Charakterisierung der funktionellen Integrität konservierter Eberspermatozoen in dynamischen
Testsystemen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Heiko Henning
aus Bremerhaven
Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. med. vet. D. Waberski
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken Klinik für kleine Klauentiere, forensische Medizin und
Ambulatorische Klinik
PD Dr. A. Petrunkina
Cambridge Institute of Medical Research
University of Cambridge, UK
Dr. R. A. P. Harrison
Gt Shelford, Cambridge, UK
1. Gutachterin: Apl.-Prof. Dr. med. vet. D. Waberski
2. Gutachter: Prof. Dr. H. Bollwein
Meiner Familie
und Torsten
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG ... 1
2 LITERATURÜBERSICHT ... 2
2.1 CHARAKTERISIERUNG DES EINFLUSS DER LAGERUNGSDAUER BEI 17°C AUF FLÜSSIG VERDÜNNTES EBERSPERMA... 2
2.1.1 in vivo... 2
2.1.2 in vitro ... 4
2.2 DIE ROLLE VON BIKARBONAT IN SIGNALÜBERTRAGUNGSVORGÄNGEN VON SÄUGETIERSPERMIEN... 8
2.2.1 Kapazitation ... 9
2.2.2 Motilitätsstimulation ... 13
2.3 REGULATION DES ZELLVOLUMENS BEI SPERMIEN... 16
2.3.1 Bedeutung... 16
2.3.2 Mechanismen... 17
3 MATERIAL UND METHODE ... 20
3.1 VERSUCHSSCHEMA... 20
3.2 GERÄTE UND VERBRAUCHSMATERIAL... 21
3.3 CHEMIKALIEN UND GEBRAUCHSLÖSUNGEN... 21
3.4 HERKUNFT DER EJAKULATE... 21
3.5 SAMENGEWINNUNG... 21
3.6 SAMENUNTERSUCHUNG UND VERDÜNNUNG... 22
3.7 STANDARDSPERMATOLOGIE... 23
3.8 COMPUTERASSISTIERTE SPERMIENANALYSE (CASA)... 24
3.8.1 Gerät und Software... 24
3.8.2 Messung ... 26
3.9 MEMBRANINTEGRITÄT IN DER DURCHFLUSSZYTOMETRIE... 26
3.9.1 Testprinzip ... 26
3.9.2 Gerät und Farbstoffe... 27
3.9.3 Grundeinstellung des Gerätes ... 27
3.9.4 Messung und Auswertung ... 28
3.9.5 Bestimmung des Fremdpartikelgehaltes und Korrektur der Messwerte... 29
3.10 SPERMIENCHROMATINSTABILITÄT... 31
3.10.1 Testprinzip ... 31
3.10.2 Gerät und Farbstoff... 31
3.10.3 Probenfixation und Lagerung... 32
3.10.4 Messung und Auswertung ... 32
3.11 KINETIK DES CALCIUMINFLUX... 34
3.11.1 Testprinzip ... 34
3.11.2 Versuchsaufbau... 34
3.11.3 Gerät und Farbstoffe... 34
3.11.4 Vorbereitung der Medien ... 35
3.11.5 Vorbereitung der Spermien... 36
3.11.6 Messung und Auswertung ... 37
3.12 STIMULATION DER MOTILITÄT DURCH BIKARBONAT... 40
3.12.1 Testprinzip ... 40
3.12.2 Gerät und Farbstoffe... 40
3.12.3 Vorbereitung der Medien ... 40
3.12.4 Vorbereitung der Spermien... 41
3.12.5 Messung und Auswertung ... 41
3.13 VOLUMENREGULATIONSTEST... 43
3.13.1 Testprinzip ... 43
3.13.2 Geräte und Farbstoffe... 43
3.13.3 Vorbereitung der Medien ... 44
3.13.4 Vorbereitung der Spermien... 45
3.13.5 Messung und Auswertung ... 45
3.14 STATISTISCHE AUSWERTUNG... 47
4 ERGEBNISSE ... 50
4.1 STANDARDSPERMATOLOGIE... 50
4.2 MEMBRANINTEGRITÄT IN DER DURCHFLUSSZYTOMETRIE... 51
4.3 CASA-MOTILITÄTSPARAMETER... 52
4.4 CALCIUMINFLUX... 54
4.4.1 Kurvenverläufe der kinetischen Populationsveränderungen in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer... 54
4.4.2 Einfluss der Lagerungsdauer am Beispiel eines repräsentativen Zeitpunktes der kinetischen Kurven ... 61
4.4.3 Allgemeine Reaktivität der Spermienpopulationen in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer und vom Inkubationsmedium ... 63
4.4.4 Einfluss der Lagerungsdauer auf die spezifische Reaktivität der Spermien- populationen gegenüber Bikarbonat und Calcium... 67
4.4.5 Spezifische Reaktivität gegenüber Bikarbonat bei einzelnen Ebern im Verlauf der Lagerung (Fallbeispiele) ... 70
4.4.6 Beziehungen zwischen der Standardspermatologie und Parametern des Calciuminflux………..……….. 74
4.4.7 Beziehungen von Parametern der CASA-Messungen und der Membranintegrität zu Parametern des Calciuminflux... 75
4.5 STIMULATION DER MOTILITÄT DURCH BIKARBONAT... 80
4.5.1 Einfluss der Lagerungsdauer auf die Stimulierbarkeit der einzelnen Motilitätsparameter………...……….. 80
4.5.2 Veränderung von Spermiensubpopulationen im Stimulationstest... 87
4.5.3 Lagerungseinfluss auf die Induzierbarkeit einer Spermienpopulation mit schneller und linearer Bewegung bei einzelnen Ebern (Fallbeispiele) ... 91
4.5.4 Beziehungen zwischen der Standardspermatologie und Parametern der Motilitätsstimulation durch Bikarbonat ... 93
4.5.5 Beziehungen von Parametern der CASA-Messungen und der Membranintegrität zu den Parametern der Motilitätsstimulation durch Bikarbonat ... 94
4.5.6 Beziehungen zwischen Parametern der Motilitätsstimulation durch Bikarbonat und des Calciuminflux... 97
4.6 EINFLUSS DER ZENTRIFUGATION DURCH PERCOLL AUF DIE STICHPROBENGRÖßE IM CALCIUMINFLUX UND IN DER MOTILITÄTSTIMULATION DURCH BIKARBONAT... 104
4.7 STABILITÄT DER SPERMIENCHROMATINSTRUKTUR IN ABHÄNGIGKEIT VON DER LAGERUNGSDAUER..……….105
4.8 VARIANZKOMPONENTENSCHÄTZUNG FÜR AUSGEWÄHLTE PARAMETER DER STANDARD- SPERMATOLOGIE, DES CALCIUMINFLUX UND DER MOTILITÄTSSTIMULATION DURCH BIKARBONAT. 109 4.9 VOLUMENREGULATIONSTEST... 110
4.9.1 Erstellung eines Kriterienkataloges zur Beurteilung der Volumen- regulationsfähigkeit von Eberspermien ... 110
4.9.2 Veränderung der Volumenregulationsfähigkeit in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer………..117
5 DISKUSSION... 121
5.1 BIKARBONAT-INDUZIERTER CALCIUMINFLUX BEI GELAGERTEN EBERSPERMIEN... 121
5.2 MOTILITÄTSSTIMULATION DURCH BIKARBONAT BEI GELAGERTEN EBERSPERMIEN... 128
5.3 VOLUMENREGULATION BEI GELAGERTEN EBERSPERMIEN... 131
5.4 STABILITÄT DES SPERMIENCHROMATINS BEI GELAGERTEN EBERSPERMIEN... 135
5.5 SCHLUSSFOLGERUNG... 137
6 ZUSAMMENFASSUNG... 138
7 SUMMARY... 140
8 LITERATURVERZEICHNIS... 142
9 ANHANG... 163
9.1 TABELLEN... 163
9.2 CHEMIKALIEN... 195
9.3 REZEPTE... 196
9.4 MESSPOSITIONEN FÜR DIE CASA-MESSUNGEN... 203
9.5 GERÄTE UND VERBRAUCHSMATERIAL... 204
10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 206
11 TABELLENVERZEICHNIS ... ……209
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ALH gemittelte maximale seitliche Kopfauslenkung von der mittleren Bahn (amplitude of lateral head-displacement)
AO Acridinorange
AOC durchschnittlicher Richtungswechsels des Spermienkopfes (average orientation change)
BCF Frequenz des Kreuzens des gewundenen Bewegungspfades mit der gemittelten Bewegungsbahn (beat cross frequency)
BSA bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius ca. circa
cAMP zyklisches (cyclic) Adenosin-3',5'-monophosphat CASA computer-assistierte Spermienanalyse
CTC Chlortetrazyklin (chlortetracyclin)
DAP Länge der gemittelten Bahn (distance average path) DCL Länge der gewundenen Bahn (distance curvilinear) DSL Länge der direkten Strecke (distance straight-line) DFI DNA-fragmentationsindex
DNA Desoxyribonucleinsäure (desoxy ribonucleic acid) et al. et alii
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGTA Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetat FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FL 1-3 Filter Nummer 1 bis 3
FSC Vorwärtsstreulicht (forward scatter)
g Erdbeschleunigung (gravitational acceleration)
h Stunde (hour)
HBS Hepes-gepuffered Salzlösung (hepes buffered saline) HDS hohe DNA-anfärbbarkeit (high DNA stainability)
Hz Hertz KB künstliche Besamung LIN linearity
mg Milligramm min Minute ml Milliliter µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer
M Mol
min Minute
Mrd. Milliarde/Milliarden MW Mittelwert
n Probandenzahl nm nanometer NRR Non-Return-Rate OV Ovulation
p Irrtumswahrscheinlichkeit (probability) PI Propidiumjodid (propidium iodide)
PNA peanut agglutin, Lektin der Erdnuss (arachis hypogea) PKA Proteinkinase A
PVA Polyvinylalkohol PVP Polyvinylpyrrolidon R Reaktivität
RNA Ribonucleinsäure (ribonucleic acid)
ROS reaktive Sauerstoffverbindungen (reactive oxygen species) RVD regulatorische Volumenabnahme (regulatory volume decrease) RVI regulatorische Volumenzunahme (regulatory volume increase)
s Sekunde
sAC lösliche Adenylatzyklase (soluble adenylyl cyclase) SCSA Spermienchromatinstrukturassay
SD Standardabweichung (standard deviation) SSC Seitwärtstreulicht (side scatter)
STR straightness Tab. Tabelle
Tyr Tyrode (oder auf Tyrode basierte Medien) u. a. unter anderem
VAP Geschwindigkeit auf der gemittelten Bahn (velocity average path) VCL Geschwindigkeit auf der gewundenen Bahn (velocity curvilinear) VSL Geschwindigkeit auf der direkten Strecke (velocity straight-line) WOB wobble
z. B. zum Beispiel
ZDS Zentralverband der Deutschen Schweineproduktion
1 Einleitung
Die künstliche Besamung nimmt in Deutschland einen hohen Stellenwert in der Schweinezucht ein; die Besamungsdichte beträgt derzeit ca. 90 %. Weltweit betrachtet werden 99 % der künstlichen Besamungen beim Schwein mit flüssig konserviertem Samen durchgeführt (JOHNSON et al. 2000), der in der Regel bei +15 bis +18°C gelagert wird. Bereits innerhalb von 72 h Lagerungsdauer nimmt die Befruchtungsfähigkeit des gelagerten Samens ab (WABERSKI et al. 1994).
