Kurvenverläufe der kinetischen Populationsveränderungen in Abhängigkeit

Flüssig konservierte Spermaproben wurden nach 12, 24, 72, 120 und 168 h Lagerungsdauer durch einen diskontinuierlichen Percollgradienten zentrifugiert und mit Fluo-3/AM beladen. Sie wurden parallel in drei auf Tyrode basierenden Medien inkubiert. Das vollständige Kapazitationsmedium (TyrBikCa) enthielt 15 mM NaHCO3

und 2 mM CaCl2. Im ersten Kontrollmedium (TyrCa) waren 2 mM CaCl2, aber kein Bikarbonat enthalten. Das zweite Kontrollmedium (TyrKontrolle) enthielt weder Bikarbonat noch Calcium. Propidiumjodid (PI) diente in allen Medien als Marker für die Integrität der Plasmamembran der Spermien. An jedem Untersuchungstag wurden nach 3, 20, 40, 60, 90, 120, 150 und 180 min Inkubationsdauer in den unterschiedlichen Medien Messungen mit einem Durchflusszytometer durchgeführt.

Für die Auswertung wurde zwischen negativen (Plasmamembran intakt) und positiven (Plasmamembran defekt) Spermien differenziert. Innerhalb der PI-negativen Spermien wurde darüber hinaus zwischen Fluo-3-PI-negativen (niedriger intrazellulärer Ca²⁺-Gehalt) und Fluo-3-positiven (hoher intrazelluärer Ca²⁺-Gehalt) Spermien unterschieden. Es werden im Folgenden die Veränderungen für die Population der PI- und Fluo-3-negativen (Plasmamembran intakt und niedriger intrazellulärer Ca²⁺-Gehalt), der PI-negativen und Fluo-3-positiven (Plasmamembran intakt und hoher intrazellulärer Ca²⁺-Gehalt), sowie der PI-positiven Spermien (Plasmamembran defekt) während der Inkubation unter kapazitationsfördernden Bedingungen in vitro beschrieben. Die Darstellung erfolgt differenziert nach Lagerungszeitpunkten und Inkubationsmedien (Abbildung 4 und Tabellen 26 bis 30 im Anhang). Die kinetischen Veränderungen der einzelnen Spermiensub-populationen in den Inkubationsmedien an den jeweiligen Lagerungstagen waren näherungsweise als Funktionen in Abhängigkeit von der Inkubationsdauer (t) darstellbar (Tabelle 31 im Anhang).

12 h Lagerungsdauer

In TyrBikCa sank die Population der PI- und Fluo-3-negativen Spermien von 87,9 ± 2,8 % nach 3 min Inkubationsdauer auf 19,3 ± 5,7 % nach 180 min (p < 0,001). Die Population PI-negativer und Fluo-3-positiver Spermien stieg von 3,3 ± 1,0 % nach 3 min auf 21,6 ± 6,4 % nach 60 min an (p < 0,05). Der Wert nach 90 min (23,6 ± 6,3 %) zeigte eine weitere Zunahme im Vergleich zum Zeitpunkt 60 min (p < 0,05). Bis zum Ende der Inkubationsdauer nach 180 min (22,6 ± 8,4 %) blieb der Anteil PI-negativer und Fluo-3-positiver Spermien im Vergleich zu den Werten nach 60 und 90 min Inkubation unverändert (p > 0,05). Es hatte sich ein Plateau eingestellt (Abbildung 4 (A)). Der Anteil PI-positiver Spermien stieg während der Inkubation von 9,8 ± 4,9 % (3 min) auf 58,0 ± 9,5 % (180 min) an (p < 0,001).

In TyrCa nahm die Population der PI- und Fluo-3-negativen Spermien während der Inkubation von 90,7 ± 2,6 % (3 min) auf 72,3 ± 7,0 % (180 min) ab (p < 0,0001). Zu jedem Inkubationszeitpunkt lagen die Werte für diese Population in TyrCa oberhalb der Werte aus TyrBikCa (p < 0,001). Der Anteil PI-negativer und Fluo-3-positiver Spermien stieg über die gesamte Inkubationsdauer von 2,1 ± 0,8 % (3 min) auf 8,0 ± 3,9 % (180 min) an (p < 0,0001). Die Werte PI-negativer und Fluo-3-positiver Spermien blieben in TyrCa unterhalb der Werte aus TyrBikCa (p < 0,0001). Die Population PI-positiver Spermien nahm von 7,2 ± 2,2 % (3 min) auf 19,5 ± 5,6 % (180 min) zu (p < 0,001). Die Werte waren zu jedem Messzeitpunkt niedriger als in TyrBikCa (p < 0,001).

