3.9.1 Testprinzip
Die Methode beruht auf der Detektion veränderter Permeabilitätseigenschaften intakter und defekter Spermienmembranen. Die Kombination von zwei Fluoreszenzfarbstoffen mit unterschiedlichen spezifischen Bindungsstellen innerhalb der Zelle erlaubt die gleichzeitige Bestimmung der Integrität der Plasma- und der Akrosommembran der Spermien.
3.9.2 Gerät und Farbstoffe
Die Messungen wurden an einem Durchflusszytometer der Baureihe „Galaxy“ (Fa.
Partec, Münster) durchgeführt. Das Gerät war ausgestattet mit einem Argon-ionenlaser (488 nm; 20 mW) und drei verschiedenen Filtern: FL-1 (537,5/22,5 nm) für grünes Fluoreszenzlicht, FL-2 (590/25 nm) für oranges Fluoreszenzlicht und (630 nm LP) für rotes Fluoreszenzlicht. Die Steuerung erfolgte über die Software FloMax 2.0 (Fa. Partec, Münster).
Plasmamembranintakte und -defekte Zellen wurden durch Propidiumjodid (PI, Fa.
Sigma-Aldrich, Steinheim) differenziert. Dies ist ein Fluoreszenzmarker, der an doppelsträngige DNA und RNA (TAS u. WESTERNENG 1981) bindet. Der Farbstoff ist für intakte Zellmembranen impermeabel, so dass nur membrandefekte Zellen mit PI gefärbt werden. Die Detektion des nach Anregung emittierten roten Fluoreszenzlichtes erfolgte im Kanal FL-3. Zur Unterscheidung von Spermien mit intakter und defekter äußerer Akrosommembran wurde an Fluoreszeinisothiocyanat gekoppeltes Peanut Agglutinin (FITC-PNA, Vector, Burlingame, U.S.A.) verwendet.
Es handelt sich hierbei um ein Lektin der Erdnuss, das eine hohe Spezifität für die Bindung an Gal-β(1-3)-GalNAc-Strukturen aufweist. Es bindet bei Eberspermien an der Innenseite der äußeren akrosomalen Membran (FLESCH et al. 1998). Detektiert wurde das emittierte grüne Fluoreszenzlicht im Kanal FL-1.
3.9.3 Grundeinstellung des Gerätes
Für das Durchflusszytometer wurde zu Beginn der Lagerungsversuche eine Grundeinstellung der Signalverstärkungen aller relevanten Parameter festgelegt.
Zuerst wurden zur Herstellung einer ungefärbten Probe 10 µl verdünntes Sperma zu 890µl HBS (pH 7,4, 300 mOsmol) pipettiert und vermischt. Es erfolgte die Festlegung der Verstärkung für die Parameter Vorwärtsstreuung (FSC = forward scatter, Maß für die Partikelgröße) und Seitwärtsstreuung (SSC = sidescatter, Maß für die Komple-xität (Granularität) der Partikel). Beide Parameter wurden auf linearen Skalen darge-stellt. Es wurde darauf geachtet im Histogramm der FSC eine glockenförmige Verteilungskurve abzubilden. Ereignisse die links der Kurve im FSC detektiert werden, sind in der Regel Signale von Schmutzpartikeln und wurden über die Wahl
einer geeigneten Verstärkung von der Messung ausgeschlossen. In einem Punktewolkendiagramm (dotplot) wurden FSC (Abszisse) und SSC (Ordinate) gegeneinander aufgetragen. Es sollte eine „L“-Form oder Dreiecksform erkennbar sein. Für die Einregulierung der Verstärkungen in den Kanälen FL-1 und FL-3 wurden Spermaproben separat mit jeweils einem Farbstoff gefärbt. Es wurden zeitversetzt 497,5 µl verdünntes Sperma mit 2,5 µl PI-Stammlösung (500 µg/ml) bzw.
495 µl verdünntes Sperma mit 5 µl FITC-PNA-Stammlösung (300 µg/ml) versetzt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurden 10 µl der gefärbten Probe in 890 µl HBS überführt und gemessen. Während der Messung wurde die Verstärkung für den jeweiligen Fluoreszenzkanal einreguliert. Es wurde darauf geachtet, dass zwei Populationen in der jeweiligen einparametrischen Darstellung zu differenzieren waren. Die Verstärkungen für FL-1 und FL-3 wurden so gewählt, dass die jeweils linke der beiden Populationen (PI- bzw. FITC-PNA-negative Ereignisse) in der ersten Dekade einer logarhythmischen Skala abgebildet wurde. PI- und FITC-PNA-positive Ereignisse zeigten eine mindestens um den Faktor 10 erhöhte Fluoreszenzintensität.
Im vierten Schritt erfolgte die Feinjustierung der Verstärkungen der Fluoreszenzsignale über eine Doppelfärbung einer verdünnten Samenprobe. Zu 492,5 µl verdünntem Sperma wurden 2,5 µl PI-Stammlösung (Endkonzentration:
2,7 µg/ml) und 5 µl FITC-PNA-Stammlösung (Endkonzentration: 3 µg/ml) pipettiert und vermischt. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 10 µl der gefärbten Spermiensuspension in 890 µl HBS überführt und analysiert. Die Einstellung der Verstärkungen während der Versuche war grundsätzlich: FSC 260, SSC 430, FL-1 (grün) 530, FL-3 (rot) 590. Sie wurden an jedem Untersuchungstag überprüft und bei einer Darstellung der Messdaten in den Histogrammen, die abweichend zu den oben genannten Beschreibungen war, angepasst. Das Gerät war für alle Messungen auf den Parameter FSC getriggert.