Standardspermatologische Parameter sind allerdings unzureichend, um diese Veränderungen in vitro darzustellen. Die Befruchtungsfähigkeit der gelagerten Spermien hängt vor allem von der funktionellen Integrität ihrer Membransysteme und der DNA ab (WATERHOUSE et al. 2004; BOE-HANSEN et al. 2005). Detailliertere Kenntnisse zu molekularen Regulations- und Reaktionsmechanismen unter Fertilisationsbedingungen in vitro, ermöglichen es mittlerweile die Funktionalität der Spermien differenzierter zu erfassen. So wird das kontrollierte Ablaufen von Reaktionen auf spezifische äußere Stimuli in vitro als ein Maß für die funktionelle Spermienintegrität gewertet (HOLT u. MEDRANO 1997; PETRUNKINA et al. 2005b).
Kinetische Testsysteme zur Erfassung dynamischer Membranparameter in Spermiensubpopulationen gelten als besonders vielversprechend zur Charakterisierung fertilitätsrelevanter Spermieneigenschaften (PETRUNKINA et al.
2007b).
Das Ziel der vorliegenden Studie war es zu prüfen, inwieweit Methoden zur Bestimmung der funktionellen Integrität der Spermien in der Lage sind, in normospermen Ejakulaten Einflüsse der Lagerungsdauer bei 17°C darzustellen. Es wurden dynamische Testsysteme verwendet, die in vitro die Ansprechbarkeit von Spermien auf Bikarbonat als initialen Stimulus der Kapazitation und die Fähigkeit zur Volumenregulation unter wechselnden osmotischen Bedingungen erfassten. Als ein Nebenaspekt wurde die Veränderung des Anteils chromatinstabiler Spermien während der Lagerung untersucht.
2 Literaturübersicht
2.1 Charakterisierung des Einfluss der Lagerungsdauer bei 17°C auf flüssig verdünntes Ebersperma
Die Erfassung von Lagerungseinflüssen auf die Spermien ist in der Literatur immer eng an die Frage nach der Befruchtungsfähigkeit geknüpft. Die Abnahme der Befruchtungsfähigkeit wird dabei allgemein gefasst als Folge eines in vitro ablaufenden physiologischen Alterungsprozesses betrachtet (WEITZE 1991;
JOHNSON et al. 2000). Die Charakterisierung der lagerungsbedingten Veränderungen wird in der Literatur sowohl durch Parameter in vivo als auch in vitro beschrieben.
2.1.1 in vivo
Untersuchungen von WABERSKI et al. (1994) zeigten, dass der Einsatz bis zu 48 h in Beltsville Thawing Solution (BTS) gelagerter Spermien unabhängig vom Intervall zwischen Besamung und Ovulation (KB-OV-Intervall) keinen Einfluss auf die Anzahl normalentwickelter Embryonen hat. Wurde die Lagerungsdauer auf 48 bis 87 h ausgedehnt, trat bereits bei einem KB-OV-Intervall von 12 bis 24 h eine signifikante Reduktion normal entwickelter Embryonen ein, die bei länger als 87 h gelagertem Sperma auch durch ein KB-OV-Intervall von 0 bis 12 h nicht kompensiert werden konnte. Mit zunehmender Lagerungsdauer wurde eine verringerte Anzahl akzessorischer Spermien in der Zona pellucida gewonnener Embryonen/Eizellen festgestellt. Des Weiteren führten Besamungen 0 bis 4 h post ovulationem bereits mit 24 bis 48 h (BTS) und 48 bis 72 h (Androhep) gelagertem Sperma zu einer verringerten Befruchtungsrate. Die Autoren schlossen aus den Ergebnissen, dass ein Alterungsprozess in vitro negative Auswirkungen auf die Aufrechterhaltung der Überlebensfähigkeit der Spermien in vivo hat und eine Abnahme der initialen Befruchtungsfähigkeit unabhängig vom Verdünner in den ersten Tagen der Lagerung nicht verhindert werden kann. Indirekte Bestätigung erfahren diese Befunde durch eine retrospektive Studie von HAUGAN et al. (2005), in der nach einmaliger Besamung mit 2,5 Mrd. Spermien nach 52 bis 62 h Lagerung in BTS eine Reduktion
der Wurfgröße zu verzeichnen war. Da Doppelbelegungen zu signifikant besseren Werten führten, vermuteten die Autoren ein zu großes KB-OV-Intervall bei einmaliger Belegung. Andere Studien ergaben bei gleicher Lagerungsdauer flüssig konservierter Eberspermien negative Effekte auf die Non-Return-Rate (NRR) sowie die Abferkelrate, während bereits nach 24 bis 38 h Lagerung eine Reduktion der Wurfgröße bzw. der Anzahl lebend geborener Ferkel festgestellt wurde (JOHNSON et al. 1982; HOFMO et al. 1989). Im Gegensatz dazu verzeichneten MACHATY et al.
(1992) nach 96 h Spermalagerung in BTS bei einmaliger Besamung mit 2,5 Mrd.
Spermien keine Veränderung der Abferkelrate und der Anzahl lebend geborener Ferkel. PURSEL et al. (1973) konnten bei einmaliger Besamung mit Sperma nach 102 h Lagerung nach Ovulationsinduktion zyklussynchronisierter Jungsauen einzig eine Reduktion in der Anzahl akzessorischer Spermien feststellen, während die Trächtigkeitsrate, die Anzahl befruchteter Eizellen und die Anzahl der Embryonen am Tag 25 der Trächtigkeit gleich blieben. Weitere Studien zeigten ebenfalls gleichbleibende Fertilitätsergebnisse bis 72 h Lagerungsdauer und darüber hinaus (JOHNSON et al. 1988; MARTIN RILLO 1991; WABERSKI et al. 1994;
ALEXOPOULOS et al. 1996; LAFOREST u. ALLARD 1996; KUSTER u. ALTHOUSE 1999). Die Ambivalenz zwischen den Ergebnissen wird darauf zurückgeführt, dass häufig Faktoren in die Versuche eingebunden sind, die Lagerungseffekte zu einem gewissen Grad kompensieren (WEITZE 1991; REED 1991). Zu den Faktoren werden unter anderem eine Spermadosis von mehr als 3 Mrd. Spermien pro Besamungsportion (JOHNSON et al. 1988; JOHNSON et al. 2000), die Verwendung von Doppelbesamungen pro Östrus (HAUGAN et al. 2005; WEITZE 1991), ein niedriger Verdünnungsgrad bei relativ hohem Seminalplasmaanteil (JOHNSON et al.
2000; WEITZE 1991), die Verwendung von Mischsperma verschiedener Eber (HAUGAN et al. 2005) sowie die Selektion von Ebern mit sehr guter Qualität des Nativsamens (MARTIN RILLO 1984) gezählt. Als ein weiterer Einflussfaktor wird das verwendete Verdünnermedium gesehen (GADEA 2003; JOHNSON et al. 2000;
KUSTER u. ALTHOUSE 1999; KNOX et al. 2008).
2.1.2 in vitro
Mit der Spermienalterung gehen strukturelle und funktionelle Veränderung einher (JOHNSON et al. 2000). Die häufigsten Eigenschaften, die in Zusammenhang mit der Lagerung von Spermien untersucht wurden, sind die Motilität und die Integrität der Plasma- und Akrosommembran (WATERHOUSE et al. 2004).
Die Motilität der Spermien wird als Indikator für intakte Membransysteme und einen intakten Metabolismus angesehen und daher als ein wichtiger Parameter für die Beurteilung der Befruchtungsfähigkeit erachtet (JOHNSON et al. 2000). Allgemein nimmt mit zunehmender Lagerungsdauer die Motilität ab (PAULENZ et al. 2000;
KOMMISRUD et al. 2002; DUBE et al. 2004; VYT et al. 2004). Ein Minimum von 60 bis 70 % motiler Spermien wird als Voraussetzung für einen bedenkenlosen Einsatz in der künstlichen Besamung gesehen (ALTHOUSE et al. 1998; JOHNSON et al.
2000; VYT et al. 2004). Wird als Grenzwert 60 % angenommen, findet in Studien, die BTS als Verdünner verwendeten, eine Unterschreitung dieses Wertes zum Teil nach 48 h (VYT et al. 2004; KUMARESAN et al. 2009) oder nach 96 h (CEROLINI et al.
2000; PAULENZ et al. 2000; WATERHOUSE et al. 2004) statt. WABERSKI et al.