In TyrKontrolle sanken die Werte für die PI- und Fluo-3-negative Spermienpopulation von 91,9 ± 2,0 % (3 min) auf 83,7 ± 3,7 % (180 min; p < 0,0001) (Tabelle 26 im Anhang). Der Anteil PI- und Fluo-3-negativer Spermien in TyrKontrolle lag zu jedem Zeitpunkt über dem aus TyrBikCa und TyrCa (p < 0,05). Der Anteil PI-negativer und Fluo-3-positiver Spermien war während der gesamten Lagerungsdauer unter 1 %. Er war zu allen Messzeitpunkten niedriger als in TyrBikCa und TyrCa (p < 0,05). Die Population PI-positiver Zellen stieg von 7,6 ± 2,1 % (3 min) auf 16,1 ± 3,6 % (180 min) an (p < 0,0001). Der Anteil PI-positiver Spermien war zu allen Zeitpunkten niedriger als in TyrBikCa (p < 0,05) und bis auf die Messungen nach 60, 90, und 120 min geringer als in TyrCa (p < 0,05).

Abb. 4: Veränderung des prozentualen Anteils der PI-neg. und Fluo-3-neg. ( ),

24 h Lagerungsdauer

Im Vergleich zu den Ergebnissen nach 12 h zeigte sich nach 24 h Lagerungsdauer in allen Medien ein gleichgerichteter Kurvenverlauf der einzelnen Spermienpopulationen (Tabelle 31 im Anhang). Daher wird für diesen Zeitpunkt nur auf einzelne hervorzuhebende Aspekte in den Kurvenverläufen eingegangen.

In TyrBikCa geht für die Population PI- und Fluo-3-negativer Spermien aus den mathematischen Modellfunktionen hervor, dass nach 24 h Lagerungsdauer die Abnahme dieser Population weniger steil im Vergleich zum Verlauf nach 12 h ist. Für die PI-negativen und Fluo-3-positiven Zellen ergab sich in TyrBikCa erneut ein Plateau.

Der Wert zum Zeitpunkt 60 min (18,6 ± 5,3 %) war niedriger (p < 0,05) als nach 90 min (19,7 ± 5,9 %), jedoch gleich mit denen nach 120 bis 180 min (p > 0,05). Die Werte im Plateau waren zu allen Zeitpunkten niedriger als nach 12 h (p < 0,001). Die Population PI-positiver Spermien zeigte in den kinetischen Modellen einen flacheren Anstieg als nach 12 h Lagerungsdauer (Tabelle 31 im Anhang).

In TyrCa und TyrKontrolle ließ sich dagegen ein Trend zu einer beschleunigten Abnahme der Population PI- und Fluo-3-negativer Spermien feststellen, während der Anteil der positiven Spermien schneller anstieg (Tabelle 31 im Anhang). Der Anteil PI-negativer und Fluo-3-positiver Spermien lag in beiden Medien zu allen Inkubationszeitpunkten unter den Werten aus TyrBikCa (p < 0,05).

72 h Lagerungsdauer

In TyrBikCa verringerte sich die Population der PI- und Fluo-3-negativen Spermien während der Inkubation von 83,0 ± 4,0 % (3 min) auf 28,6 ± 5,6 % (180 min;

p < 0,0001). Die Population PI-negativer und Fluo-3-positiver Spermien stieg von 6,3 ± 1,2 % nach 3 min auf 15,7 ± 2,7 % nach 60 min Inkubationsdauer an (p < 0,0001). Zu allen folgenden Inkubationszeitpunkten blieb diese Spermien-population in ihrem Wert unverändert (p > 0,05). Erneut hatte sich ein Plateau eingestellt (Abbildung 4 (B)). Der Anteil PI-positiver Spermien stieg während der Inkubation von 10,7 ± 3,4 % (3 min) auf 55,6 ± 6,2 % (180 min) an (p < 0,0001).

In TyrCa nahm die Population der PI- und Fluo-3-negativen Spermien während der Inkubation von 86,7 ± 3,9 % (3 min) auf 55,4 ± 7,5 % (180 min) ab (p < 0,0001). Wie

nach 12 h Lagerungsdauer lagen die Werte für diese Spermienpopulation in TyrCa zu jedem Inkubationszeitpunkt oberhalb der Werte aus TyrBikCa (p < 0,0001). Der Anteil PI-negativer und Fluo-3-positiver Spermien stieg im Laufe der Inkubationsdauer von 3,9 ± 1,4 % (3 min) auf 13,9 ± 2,9 % (180 min) an (p < 0,0001). Mit Ausnahme des Zeitpunktes 180 min lagen alle Werte in TyrCa unterhalb derer aus TyrBikCa (p < 0,01).

