugt und eine Waschung mit DPBS durchgeführt. Nach Zugabe von 2ml 0,05% Trypsin/EDTA erfolgte eine 5-minütige Inkubation bei 37 °C, wobei die Kulturflaschen zwischendurch vorsichtig gegen den Handballen geklopft wurden, um die Zellen dazu zu bringen sich abzukugeln und sich besser von dem Flaschenboden zu lösen. Um die Trypsinaktivität nach der Inkubation zu inhibieren, erfolgte eine Zugabe von 8 ml hitzeinaktiviertem FCS, durch die Eintrübung der Flüssigkeit war deutlich zu erkennen, dass die Zellen sich abgekugelt und von dem Boden der Kulturflasche gelöst hatten und in dem FCS gelöst vorlagen. Mit einem Zellschaber löste man zunächst die restlichen noch am Boden der Kulturflasche anhaftenden Zellen, die Zellsuspension wurde mit einer Pipette in 15 ml Falcon Tubes überführt und für 5min bei 1500 rpm abzentrifugiert. Unter dem Mikroskop wurde die erfolgreiche Entnahme der Zellen

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aus der Zellkulturflasche überprüft. Nach Verwerfen des Überstandes lag das Zellpellet vor und wurde im Anschluss zweimal mit DPBS (Dubblecos phosphate buffered saline) gewaschen. Hierzu resuspendierte man das Pellet mit je 10 ml DPBS, zentrifugierte es erneut ab, wobei wiederum der Überstand verworfen wurde, um die Zellen von Trypsin- und FCS-Resten zu befreien. Das so gereinigte Pellet wurde in 1ml des mit FCS und P/S versetzten DMEM-Medium aufgenommen und die Zellen wurden, wie unter Punkt 2.2.5.3 beschrieben, unter Anwendung der Neubauerkammer ausgezählt. Eine Verdünnung der Zellen fand nun in dem Maße statt, dass die Zellsuspension eine Konzentration von 4x10⁵ Zellen pro ml hatte. Je ein ml des Suspensats wurde in eine neue Kulturflasche pipettiert, zu der im Anschluss 9 ml des angesetzten Kultur-Mediums hinzugefügt wurden.

Ist bei der mikroskopischen Begutachtung eine Veränderung der Zellmorphologie aufgefallen, so musste von einer spontanen Differenzierung der Zellen durch Noxen, wie Stress, durch falsch temperiertes Medium, überkonfluentes Wachstum oder ähnlichem ausgegangen werden. Unter Punkt 3.2.1 in der Datenerhebung wird näher auf die Gründe zum Verwerfen von Zellen eingegangen.

Da für die Versuche ausschließlich mesenchymale undifferenzierte Stammzellen verwendet werden sollten, wurden jegliche ausdifferenzierte oder morphologisch veränderte Zellen umgehend verworfen.

In den Passagen 4 und 5 gelangten die Zellen in den Versuch. Da sich im nativen Knochenmark neben den mesenchymalen Stammzellen nicht nur Vorgängerstadien der roten haematopoetischen Zellen, sondern auch der weißen Blutzellen, also der lymphatischen Linien befinden, und sich diese über mehrere Passagen in der Kultur halten können, wurde in den durchgeführten Versuchen mit den Passagen 4 und 5 eine spätere Passage gewählt.

Zudem nimmt auch mit steigender Passagennummer der Anteil an Gewebsmakrophagen in der Zellkultur ab.

Das Kryokonservieren von Zellen ist auch möglich, hierzu erfolgte eine Lösung der Zellen aus der Kulturflasche und zweimaliges Waschen, bis ein sauberes Pellet, wie beim Splitten beschrieben, vorlag. Das Pellet wurde dann in 1ml sogenanntem Kryomedium, bestehend aus hitzeinaktivierten FCS und 10% DMSO bei einer Temperatur von 4 °C gelöst. Die Zellen im

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Kryomedium wurden in Kryoröhrchen überführt und in mit Isopropanol (IPA, C₃H₈O) gefüllte Kryobehälter (Nalgene TM cryo 1 °C Freezing Container, Cat.No.5100-0001) gestellt. Der Kryobehälter wurde in einen -80 °C kalten Gefrierschrank gestellt, wobei das Isopropanol eine kontrollierte und zellschonende Abkühlung mit einem Temperaturabfall von 1 °C pro Minute bewirkt. Nach 24 h bei -80 °C wurden die Kryoröhrchen in einen Kühlbehälter mit flüssigem Stickstoff bei -196 °C umgelagert. Die so konservierten Zellen können über Jahre hinweg gelagert und jederzeit wieder aufgetaut und in Kultur gebracht werden. Da das Einfriermedium bei Temperaturen über 0 °C zelltoxisch ist, muss beim Einfrieren zügig gearbeitet werden, um die Zellen möglichst kurz dem toxischen Stress des DMSO (Dimethylsulfoxid) auszusetzen.

Zum Auftauen wurden die Kryoröhrchen aus dem flüssigen Stickstoff entnommen und zügig im Wasserbad bei 37 °C aufgetaut. Wegen der Zytotoxizität des DMSO in nichtgefrohrenem Zustand erfolgten umgehend eine Lösung der Zellsuspension in 10 ml hitzeinaktiviertem FCS, ein Mischen mit dem Vortexer und eine Zentrifugation bei 1500 rpm für 5 min. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen, wie beim Splitten beschrieben, in Kulturflaschen ausgebracht.