(1994) stellten dagegen auch nach 120 h Lagerung noch eine geschätzte Motilität von mehr als 60 % fest. Eine Ursache für die sinkende Motilität wird in der Produktion reaktiver Sauerstoffverbindungen (reactive oxygen species = ROS) gesehen (GUTHRIE et al. 2008; KUMARESAN et al. 2009). Über die Wirkungsweise werden unterschiedliche Hypothesen aufgestellt. KUMARESAN et al. (2009) sahen in ihren Untersuchungen bei sinkender Motilität eine sinkende Anzahl Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential (∆Ψm) bei gleichzeitig erhöhter Lipidperoxidation in Form steigender Malonaldehydwerte. Sie vermuten, dass ROS direkt auf das ∆Ψm
einwirken, was zu einer Dysfunktion der Mitochondrien führt, in deren Folge kein ATP mehr bereitgestellt wird. Dagegen zeigten GUTHRIE et al. (2008), dass in Anwesenheit von H2O2 auch ohne Veränderung des ∆Ψm die Motilität abnimmt und vermuteten einen negativen Effekt auf die Nutzung des ATP durch das Axonem oder auf den Aufbau der kontraktilen Strukturen. Der Zusammenhang zwischen dem ∆Ψm
und der Motilität wird von einigen Arbeitsgruppen als so direkt angesehen, dass sie auf eine Erfassung der Motilität zu Gunsten der Bestimmung des ∆Ψm verzichten
(HUO et al. 2002). Als weitere Ursachen für sinkende Motilitätswerte während der Lagerung werden steigende pH-Werte im Verdünnermedium diskutiert. VYT et al.
(2004) fanden in allen getesteten Verdünnermedien Anstiege im pH-Wert zwischen 0,49 und 0,75 Einheiten während einer Lagerung über sieben Tage, wobei sie den höchsten Anstieg in den ersten 48 h registrierten. Die Autoren vermuten, dass die Erhöhung der Werte initial zu einer Aktivierung der Motilität führt, allerdings eine verkürzte Lebensdauer der Spermien nach sich zieht. PAULENZ et al. (2000) sahen dagegen bei Lagerung über 96 h in BTS insgesamt nur einen pH-Anstieg um 0,04 Einheiten. Unter mangelhaften Verarbeitungsbedingungen kann auch ein Besatz mit Bakterien zu einer deutlichen Reduktion der Motilität und Membranintegrität führen (ALTHOUSE et al. 2000). Nicht nur der Anteil motiler Spermien ändert sich während der Lagerung, auch eine veränderte Ausprägung des Bewegungsmusters wird beobachtet (KOMMISRUD et al. 2002). Neben der subjektiven Motilitätsschätzung werden Computerassistierte-Spermienanalyse-Systeme (CASA) zur Erfassung quantitativer und qualitativer Veränderungen in der Motilität eingesetzt (DUBE et al.
2004; DE AMBROGI et al. 2006a; ESTIENNE et al. 2007; YESTE et al. 2008).
Während in der Studie von ESTIENNE et al. (2007) die Mittelwerte der Geschwindigkeitsparameter der Spermien durch eine Lagerung über sieben Tage beeinflusst waren, war dies in Untersuchungen von DE AMBROGI et al. (2006a) über einen Versuchszeitraum von 96 h nicht der Fall. In beiden Studien konnte kein Einfluss der Lagerung auf weitere Parameter der Spermienbewegung festgestellt werden. VAZQUEZ et al. (1998) verzeichneten dagegen nach 96 h Lagerungsdauer eine abnehmende Gesamtmotilität der Spermien und gleichzeitig sinkende Geschwindigkeitsparameter im Vergleich zu Messungen nach 48 h Lagerungsdauer.
Als zweiter wichtiger Indikator für die Beurteilung der Lagerungsfähigkeit werden Veränderungen der Plasma- und Akrosommembran gesehen (WOELDERS 1991;
CEROLINI et al. 2000; JOHNSON et al. 2000). Eine intakte Plasma- und Akrosommembran gelten als Voraussetzung für eine erfolgreiche Befruchtung in vivo (YANAGIMACHI 1994). Die Zunahme der Permeabilität der Membranen für Farbstoffe wird häufig als Indikator für lagerungsbedingte Veränderungen verwendet (WOELDERS 1991). Unabhängig vom verwendeten Verfahren ist die Lagerung
flüssig konservierter Eberspermien im Allgemeinen mit einer Abnahme des Spermienanteils mit intakter Plasma- und Akrosommembran verbunden (HUO et al.
2002; PAULENZ et al. 2000; DUBE et al. 2004; WATERHOUSE et al. 2004; YESTE et al. 2008; KUMARESAN et al. 2009). Bereits in den ersten 12 h der Lagerung konnten HUO et al. (2002) eine signifikante Abnahme des Anteils plasmamembranintakter Spermien feststellen. In welchem Ausmaß Veränderungen während der Lagerung eintreten, variiert zwischen einzelnen Studien. Während einige Autoren bei Anfangswerten von mehr als 90 % nach 144 bis 168 h (6 bis 7 Tagen) Lagerungsdauer Werte von mehr als 70 % plasmamembranintakter Spermien verzeichneten (HUO et al. 2002; DUBE et al. 2004), ermittelten andere bereits nach 72 h einen Abfall der Werte von 91 % auf 55 % (KUMARESAN et al.
2009). Im Gegensatz dazu beobachteten VYT et al. (2004) mit einer Eosin-Nigrosin- Färbung über 144 h (6 Tage) Lagerungsdauer keine Veränderung des Anteils plasmamembrandefekter Spermien in vier verschiedenen Verdünnern. Auch Studien von DE AMBROGI et al. (2006a) und WABERSKI et al. (2006) stellten über eine Lagerungsdauer von 96 h bzw. 72 h keine Abnahme der Plasmamembranintegrität fest. Neben dem morphologischen Aspekt der Intaktheit sehen WATERHOUSE et al.
(2004) auch in der ultrastrukturellen Aufrechterhaltung des Aufbaus der Plasmamembran einen wichtigen Aspekt. Bereits die Abkühlung der Spermien auf Temperaturen zwischen 15 und 18°C wird mit Veränderungen der Fluidität und Permeabilität der Plasmamembran in Verbindung gebracht (MAXWELL u.
JOHNSON 1997; GREEN u. WATSON 2001). Ebenso gehen einige Autoren davon aus, dass die Lagerung im flüssig konservierten Zustand die Permeabilität der Membran beeinflusst, was zu kapazitationsähnlichen Veränderungen führt (MAXWELL u. JOHNSON 1997; DUBÉ et al. 2004; WATERHOUSE et al. 2004), die die Plasmamembran fusionsbereiter werden lässt (GREEN u. WATSON 2001) und in einer frühzeitigen Akrosomreaktion mündet (WATERHOUSE et al. 2004). Als Hinweis darauf werden steigende Werte für Spermien mit einer ausschließlich in der postakrosomalen Region lokalisierten Fluoreszenz (Färbemuster „B“) nach Färbung mit Chlortetrazyklin (CTC) gewertet, was auf erhöhte intrazelluläre Calciumgehalte hindeutet (HUO et al. 2002; CONEJO-NAVA et al. 2003; DUBÉ et al. 2004). Eine
steigende Anzahl lebender Spermien mit einem vermehrten Gehalt von Phosphatidylserin im äußeren Blatt der Plasmamembran wird ebenso als Indiz für kapazitationsähnliche Veränderungen gesehen (WATERHOUSE et al. 2004). Als Ursache für die Veränderungen wird eine vermehrte Lipidperoxidation von Membranstrukturen diskutiert (CEROLINI et al. 2000; DUBE et al. 2004;
WATERHOUSE et al. 2004). Neben den färbetechnischen Ansätzen waren auch funktionelle Testverfahren in der Lage Alterungsprozesse von Spermien nach in vitro Lagerung nachzuvollziehen. So konnten (WABERSKI et al. 2006) mit Hilfe eines modifizierten Oviduktexplantassays zeigen, dass nach 72 h Lagerung weniger Spermien pro Fläche Eileiterepithel in vitro binden als nach 24 h. Sie führten die Befunde neben den bereits genannten Veränderungen auch auf ein gestörtes Rezeptor-Liganden-System zurück, welches die Fähigkeit der Spermien zur Interaktion mit dem Epithel verhindert. Darüber hinaus zeigten MARTINEZ et al.
(1996), dass bereits eine Lagerung von 24 h zu Veränderungen an den Spermien führt, die Präparationsschritte zur Kapazitation der Zellen für die Befruchtung in vitro unnötig werden lässt. VAZQUEZ et al. (1998) erzielten eine niedrigere Rate penetrierter Oozyten mit Spermien nach 96 h Lagerungsdauer im Vergleich zu frisch verdünnten oder 48 h gelagerten Spermien. PETRUNKINA et al. (2005b) erfassten die Reaktivität von gelagerten Eberspermien gegenüber Kapazitationsbedingungen in vitro mit Parametern der Membranintegrität, des intrazellulären Calciumgehaltes und der Induzierbarkeit der Akrosomreaktion. Sie stellten keine Unterschiede in der Reaktivität der Zellen zwischen 24 und 72 h gelagertem Samen fest. In anderen Arbeiten konnte hingegen gezeigt werden, dass eine Lagerung von 120 bzw. 168 h zu einem verringerten Anteil kurzfristig auf Bikarbonat reagierender, lebender Spermien führt (HARRISON 1997; GUTHRIE u. WELCH 2005). Die Induzierbarkeit einer sogenannten „lipid disorder“, die innerhalb der lebenden Spermienpopulation zu einer verstärkten Anfärbbarkeit der Zellen mit Merocyanin führt, war in beiden Arbeiten im Vergleich zu frisch verdünntem Sperma signifikant reduziert. Die Fähigkeit von Spermien zur Volumenregulation unter iso- und hypotonen Bedingungen war während einer Lagerungsdauer von bis zu 48 h nicht beeinträchtigt (PETRUNKINA et al. 2005a).