3.9.4 Messung und Auswertung
Für die Bestimmung des Anteils plasma- und akrosommembranintakter Spermien wurde der Ansatz einer Doppelfärbung verwendet, der bereits in den Grundeinstellungen beschrieben wurde. Für die Färbung wurden zu 492,5 µl
FITC-PNA-Stammlösung (Endkonzentration: 3µg/ml) hinzugefügt und vermischt.
Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden für die Messung 10 µl der gefärbten Spermiensuspension in 890 µl HBS überführt und analysiert. Dieses Vorgehen bot den Vorteil, dass die Menge an freiem Farbstoff im Messschritt reduziert war und eine klarere Trennung der gefärbten und ungefärbten Spermienpopulationen erzielt wurde. Es wurden pro Messung 10.000 Ereignisse erfasst. Die Spermienkonzentration betrug im Färbeschritt ~ 20 x 106 Spermien pro ml und im Messschritt ~ 2,2 x 105 Spermien pro ml. Alle Inkubations- und Messvorgänge wurden in 3,5 ml Reagenzröhren (Artikel 55484, Fa. Sarstedt, Nürnbrecht) in abgedunkelter Umgebung durchgeführt. Farbstoffe und farbstoffhaltige Lösungen wurden durch Abdecken mit Aluminiumfolie vor direktem Lichteinfall geschützt. Während der Messungen wurde eine Flussrate zwischen 400 und 800 Partikeln pro Sekunde eingehalten. Die gerätespezifische Geschwindigkeitseinstellung lag zwischen 3 und 5. Die Auswertung der Datei erfolgte an Hand des FL-1/FL-3-dotplot. Zunächst wurde die Überlagerung des Emissionsspektrums der beiden Farbstoffe durch eine nachträgliche mathematische Kompensation bereinigt. Im Anschluss erfolgte die Differenzierung der vier möglichen Spermienpopulationen durch das Setzen einer vertikalen und einer horizontalen Grenzlinie („gate“) in das Diagramm. Die Grenzlinien teilten das Diagramm in vier Quadranten (Q1 – Q4). Es erfolgte eine automatische Berechnung des prozentualen Anteils von Ereignissen in jedem Quadranten. Die Population der PI und FITC-PNA-negativen (plasma- und akrosommembranintakten) Spermien wurde in Q3 abgebildet. Für den gesamten Versuchszeitraum wurden, soweit möglich, eine einheitliche Kompensation und ein identisches „gate“ benutzt.
3.9.5 Bestimmung des Fremdpartikelgehaltes und Korrektur der Messwerte In jeder Probe lag ein unterschiedlich hoher Anteil von nicht zellulären Bestandteilen vor. Dieser wurde trotz sorgfältig vorgenommener Grundeinstellungen, zum Teil während der Messung miterfasst. Um den Einfluss auf das Messergebnis zu eliminieren, wurde nach 12 h Lagerungsdauer eine Bestimmung des Fremdpartikelgehaltes in jeder Probe vorgenommen. Es wurden 985 µl destilliertes Wasser mit 5 µl PI-Stammlösung (Endkonzentration: 2,7 µg/ml) und 10 µl
verdünntem Sperma gemischt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Behandlung führte zu einer Permeabilisierung der Plasmamembran der Spermien und einer Anfärbung der Zellkerne mit PI. Anschließend erfolgte die Messung von 10.000 Ereignissen mit identischen Geräteeinstellungen wie sie zur der Bestimmung des Membranstatus genutzt wurden (PETRUNKINA et al. unveröffentlicht *).
Zur Auswertung wurde ein Gate im FSC / FL3–dotplot gesetzt. Die permeabilisierten, PI-positiven Spermien bildeten eine homogene Wolke mit hoher Fluoreszenzintensität im Kanal FL-3. Alle Partikel mit mindestens 10-fach geringerer Fluoreszenzintensität unterhalb dieser Wolke waren nicht DNA-haltige Messereignisse („Fremdpartikel“). Das Gate wurde so ausgerichtet, dass die horizontale Achse zwischen den Populationen der Spermien und der Fremdpartikel lag. Alle Ereignisse unterhalb der horizontalen Achse (Q3 und Q4) bildeten nach Addition den prozentualen Anteil der Fremdpartikel in einer Probe. Alle im Verlauf der Lagerung einer Probe erhobenen Werte für den Anteil plasma- und akrosommembranintakter Spermien (Q3unkorrigiert) wurden um den Anteil der Fremdpartikel mit folgender Formel korrigiert (PETRUNKINA u. HARRISON unveröffentlicht **):
kel Fremdparti 100
100
* kel Fremdparti kel
Fremdparti 100
100
* Q3korrigiert Q3unkorrigiert
− −
= −
_____________________________________________________________________________________________________
*) PETRUNKINA, A. M., D. WABERSKI, H. BOLLWEIN u. H. SIEME: Identifying non-sperm particles: a minimalistic flow cytometric approach for true cell counting. (unveröffentlicht)
**) PETRUNKINA, A. M. u. R. A. P. HARRISON: Systematic overestimation of cell counts by flow cytometry – a mathematical