Die im Zellkern enthaltene DNA wird als eine weitere Struktur angesehen, die anfällig gegenüber Lagerungseinflüssen ist (FRASER u. STRZEZEK 2004; BOE-HANSEN et al. 2005). Während einige Studien nach 72 h bzw. 96 h Lagerungsdauer eine Abnahme der Chromatinstabilität ergaben (FRASER und STRZEZEK 2004; BOE- HANSEN et al. 2005), war dies in anderen Studien frühestens nach 264 h (11 Tagen) der Fall (DE AMBROGI et al. 2006a). In einer Studie von PEREZ-LLANO et al.
(2006) sahen die Autoren selbst nach 21 Tagen Lagerungsdauer keine Veränderungen in der Stabilität des Chromatins. In der Mehrzahl der Studien war das Niveau chromatininstabiler Spermien über den gesamten Lagerungszeitraum im Mittelwert kleiner als 3 % (BOE-HANSEN et al. 2005; DE AMBROGI et al. 2006a;
PEREZ-LLANO et al. 2006; BOE-HANSEN et al. 2008). FRASER und STRZEZEK (2004) beobachteten hingegen über einen Lagerungszeitraum von 96 h einen Anstieg der Spermien mit instabilem Chromatin auf über 10 %. BOE-HANSEN et al.
(2008) stellten in einem Teil der Proben einen Anstieg des Anteils chromatininstabiler Spermien auf > 20 % fest. Eine mögliche Ursache für die sinkende Stabilität des Chromatins mit zunehmender Lagerungsdauer wird in der Produktion von ROS gesehen (BOE-HANSEN et al. 2005; DE AMBROGI et al. 2006a). DE AMBROGI et al. (2006a) vermuteten, dass die Menge an ROS in gelagerten Spermaportionen durch einen steigenden Anteil toter Spermien während der Lagerung zunimmt und in Folge dessen das Chromatin geschädigt wird.
2.2 Die Rolle von Bikarbonat in Signalübertragungsvorgängen von Säugetierspermien
Spermien aus dem Nebenhoden sind direkt nach der Ejakulation nicht befruchtungsfähig. Sie müssen im weiblichen Genitaltrakt zur Erlangung der Befruchtungsfähigkeit weitere vorbereitende Prozesse durchlaufen, die insgesamt als
„Kapazitation“ bezeichnet werden (YANAGIMACHI 1994). Es treten dabei Veränderungen an der Plasmamembran der Spermien auf, die sie in die Lage versetzen sich aus dem Spermienreservoir im Eileiteristhmus zu lösen (TOPFER- PETERSEN et al. 2002), eine Bindung mit der Zona pellucida der Eizelle einzugehen und die Akrosomreaktion durchzuführen (TOPFER-PETERSEN et al. 2000),
(FLORMAN et al. 2008). Die Freisetzung des akrosomalen Inhaltes in Kombination mit einem spezifischen, als „Hyperaktivität“ beschriebenen Bewegungsmuster (SUAREZ u. HO 2003) ermöglicht in der Folge eine Penetration der Eizelle. Aus in vitro Fertilisations (IVF) –Studien ist bekannt, dass Bikarbonat / CO2, Ca2+ und Serumalbumin essentielle Komponenten in den verwendeten Medien sind (YANAGIMACHI 1994). Für viele Spezies inklusive dem Schwein konnte gezeigt werden, dass vor allem Bikarbonat eine Schlüsselrolle bei der Kapazitation in vitro zukommt (Hamster: BOATMAN u. ROBBINS 1991; Schwein: HARRISON 1996;
Pferd: RATHI et al. 2001; Rind: BERGQVIST et al. 2006). Bikarbonat wird bei der Spezies Schwein auch in vivo eine entscheidende Rolle zugesprochen (GADELLA u.
VAN GESTEL 2004, RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 2005). Als ein Hinweis gilt, dass die Bikarbonatkonzentration im Nebenhodenschwanz mit 3 bis 4 mM (RODRIGUEZ- MARTINEZ et al. 1990) relativ gering ist im Vergleich zur Konzentration von circa 10 mM in der Oviduktflüssigkeit im Isthmus und mehr als 30 mM im Bereich der Verbindung zwischen Isthmus und Ampulla (RODRIGUEZ-MARTINEZ 2007). Dies deutet eine lokale Kontrolle der Spermienaktivität abhängig von der Bikarbonatkonzentration an (RODRIGUEZ-MARTINEZ 2007). Da es sich bei den Signalübertragungsvorgängen in Spermien um komplexe und feinregulierte Mechanismen handelt, die noch nicht vollständig geklärt sind, wird im Folgenden nur eine kurze Übersicht (Abbildung 1) über aktuelle Konzepte zur Rolle von Bikarbonat im Rahmen der Kapazitation und Motilitätsstimulation in vitro gegeben.
2.2.1 Kapazitation
Die Kapazitation von Spermien wird als eine Abfolge positiver Destabilisierungsvorgänge gesehen, die es ihnen ermöglichen in einem gewissen Zeitfenster mit der Eizelle zu interagieren (HARRISON 1996). Der Vorgang ist mit Umbauvorgängen an der Plasmamembran verknüpft (HARRISON u. GADELLA 2005), die Spermien zur Erkennung und Interaktion mit der Eizelle befähigen (GADELLA und VAN GESTEL 2004). Es wird angenommen, dass Bikarbonat die dafür notwendigen Signalkaskaden initiiert (HARRISON u. GADELLA 2005) und bis zu einem Punkt, an dem irreversible Veränderungen auftreten, aufrechterhalten muss (GADELLA u. VISCONTI 2006). Der Eintritt von Bikarbonat in die Zelle wird
durch Diffusion in Form von CO2 über die Plasmamembran (FLESCH u. GADELLA 2000) oder über Ionenkanäle (u.a. Na+ / HCO3- Co-Transporter) vermutet (DEMARCO et al. 2003). Intrazellulär erfolgt durch Bikarbonat eine direkte Aktivierung einer sogenannten löslichen Adenylatcyclase (LITVIN et al. 2003;
HARRISON u. GADELLA 2005). Die Aktivierung führt innerhalb weniger Sekunden zu einem Anstieg im intrazellulären Gehalt von zyklischem Adenosin 3’,5’ monophosphat (cAMP) (OKAMURA et al. 1985; HARRISON u.
MILLER 2000). Als Folge des erhöhten cAMP-Spiegels wird eine cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) aktiviert (HARRISON u. MILLER 2000). Sowohl die Konzentration von cAMP als auch PKA-katalysierte Proteinphosphorylierungen folgen einem zeitversetzten, jedoch ähnlichen Verlaufsschema (HARRISON 2004).
Es wird vermutet, dass Rückkopplungsmechanismen in der Signalkaskade involviert sind. So ist es laut HARRISON und MILLER (2000) denkbar, dass PKA eine Phosphodiesterase phosphoryliert, deren vermehrte Aktivität einen Abbau von cAMP nach sich zieht. Ebenso kommt eine Phosphorylierung der löslichen Adenylatcyclase in Frage, wodurch deren Aktivität gesenkt wird (HARRISON u. GADELLA 2005).
Nach Aktivierung der PKA kommt es im weiteren Verlauf der Signalkaskade zu einem Anstieg an Tyrosin- sowie Serin- / Threonin-Phosphorylierungen (LECLERC et al. 1996; BOERKE et al. 2008), die unter anderem Proteine in der Plasmamembran betreffen, welche an der Bindung zwischen Spermien und Zona pellucida beteiligt sind (FLESCH u. GADELLA 2000). Tyrosinphosphorylierungen von Molekülen, die mit dem Kapazitationsvorgang assoziert sind, treten in Spermien von Schweinen frühestens 60 min nach Beginn einer in vitro Kapazitationsbehandlung auf (HARRISON 2004). Auch in Spermien anderer Spezies ist erst nach frühestens 40 min eine Tyrosinphosphorylierung festzustellen (Maus: VISCONTI et al. 1995;
Mensch: LECLERC et al.; Rind: GALANTINO-HOMER et al. 1997). Da eine deutliche Zeitspanne zwischen der Aktivierung der PKA und dem Nachweis der Tyrosinphosphorylierungen liegt und die PKA selbst eine Serin- / Threoninkinase ist, wird eine direkte Kontrolle der Tyrosinphosphorylierung durch PKA ausgeschlossen (HARRISON u. GADELLA 2005). GADELLA und VISCONTI (2006) vermuten mehrere Wege, auf denen die PKA mit den Tyrosinphosphorylierungen verknüpft
sein kann. Zum einen ist die direkte Aktivierung einer Tyrosinkinase durch PKA möglich, zum anderen kann die Inhibierung einer Tyrosinphosphatase zu einem Anstieg an Tyrosinphosphorylierungen beitragen oder als dritte Möglichkeit ist die Phosphorylierung von Zielproteinen durch die PKA als Vorbereitung auf eine Tyrosinphosphorylierung denkbar. Sogenannte A-Kinase Ankerproteine (AKAP;
siehe auch Kapitel 2.2.2) können hier als Bindeglied involviert sein (FICARRO et al.
2003). Ein weiterer Effekt, der von Bikarbonat über sAC / cAMP / PKA vermittelt wird, ist eine Veränderung in der Struktur der Plasmamembran (DE VRIES et al. 2003).
Die Veränderung wird in Form eines Zusammenbruchs der Asymmetrie der Plasmamembran, dem sogenannten scrambling, gesehen (FLESCH et al. 2001).
Unter physiologischen Bedingungen sind in somatischen Zellen einzelne Phospholipide asymmetrisch zwischen dem inneren und äußeren Blatt der Plasmamembran verteilt (BEVERS et al. 1999). So ist Sphingomyelin (SM) ausschließlich und Phosphatidylcholin (PC) hauptsächlich im äußeren Blatt der Membran vertreten. Phosphatidylethanolamin (PE) ist dagegen hauptsächlich und Phosphatidylserin (PS) ausschließlich im inneren Blatt der Plasmamembran lokalisiert (BEVERS et al. 1999). Ähnliche Verhältnisse werden für Säugetierspermien vermutet (MULLER et al. 1994; NOLAN et al. 1995; GADELLA et al. 1999). Die Verteilung der Phospholipide wird durch drei Carrier-Systeme aufrechterhalten. Eine Aminophospholipidtransferase, (sogenannte Flippase), verschiebt PS und PE aus dem äußeren ins innere Blatt der Membran, während eine unspezifische Transferase, (sogenannte Floppase), Phospholipide vom inneren in das äußere Blatt verschiebt (HARRISON u. GADELLA 2005). Ein bidirektionaler Carrier, (sogenannte Scramblase), verschiebt dagegen alle vier Phospholipide zwischen den Blättern der Membran (DE VRIES et al. 2003). Als Auslöser für einen Zusammenbruch der Asymmetrie wird eine Zunahme der Aktivität der „Scramblase“
gesehen (GADELLA u. HARRISON 2000). Das „scrambling“ erleichtert das Herauslösen von Cholesterol durch Albumin aus der Plasmamembran. Dieser Vorgang wird als ein zweiphasiger Prozess beschrieben in dem sich zuerst Cholesterol im apikalen Bereich der Spermienmembran anreichert, bevor es durch den Cholesterolakzeptor Albumin herausgelöst wird (VAN GESTEL et al. 2005).
Durch den Verlust von Cholesterol kommt es so zu einer Erhöhung der Membranfluidität der Plasmamembran. Dies wird durch eine stärkere Interkalation von Merocyanin 540 in die Plasmamembran der gesamten Spermienoberfläche angezeigt (HARRISON et al. 1996; GADELLA u. HARRISON 2000; HARRISON u.
MILLER 2000), wobei der Vorgang im initialen Stadium bei porcinen Spermien reversibel ist (HARRISON et al. 1996). Als ein weiteres Merkmal des „Scrambling“
wird die verstärkte Exposition von PE und PS im äußeren Blatt der Akrosommembran im apikalen Bereich des Spermienkopfes gesehen (GADELLA u.
HARRISON 2002; DE VRIES et al. 2003). Durch den Zusammenbruch der Asymmetrie der Membran und die Erhöhung der Fluidität wird eine Neuformierung und –anordnung von sogenannten lipid rafts eingeleitet (VAN GESTEL et al. 2005).
Eine Permeabilitätsänderung der Membran wird als Ursache für die Beobachtung angenommen, dass Bikarbonat einen Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes auslöst (HARRISON et al. 1993). Eine Involvierung spezifischer Ionenkanäle wird vermutet (DARSZON et al. 1999; LITVIN et al. 2003). In diesem Zusammenhang werden auch Veränderungen des Plasmamembranpotentials als ein wichtiges Element im Ablauf des Kapazitationsvorganges diskutiert (ZENG et al. 1995;
(VISCONTI et al. 2002). In Zusammenhang mit dem „scrambling“ wird vermutet, dass die Umorganisation von „lipid rafts“ eine Veränderung der Anordnung von Oberflächenproteinen zur Folge hat (HARRISON u. GADELLA 2005). Dies führt zu einer erhöhten Fusionsbereitschaft der Plasmamembran und der Freilegung von Oberflächenrezeptoren durch Entfernung sogenannter Dekapazitationsfaktoren (HARRISON u. GADELLA 2005). Die beschriebenen Veränderungen laufen mit kleinen Unterschieden bei Spermien aller Säugetiere im Prinzip gleich ab, unterliegen jedoch jeweils einer speziesspezifischen Kinetik (GADELLA u. VAN GESTEL 2004). In einer Reihe von Untersuchungen wurde beobachtet, dass die beschriebenen Veränderungen immer nur in einem Teil der Spermienpopulation auftraten und die Reaktion auf Bikarbonat zwischen Zellen, Ejakulaten und Individuen variiert (HARRISON et al. 1996; FLESCH et al. 2001; GADELLA u.
HARRISON 2002). Als eine mögliche Ursache wird eine unvollständige Reifung von Spermien im Nebenhoden vermutet, die durch am Spermium anhaftende
Plasmatropfen gekennzeichnet ist (FLESCH et al. 2001). Auch zelluläre Unterschiede im Gehalt von Komponenten des Signalübertragungsweges (sAC, Phosphatasen) werden diskutiert (HARRISON u. GADELLA 2005).
2.2.2 Motilitätsstimulation
Während der Ejakulation gelangen die Spermien vom bikarbonatarmen Milieu des Nebenhodenschwanzes in ein vergleichsweise bikarbonathaltiges Umfeld des Ejakulates (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1990). Bikarbonat regt dabei die Motilität der Spermien an (OKAMURA et al. 1985). Diese ist durch gleichmäßige und geradlinige Bewegung gekennzeichnet und unterscheidet sich von der als Hyperaktivität beschriebenen Spermienbewegung (SUAREZ und HO 2003; TURNER 2006). Die Hyperaktivität ist durch eine stärkere Krümmung des Spermienschwanzes mit einem asymmetrischen Geißelschlag gekennzeichnet, die unter einem Deckglas zu einem zirkulären Bewegungsmuster führt (SUAREZ et al. 1993; SUAREZ u. HO 2003). Als Grundlage der durch Bikarbonat induzierten Motilitätsstimulation wird die direkte Aktivierung der „löslichen“ Adenylatzyklase gesehen (OKAMURA et al. 1985;
ESPOSITO et al. 2004) und die darauf folgende Initiierung einer Signalkaskade über sAC / cAMP / PKA im Spermienschwanz (HARRISON u. GADELLA 2005; TURNER 2006). Bikarbonat induziert auch einen Anstieg des intrazellulären pH-Wertes und erleichtert die Öffnung spannungsgesteuerter Ca2+-Kanäle. Calcium ist ebenso wie Bikarbonat dazu in der Lage, in Eberspermien Hyperaktivität zu induzieren (SCHMIDT u. KAMP 2004). Für Säugetierspermien wird angenommen, dass die Fähigkeit zur Hyperaktivität während der Kapazitation erlangt wird (HARRISON 1996). Bikarbonat wird dabei eine wichtige Rolle zugesprochen (BOATMAN u.
ROBBINS 1991). SUAREZ (2008) dagegen vermutet, dass die Signalkaskaden, die zur Hyperaktivität führen, unabhängig von Kapazitationsvorgängen am Spermienkopf ablaufen. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass im Rahmen der Kapazitation
„A-Kinase Ankerproteine“ (AKAP) tyrosinphosphoryliert werden (CARRERA et al.
1996; CARR et al. 2001), die sich unter anderem im Spermienschwanz befinden (DE VRIES et al. 2003; FICARRO et al. 2003). Es handelt sich bei den AKAP um Gerüstproteine, die in der Lage sind an regulatorische Untereinheiten der PKA zu binden. Sie binden allgemein Enzyme an Zellorganellen oder das Zytoskelett und
erlauben dadurch eine Signalübertragung in diskreten Bereichen der Zelle (TURNER et al. 1999; FICARRO et al. 2003). Sie werden als ein mögliches Bindeglied zwischen der Signalkaskade sAC / cAMP / PKA und der Tyrosinphosphorylierung im Spermienschwanz und –kopf gesehen (GADELLA u. VAN GESTEL 2004; TURNER 2006). Die Regulierung sowohl einer aktivierten, als auch hyperaktivierten Motilität wird von TURNER (2006) auf ähnliche Mechanismen zurückgeführt. Sie vermutet, dass Unterschiede im Bewegungsmuster darin begründet sind, dass unterschiedliche Zielmoleküle phosphoryliert werden. Tyrosinphosphorylierungen von Proteinen, die Bestandteile der Mantelfasern sind, wird dabei für die Hyperaktivität eine entscheidende Rolle zugesprochen (SI u. OKUNO 1999; VADNAIS et al. 2007).
Neben Bikarbonat gilt auch der Einstrom extrazellulären Ca2+ als Voraussetzung für die Expression der Hyperaktivität (TASH u. MEANS 1983; CARLSON et al. 2003). In die Kontrolle des Ca2+-Einstroms sind vermutlich spannungs- und nucleotidgesteuerte Ca2+-Kanäle involviert, die im Spermienschwanz nachgewiesen wurden (WIESNER et al. 1998; QUILL et al. 2003; HO et al. 2009). Auch die Beteiligung von intrazellulären Calciumspeichern im Bereich des Spermienhalses bei den Spezies Mensch und Rind wird diskutiert (HO u. SUAREZ 2001; BEDU-ADDO et al. 2008). Neben den Mitochondrien stellen glykolytische Enzyme in den Mantelfasern des Spermienschwanzes, wie die spermienspezifische Glycerynaldehyd3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH-S), den Energiebedarf für die Motilität sicher (MIKI et al. 2004; MUKAI u. OKUNO 2004). Die Enzyme werden als wichtige Quelle für die Deckung des Bedarfs an ATP gesehen, der während einer hyperaktiven Motilität vorhanden ist (WILLIAMS u. FORD 2001).
Abb. 1: Schematisches Flussdiagramm der von Bikarbonat initiierten Signalüber- tragungsvorgänge im Rahmen der in vitro Kapazitation (modifiziert nach BOERKE et al. 2009). Schlüsselfaktoren der Kapazitation sind grau hinterlegt. Durchgezogene Linien zeigen als gesichert geltende Zusam- menhänge an. Gestrichelte Linien zeigen vermutete Zusammenhänge an.
Kurze dicke Pfeile markieren eine Steigerung oder Senkung der Aktivität einer Komponente, eines Vorganges oder einer Eigenschaft. Eine detailliertere Beschreibung der Abläufe ist im Kapitel 2.2.1 enthalten.
Bik
Bikarbonat
sAC
PKA cAMP
Tyr kinase
Membranveränderungen:
- „Scrambling“
- Hyperpolarisation - Permeabilitätsänderung (z. B. Ca2+ Einstrom)
- Cholesterolefflux
Tyr phosphatase Ser- / Thr-phosphorylierung
Tyrosin-phosphorylierung
Ca2+
Albumin
Kapazitation
apikaler Spermienkopf - Bindungsfähigkeit an Zona pellucida
- Bereitschaft zur Akrosomreaktion
Spermienschwanz - Glykolyse
- hyperaktive Motilität
- -
2.3 Regulation des Zellvolumens bei Spermien
2.3.1 Bedeutung
Spermien vieler Säugetierspezies gelten als „perfekte Osmometer“ (Maus: DU et al.
1994, WILLOUGHBY et al. 1996; Eber: GILMORE et al. 1996, PETRUNKINA u.
TOPFER-PETERSEN 2000; Mensch: GILMORE et al. 1995; Rind: DREVIUS 1972).
Sie haben zudem die Fähigkeit nach einer Schwellung oder Schrumpfung in hypo- oder hypertoner Lösung ihr Zellvolumen wieder zu regulieren. Der Mechanismus wird als regulatorische Volumenabnahme (= regulatory volume decrease, RVD) bzw.
regulatorische Volumenzunahme (= regulatory volume increase, RVI) bezeichnet (PETRUNKINA et al. 2005a). Die Fähigkeit zur Volumenregulation wird von Spermien vermutlich während der Nebenhodenpassage erworben (YEUNG et al.
2006). So konnte an Spermien aus dem Nebenhodenkopf von Maus und Makaken gezeigt werden, dass diese im Gegensatz zu Spermien aus dem Nebenhodenkörper und –schwanz entweder keine Schwellung unter hypotonen Bedingungen zeigten (YEUNG et al. 2004) oder bei vorhandener Schwellung keine Rückregulation des Zellvolumens festzustellen war (YEUNG et al. 2002). SAHIN et al. (2009) zeigten dagegen, dass Spermien aus dem Nebenhodenkopf und -schwanz von Bullen in der Lage, sind eine RVD zu vollziehen. Spermien aus dem Nebenhodenkopf wiesen jedoch eine eingeschränkte Fähigkeit zur Kontrolle des Zellvolumens unter isotonen Bedingungen auf. Die Ejakulation wird in vielen Spezies mit einem „hypotonen Schock“ für die Spermien in Verbindung gebracht (YEUNG et al. 1999a;
PETRUNKINA et al. 2004a; COOPER 2007; SAHIN et al. 2009). Der Unterschied in der Osmolarität zwischen Nebenhodenschwanz und Seminalplasma kann speziesabhängig bis zu 100 mOsmol/kg betragen (Maus: YEUNG et al. 1999a).
Daher wird es als Notwendigkeit angesehen, dass Spermien intakte Volumenregulationsmechanismen aufweisen (COOPER u. YEUNG 2003;
PETRUNKINA et al. 2004a). Auch eine Beteiligung osmotisch sensitiver Calciumkanäle an der Aktivierung der Spermienmotilität und der Akrosomreaktion wird diskutiert (ROSSATO et al. 1996). PETROUNKINA et al. (2000a) beobachteten in diesem Kontext unter Kapazitationsbedingungen periodische Volumenzunahmen
und –abnahmen an Eberspermien, die in Zusammenhang mit einer Destabilisierung der Zellen standen. Die Fähigkeit zur Volumenregulation wird bei einigen Spezies mit der Fertilität in Zusammenhang gebracht. So zeigten KHALIL et al. (2006), dass Spermien von Bullen mit einer niedrigen Non-Return-Rate (NRR) eine größere initiale Schwellung nach Inkubation in einem hypotonen Medium und eine deutlich schwächer ausgeprägte RVD zeigten im Vergleich zu Bullen mit einer hohen NRR.
YEUNG und COOPER (2001) beschrieben, dass humane Spermien mit eingeschränkter Fähigkeit zur Volumenregulation keine Migration durch künstlichen zervikalen Mucus zeigten. Für die Spezies Schwein stellten PETRUNKINA et al.
(2004a) fest, dass Spermien von Ebern mit überdurchschnittlicher Fertilität eine signifikant höhere relative Rückregulation des Zellvolumens nach Inkubation in einem hypotonen Medium aufwiesen. In einer Studie mit genetisch manipulierten Mäusen, die einen Tyrosinkinaserezeptor nicht exprimieren (c-ros knock-out), zeigten YEUNG et al. (1998), dass die Spermien dieser Tiere nicht in der Lage sind die uterotubale Verbindung zu passieren. Die Autoren führten dies auf eine Reifungsstörung im Nebenhoden zurück, die mit einer Unfähigkeit der Spermien zur Volumenregulation einhergeht und sich in geschwollenen, aufgekrümmten Spermienschwänzen äußert.
Unter praxisrelevanten Gesichtspunkten wird in der Humanmedizin ein verbessertes Verständnis der involvierten Mechanismen als eine Möglichkeit zur Entwicklung neuer Methoden der Kontrazeption durch gezielte Beeinflussung der Spermienfunktion gesehen (YEUNG et al. 2006). Im veterinärmedizinischen Bereich werden die Parameter der Volumenregulation (RVD und RVI) als Möglichkeit erachtet, Vatertiere hinsichtlich ihrer Fertilität zu selektieren (PETRUNKINA u.
TOPFER-PETERSEN 2000; PETRUNKINA et al. 2004a; KHALIL et al. 2006). Auch die Einschätzung der Widerstandsfähigkeit von Spermien einzelner Vatertiere gegenüber Prozessen der Spermatiefgefrierung und des Auftauens an Hand ihrer Fähigkeit zur Osmoregulation wird als eine Anwendungsmöglichkeit in Betracht gezogen (PETRUNKINA et al. 2007a).
2.3.2 Mechanismen
Die Kontrolle des Zellvolumens in somatischen Zellen ist ein wichtiger Aspekt für die Aufrechterhaltung der Zellfunktion. Bereits unter isotonen Bedingungen sind
Ionentransporter wie die Na+-K+-ATPase aktiv, um das Membranpotential und ein osmotisches Equilibrium mit der Umgebung aufrecht zu erhalten (WALDEGGER et al. 1998; HOFFMANN et al. 2009). Es wird vermutet, dass dieser Transporter auch an der Regulation des isotonen Zellvolumens von Rinder- und Hundespermien beteiligt ist (BREDDERMAN u. FOOTE 1971; PETRUNKINA et al. 2004c).
Geringe Veränderungen der extrazellulären Osmolarität (hypo- oder hyperton) führen bereits zu Volumenregulationsprozessen, die allerdings ohne messbare Veränderung des Zellvolumens stattfinden und als isovolumetrische Regulation bezeichnet werden (PASANTES-MORALES et al. 2000; HOFFMANN et al. 2009). Werden Zellen mit ausgeprägt hypo- oder hypertonen Umgebungen konfrontiert, tritt auf Grund des Influx oder Efflux von Wasser eine Schwellung oder Schrumpfung der Zelle ein. Die Veränderung des Zellvolumens führt zum einen zu Veränderungen des Membranpotentials und übt zum anderen Dehnungsreize auf die Plasmamembran und das Zytoskelett aus (LANG et al. 1998). Beide Vorgänge aktivieren Ionenkanäle und vermitteln Signalkaskaden, die über eine RVD oder RVI zu einer Regulation des Zellvolumens führen (HOFFMANN et al. 2009). Es wurde vielfach gezeigt, dass die Prozesse der RVD und RVI auch in Spermien verschiedener Säugetierspezies vorhanden sind (Makake YEUNG et al. 1999b; Schwein und Rind: PETRUNKINA et al. 2001b; Maus: YEUNG et al. 2002; Hund: PETRUNKINA et al. 2004c; Rind:
KHALIL et al. 2006). Die Mechanismen die bei einer RVD von Spermien aktiv werden, sind bislang nicht exakt definiert (PETRUNKINA et al. 2007a). Es wird vermutet, dass die Erkennung eines veränderten Zellvolumens an dehnungssensitive Kalium- und Chloridkanäle gekoppelt ist (PETRUNKINA et al. 2004a). Eine Beteiligung von Kaliumkanälen konnte für die Spermien einiger Spezies gezeigt werden (Rind: KULKARNI et al. 1997; Maus: YEUNG et al. 1999a; Schwein PETRUNKINA et al. 2001b; Mensch: YEUNG u. COOPER 2001; Hund:
PETRUNKINA et al. 2004c). Für Spermien von Schwein und Maus wurde eine Beteiligung dehnungssensitiver Chloridkanäle nachgewiesen (YEUNG et al. 1999a;
PETRUNKINA et al. 2004a). Die Involvierung von Kanälen beider Osmolyte fügt sich in das Konzept einer elektroneutralen Regulation ein (PETRUNKINA et al. 2001b).
Durch den Ausstrom der Ionen kommt es zu einer verringerten Tonizität im
Zellinneren und einem begleitenden Ausstrom von Wasser (PETRUNKINA et al.
2001b). In den Wassereinstrom und –ausstrom über die Plasmamembran sind Aquaporine involviert (HOFFMANN et al. 2009), die auch in Spermien nachgewiesen wurden (CURRY et al. 1995; YEUNG et al. 2009). Die Beteiligung eines Taurinefflux während der RVD wird für Spermien von Eber und Mensch ausgeschlossen (YEUNG et al. 2003; PETRUNKINA et al. 2004a), spielt jedoch laut YEUNG et al.
(2003; 2006), ebenso wie der Efflux anderer organischer Osmolyte, bei Spermien von Mäusen eine Rolle. Eine Involvierung von Komponenten des Zytoskeletts in die Volumenregulation wurde von PETRUNKINA et al. (2004b,c) für Spermien von Eber und Hund gezeigt. An den Regulationsprozessen sind laut PETRUNKINA et al.
(2005a, 2007a) auch eine Reihe von Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungs- prozessen beteiligt. So zeigten die Autoren an Eberspermien, dass die Steuerung der Regulationsprozesse für die RVD und die RVI (d.h. das Öffnen und Schließen von Kanälen) mit der Aktivität von Proteinkinasen und –phosphatasen verknüpft ist.
Eine Beteiligung von cAMP an der Steuerung der RVD wird vermutet (PETRUNKINA et al. 2007a).
.
3 Material und Methode
3.1 Versuchsschema
Alle Versuche wurden mit Spermaproben durchgeführt, die in kommerziell erhältlicher Beltsville Thawing Solution (BTS, Fa. Minitüb, Tiefenbach) verdünnt waren und bei +17°C gelagert wurden. Die Messungen der einzelnen Parameter fand im ersten Versuchsabschnitt nach 12, 24, 72, 120 und 168 h Lagerungsdauer statt.
Im zweiten Versuchsabschnitt wurden die Messungen nach 24 und 72 h Lagerungsdauer durchgeführt (Abbildung 2).
Abb. 2: Übersicht über die im ersten (A) und zweiten (B) Versuchsabschnitt ver- wendeten Methoden und Untersuchungszeitpunkte.
42 Ejakulate von 14 Ebern
• Standardspermatologie
• Computerassistierte Spermienanalyse (CASA)
• Membranintegrität
• SCSA
• Calciuminflux
• Stimulation der Motilität durch Bikarbonat Zentrifugation durch Percoll Untersuchung nach 12, 24 , 72, 120 und 168 h
32 Ejakulate von 32 Ebern
• Standardspermatologie
• Volumenregulationstest Zentrifugation durch Percoll Untersuchung nach 24 und 72 h
A
B
3.2 Geräte und Verbrauchsmaterial
Die verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialen sind in im Anhang dieser Arbeit aufgelistet (Kapitel 9.5).
3.3 Chemikalien und Gebrauchslösungen
Eine Auflistung der verwendeten Chemikalien mit Bezugsquellen und der Rezepte zur Herstellung verwendeter Lösungen befindet sich im Anhang dieser Arbeit (Kapitel 9.2 und 9.3). Das für die Experimente verwendete Wasser wurde über eine Ionenaustauschersäule (Fa. Landgraf, Langenhagen) aufbereitet und anschließend sterilfiltriert (Druckfiltra-tionseinheit Sartobran 300, Fa. Landgraf, Langenhagen).
3.4 Herkunft der Ejakulate
Für die Versuche standen 46 klinisch gesunde Eber im Alter von zwei bis sieben Jahren der Rassen Pietrain, Deutsche Landrasse sowie der Zuchtlinien 05 und 01 des Bundeshybridzuchtprogrammes (BHZP) zur Verfügung. Sieben Eber stammten aus dem institutseigenen Eberbestand, die weiteren Tiere waren auf drei nahe gelegenen Besamungsstationen untergebracht. Von allen Tieren wurde i.d.R. einmal pro Woche Sperma gewonnen. Im Vorfeld der Experimente waren die Ejakulate dieser Tiere als normosperm im Sinne der Gewährschaftsbestimmungen des ZDS (Version 2005) eingestuft worden. Das heißt, der Anteil als motil eingestufter Samenzellen nach subjektiver Schätzung lag im nativen Sperma bei mindestens 70 % und der Anteil morphologisch abweichender Spermien bei maximal 25 %. Der Probentransport von den Besamungsstationen ins Labor der Reproduktionsmedizinischen Einheit erfolgte durch einen Kurierdienst, so dass die Besamungstuben am Tag der Gewinnung im Labor eintrafen. Nach einer Temperaturkontrolle bei Erhalt des Samens wurde dieser bis zur Untersuchung in einem Klimaschrank (Fa. Minitüb, Landshut) bei +17°C gelagert.
3.5 Samengewinnung
Die Gewinnung des Samens der institutseigenen Tiere erfolgte mit Hilfe der so genannten „Handmethode“ am Phantom. Die spermienreiche und spermienarme
Phase eines Ejakulates wurden in einem auf +38°C vorgewärmten Samenauffang- beutel (US Bag™, Fa. Minitüb, Landshut) aufgefangen, der in einem ebenfalls vorgewärmten Samenauffangbecher (Fa. Minitüb, Landshut) aufgespannt war. Eine in den Samenauffangbeutel integrierte Gaze filterte das Bulbourethraldrüsensekret vom übrigen Ejakulat ab. Im Anschluss an die Samengewinnung wurde der Samenauffangbeutel in eine auf ca. +35°C vorgewärmte Styroporkiste verpackt und ins Labor transportiert.
3.6 Samenuntersuchung und Verdünnung
Nach Ankunft im Labor wurde das Ejakulat aus dem Samenauffangbeutel in einen sterilen Glasmesszylinder umgefüllt und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Auf +35°C erwärmter Samenverdünner (BTS, Fa. Minitüb) wurde aus dem Wasserbad entnommen, um ein gleichmäßiges Abkühlen von Verdünner und Ejakulat zu gewährleisten. Es wurden Volumen, Farbe, Konsistenz, Motilität, Dichte, Spermien- gesamtzahl, pH-Wert und der Anteil morphologisch abweichender Spermien (MAS) des Ejakulates bestimmt. Die Ermittlung des Anteils motiler Samenzellen erfolgte durch subjektive Schätzung in einem Phasenkontrastmikroskop mit Heiztisch (+38°C) (Fa. Zeiss, Jena) bei 160-facher Vergrößerung (Okular 10x, Objektiv 16x, Phase 1).
Die Dichtebestimmung wurde in Anlehnung an das Verfahren nach KRAUSE (1966) mit der Zählkammer „Thoma-neu“ durchgeführt. Ein Minimum von 50 Spermienköpfen pro Kammerhälfte wurde bei 400-facher Vergrößerung (Okular 10x, Objektiv 40x, Phase 2) im Phasenkontrastmikroskop (Fa. Zeiss, Jena) ausgezählt.
Die Spermiengesamtzahl wurde aus der Multiplikation von Dichte und Volumen des Ejakulates berechnet. Der pH-Wert wurde mit einem pH-Meter (Multiplex 3000/pMX, Fa WTW, Weilheim) ermittelt. Zur Bestimmung des Anteils MAS wurden jeweils 200 Spermien einer mit 4%-igem Formolcitrat fixierten Probe bei 1000-facher Vergrößerung (Okular 10x, Objektiv 100x, Ölimmersion, Phase 3) im Phasenkontrastmikroskop (Fa. Zeiss, Jena) beurteilt. Die Beurteilung der Samenzellen erfolgte in Anlehnung an das Schema nach KRAUSE (1966)
Nach Bestimmung der Dichte wurden pro Ejakulat zwei Besamungsportionen mit 100 ml Volumen und einer Konzentration von 20 x 106 Spermien / ml hergestellt.
Nach der Verdünnung wurden die Besamungsflaschen (Artikel 13450/0100, Fa.
Minitüb, Tiefenbach) mit möglichst geringer verbleibender Luftblase verschlossen und für 90 min bei Raumtemperatur belassen. Im Anschluss wurden die Proben für die weitere Lagerung in einen Klimaschrank bei +17°C verbracht. Die Proben wurden täglich aufgeschwenkt. Für die Untersuchungen an den einzelnen Lagerungstagen wurden nur aus einer Flasche entsprechende Probenmengen entnommen. Die zweite Besamungsportion diente als Rückstellprobe, um sicherzustellen, dass bei einem deutlichen Rückgang der standardspermatologischen Werte dies nicht auf das wiederholte Öffnen und Schließen der Flaschen zurückzuführen war.
3.7 Standardspermatologie
Zur subjektiven Motilitätsschätzung wurden 2 ml des verdünnten Samens in einem Reagenzglas für 30 Minuten im Wasserbad bei +38°C inkubiert und in einem Phasenkontrastmikroskop mit Heiztisch (+38 °C) bei 160-facher Vergrößerung beurteilt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der verdünnte Samen aufgeschwenkt und nachdem sich Verwirbelungen gelegt hatten, ein etwa linsen- großer Tropfen auf einem vorgewärmten Objektträger platziert und mit einem ebenfalls vorgewärmten Deckglas abgedeckt. Es erfolgte die Schätzung des Anteils beweglicher Samenzellen in mehreren zentralen Blickfeldern. Dies wurde an mindestens zwei weiteren Tropfen wiederholt.
Zur Bestimmung des Anteils der Spermien mit normalem apikalen Rand (NAR) wurde ein Aliquot des verdünnten Samens in 4%-igem Formolcitrat fixiert. Jeweils 200 Spermien einer fixierten Probe wurden bei 1000-facher Vergrößerung (Okular 10x, Objektiv 100x, Ölimmersion, Phase 3) im Phasenkontrastmikroskop in Anlehnung an das Schema nach KRAUSE (1966) beurteilt. Es wurden ausschließlich Veränderungen des apikalen Randes erfasst.
3.8 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA)
3.8.1 Gerät und Software
Für die computergestützte Motilitätsananlyse wurde ein SpermVision®-System der Firma Minitüb genutzt. Es bestand aus einem Mikroskop (BX41TF, Fa. Olympus, Hamburg) mit beheizbarem Objekttisch und automatisch fahrendem Kreuztisch. Die Darstellung der Spermien erfolgte bei 200-facher Vergrößerung (Okular 10x, Objektiv 20x) im negativen Phasenkontrast. Über einen TV-Adapter (U-PMTVC tv-0,75, Fa.
Olympus, Hamburg) war das Mikroskop mit einer Digitalkamera (AccuPiXEL TM6760 CL, Fa. JAI A/S, Glostrup, Dänemark) verbunden. Die Bilder der Kamera (Auflösung: 800 x 600 Pixel) wurden zur Verarbeitung an einen angeschlossenen Computer weitergeleitet. Weiter bestand das System aus einer beheizbaren Arbeitsplatte (HT 300, Fa. Minitüb, Tiefenbach), die gleichzeitig als Steuereinheit für die Heizung des Objekttisches diente. Das System wurde über die Software SpermVision® (Version 3.5, Fa. Minitüb, Tiefenbach) bedient. Die Bestimmung der Motilität und der Bewegungsparameter der Spermien erfolgte an 10 aufeinander folgenden Messpositionen auf der zentralen Längsachse einer Leja- Messkammer mit 20 µm Schichtdicke (SC 20-01-04-B, Leja Products B.V., Nieuw- Vennep, The Netherlands). Sie wurden durch den fahrbaren Kreuztisch vom Programm automatisch angesteuert. Eine exakte Definition der Messpositionen befindet sich im Anhang (Kapitel 9.4). In jeder Messposition wurde innerhalb von 0,5 Sekunden eine Serie aus 30 Einzelbildern aufgenommen. Die einzelnen Spermien wurden von der Software an Hand ihrer Kopffläche detektiert. Als Spermienkopf waren Objekte mit einer Fläche zwischen 23 und 120 µm2 definiert.
Durch eine Bestimmung der Positionsveränderung des Spermienkopfes auf den 30 Bildern einer Messposition wurden für jede Samenzelle folgende Parameter ermittelt:
• zurückgelegte Wegstrecken [µm]: DSL = distance straight-line DCL = distance curvilinear DAP = distance average path
• Geschwindigkeiten [µm/s]: VSL = velocity straight-line VCL = velocity curvilinear VAP = velocity average path
• gemittelte maximale seitliche Kopf-: ALH = amplitude of lateral head- auslenkung von der mittleren Bahn displacement
[µm]
• Frequenz des Kreuzens des gewun- : BCF = beat cross frequency denen Bewegungspfades mit der ge-
mittelten Bewegungsbahn [Hz]
• Gerichtetheit der Bewegung: WOB = VAP / VCL = wobble STR = VSL / VAP = straightness LIN = VSL / VCL = linearity
• durchschnittlicher Richtungswechsel: AOC = average orientation change des Spermienkopfes
Die Klassifikation der einzelnen Spermien als immotil und lokal motil erfolgte nach folgenden Kriterien:
Immotil: AOC < 2,5
lokal motil: AOC > 2,5 und DSL < 4,5
Samenzellen, deren Bewegungsparameter nicht diesen Kriterien entsprachen, wurden als progressiv motil eingestuft. Als Ergebnis einer Messung wurde vom System der Prozentsatz für die Gesamtmotilität und den Anteil progressiv motiler Spermien ausgegeben. Die oben genannten Parameter wurden von der Software als Mittelwert für die als progressiv motil eingestuften Spermien ausgegeben. Für die Experimente der Bikarbonatstimulation der Motilität wurden für die Ejakulate der institutseigenen Tiere zusätzlich die Bewegungsparameter jeder einzelnen Zelle gespeichert.
3.8.2 Messung
Zur Vorbereitung der Messungen wurden die Arbeitsplatte, der Objekttisch, sowie die verwendeten Messkammern und Pipettenspitzen (Microman CP10, Gilson, Middleton, U.S.A.) auf +38°C erwärmt. Der Kreuztisch wurde auf die Ausgangsposition (x = 0, y = 0) justiert und die Lichtintensität für eine optimale Kontrastierung der Spermienköpfe vor dem Hintergrund eingeregelt.
Zwei Milliliter des verdünnten Samens wurden in ein Reagenzglas gefüllt und für 15 min im Wasserbad bei +38°C inkubiert. Im Anschluss wurde der Samen aufge- schwenkt und nachdem sich Verwirbelungen gelegt hatten, ein Aliquot von 2,7 µl zum Befüllen der Messkammer entnommen. Es wurde darauf geachtet die Pipettenspitze im 90°-Winkel zum Objektträger zu positionieren und einen hängenden Tropfen in die Einfüllmulde abzusetzen. Der Tropfen wurde durch Kapillarkräfte in die Kammer eingezogen. Bei unvollständiger Füllung oder sichtbaren Luftblasen in der Kammer, wurde diese verworfen und der Vorgang wiederholt. Nach erfolgreicher Kammerbefüllung fuhr der Kreuztisch auf die erste Messposition und mit dem Feintrieb des Mikroskops wurde das Kamerabild auf dem Monitor scharf eingestellt. Im Anschluss wurde die automatische Analyse mit den unter Kapitel 3.8.1 beschriebenen Einstellungen gestartet. Alle Messungen waren innerhalb von 60 Sekunden nach Befüllung einer Kammer beendet. Die Messdaten wurden für eine weitere Bearbeitung und Auswertung in das Programm Microsoft Excel exportiert.
3.9 Membranintegrität in der Durchflusszytometrie
3.9.1 Testprinzip
Die Methode beruht auf der Detektion veränderter Permeabilitätseigenschaften intakter und defekter Spermienmembranen. Die Kombination von zwei Fluoreszenzfarbstoffen mit unterschiedlichen spezifischen Bindungsstellen innerhalb der Zelle erlaubt die gleichzeitige Bestimmung der Integrität der Plasma- und der Akrosommembran der Spermien.
3.9.2 Gerät und Farbstoffe
Die Messungen wurden an einem Durchflusszytometer der Baureihe „Galaxy“ (Fa.
Partec, Münster) durchgeführt. Das Gerät war ausgestattet mit einem Argon- ionenlaser (488 nm; 20 mW) und drei verschiedenen Filtern: FL-1 (537,5/22,5 nm) für grünes Fluoreszenzlicht, FL-2 (590/25 nm) für oranges Fluoreszenzlicht und (630 nm LP) für rotes Fluoreszenzlicht. Die Steuerung erfolgte über die Software FloMax 2.0 (Fa. Partec, Münster).
Plasmamembranintakte und -defekte Zellen wurden durch Propidiumjodid (PI, Fa.
Sigma-Aldrich, Steinheim) differenziert. Dies ist ein Fluoreszenzmarker, der an doppelsträngige DNA und RNA (TAS u. WESTERNENG 1981) bindet. Der Farbstoff ist für intakte Zellmembranen impermeabel, so dass nur membrandefekte Zellen mit PI gefärbt werden. Die Detektion des nach Anregung emittierten roten Fluoreszenzlichtes erfolgte im Kanal FL-3. Zur Unterscheidung von Spermien mit intakter und defekter äußerer Akrosommembran wurde an Fluoreszeinisothiocyanat gekoppeltes Peanut Agglutinin (FITC-PNA, Vector, Burlingame, U.S.A.) verwendet.
Es handelt sich hierbei um ein Lektin der Erdnuss, das eine hohe Spezifität für die Bindung an Gal-β(1-3)-GalNAc-Strukturen aufweist. Es bindet bei Eberspermien an der Innenseite der äußeren akrosomalen Membran (FLESCH et al. 1998). Detektiert wurde das emittierte grüne Fluoreszenzlicht im Kanal FL-1.
3.9.3 Grundeinstellung des Gerätes
Für das Durchflusszytometer wurde zu Beginn der Lagerungsversuche eine Grundeinstellung der Signalverstärkungen aller relevanten Parameter festgelegt.
Zuerst wurden zur Herstellung einer ungefärbten Probe 10 µl verdünntes Sperma zu 890µl HBS (pH 7,4, 300 mOsmol) pipettiert und vermischt. Es erfolgte die Festlegung der Verstärkung für die Parameter Vorwärtsstreuung (FSC = forward scatter, Maß für die Partikelgröße) und Seitwärtsstreuung (SSC = sidescatter, Maß für die Komple- xität (Granularität) der Partikel). Beide Parameter wurden auf linearen Skalen darge- stellt. Es wurde darauf geachtet im Histogramm der FSC eine glockenförmige Verteilungskurve abzubilden. Ereignisse die links der Kurve im FSC detektiert werden, sind in der Regel Signale von Schmutzpartikeln und wurden über die Wahl
einer geeigneten Verstärkung von der Messung ausgeschlossen. In einem Punktewolkendiagramm (dotplot) wurden FSC (Abszisse) und SSC (Ordinate) gegeneinander aufgetragen. Es sollte eine „L“-Form oder Dreiecksform erkennbar sein. Für die Einregulierung der Verstärkungen in den Kanälen FL-1 und FL-3 wurden Spermaproben separat mit jeweils einem Farbstoff gefärbt. Es wurden zeitversetzt 497,5 µl verdünntes Sperma mit 2,5 µl PI-Stammlösung (500 µg/ml) bzw.
495 µl verdünntes Sperma mit 5 µl FITC-PNA-Stammlösung (300 µg/ml) versetzt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurden 10 µl der gefärbten Probe in 890 µl HBS überführt und gemessen. Während der Messung wurde die Verstärkung für den jeweiligen Fluoreszenzkanal einreguliert. Es wurde darauf geachtet, dass zwei Populationen in der jeweiligen einparametrischen Darstellung zu differenzieren waren. Die Verstärkungen für FL-1 und FL-3 wurden so gewählt, dass die jeweils linke der beiden Populationen (PI- bzw. FITC-PNA-negative Ereignisse) in der ersten Dekade einer logarhythmischen Skala abgebildet wurde. PI- und FITC-PNA-positive Ereignisse zeigten eine mindestens um den Faktor 10 erhöhte Fluoreszenzintensität.
Im vierten Schritt erfolgte die Feinjustierung der Verstärkungen der Fluoreszenzsignale über eine Doppelfärbung einer verdünnten Samenprobe. Zu 492,5 µl verdünntem Sperma wurden 2,5 µl PI-Stammlösung (Endkonzentration:
2,7 µg/ml) und 5 µl FITC-PNA-Stammlösung (Endkonzentration: 3 µg/ml) pipettiert und vermischt. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 10 µl der gefärbten Spermiensuspension in 890 µl HBS überführt und analysiert. Die Einstellung der Verstärkungen während der Versuche war grundsätzlich: FSC 260, SSC 430, FL-1 (grün) 530, FL-3 (rot) 590. Sie wurden an jedem Untersuchungstag überprüft und bei einer Darstellung der Messdaten in den Histogrammen, die abweichend zu den oben genannten Beschreibungen war, angepasst. Das Gerät war für alle Messungen auf den Parameter FSC getriggert.
3.9.4 Messung und Auswertung
Für die Bestimmung des Anteils plasma- und akrosommembranintakter Spermien wurde der Ansatz einer Doppelfärbung verwendet, der bereits in den Grundeinstellungen beschrieben wurde. Für die Färbung wurden zu 492,5 µl