Die Population PI-positiver Spermien stieg zwar von 9,4 ± 2,9 % (3 min) auf 30,7 ± 6,5 % (180 min) an (p < 0,001), war aber zu jedem Messzeitpunkt niedriger als in TyrBikCa (p < 0,001).

In TyrKontrolle sanken die Werte für die PI- und Fluo-3-negative Spermienpopulation von 89,5 ± 3,0 % (3 min) auf 75,7 ± 4,7 % (180 min) (p < 0,0001). Die Population PI- und Fluo-3-negativer Spermien in TyrKontrolle war zu jedem Zeitpunkt größer als in TyrBikCa und TyrCa (p < 0,001). Der Anteil PI-negativer und Fluo-3-positiver Spermien beschrieb einen von 3 min (1,0 ± 0,6 %) nach 90 min (1,5 ± 1,0 %) ansteigenden (p < 0,05) und dann bis 180 min (0,9 ± 0,4 %) wieder abfallenden Kurvenverlauf (p < 0,05). Die Werte waren zu allen Messzeitpunkten niedriger als in TyrBikCa und TyrCa (p < 0,001). Die Population PI-positiver Zellen stieg von 9,5 ± 2,8 % (3 min) auf 23,3 ± 4,5 % (180 min) an (p < 0,0001). Im Vergleich zwischen den Medien TyrCa und TyrKontrolle waren für den Anteil PI-positiver Spermien nur nach 3 und 20 min Inkubationsdauer gleiche Zahlenwerte vorhanden (p > 0,05).

120 h Lagerungsdauer

Die Veränderungen der Spermienpopulationen in den einzelnen Medien zeigten grundsätzlich ähnliche Verläufe wie zu den vorhergehenden Zeitpunkten.

In TyrBikCa sank die Population der PI- und Fluo-3-negativen Spermien zwischen den Messzeitpunkten 3 und 150 min von 79,9 ± 4,0 % auf 32,7 ± 5,1 % ab (p < 0,0001) und blieb zum Zeitpunkt 180 min (31,6 ± 5,9 %) auf diesem Niveau (p > 0,05). Der Kurvenverlauf war flacher als zu den vorherigen Zeitpunkten (Tabelle 32 im Anhang).

Die PI- negative und Fluo-3-positive Spermienpopulation erreichte nach 40 min einen Plateauwert der zwischen Werten von 14,3 ± 2,3 % (40 min) und 15,4 ± 2,8 % (150 min) lag. Nach 180 min verringerte sich die Population im Vergleich zum Wert nach 150 min (p < 0,05). Der Anteil PI-positiver Spermien stieg in einem deutlich

flacheren Verlauf als zu den vorangegangenen Lagerungszeitpunkten (Tabelle 31 im Anhang) von 12,1 ± 3,6 % (3 min) auf 53,8 ± 4,9 % (180 min) an (p < 0,0001).

In TyrCa zeigte sich in den kinetischen Modellen eine beschleunigte Abnahme der PI- und Fluo-3-negativen Spermien im Vergleich zu den vorherigen Lagerungszeitpunkten (Tabelle 31 im Anhang). Die PI-negative und Fluo-3-positive Spermienpopulation in TyrCa war bis einschließlich dem Zeitpunkt 120 min niedriger als in TyrBikCa (p < 0,05). Ab dem Inkubationszeitpunkt 150 min war der Anteil PI-negativer und Fluo-3-positiver Spermien in TyrCa und TyrBikCa gleich (p > 0,05). Der Anteil der PI-positiven Spermien stieg in einem schnelleren Maße als zu den vorhergehenden Lagerungszeitpunkten an.

In TyrKontrolle war die Abnahme der PI- und Fluo-3-negativen Spermien im Vergleich zu den vorherigen Lagerungszeitpunkten ebenfalls beschleunigt (Tabelle 31 im Anhang). Die Population der PI-negativen und Fluo-3-positiven Spermien zeigte basale Werte bis maximal 2,3 ± 1,1 % nach 60 min Inkubationsdauer. Die Zunahme der PI-positiven Spermienpopulation war im Vergleich zu den früheren Lagerungszeitpunkten beschleunigt (Tabelle 31 im Anhang)

168 h Lagerungsdauer

In TyrBikCa sank die Population der PI- und Fluo-3-negativen Spermien von 75,2 ± 4,7 % (3 min) auf 28,5 ± 6,2 % (180 min; p < 0,001). Die Population PI-negativer und Fluo-3-positiver Spermien stieg von 10,1 ± 2,3 % nach 3 min auf 13,0 ± 4,3 % nach 20 min Inkubationsdauer an (p < 0,05) und veränderte sich bezogen auf diesen Zeitpunkt bis zum Ende der Inkubation nach 180 min (13,6 ± 3,4 %) nicht (p > 0,05). Der Zeitpunkt 60 min hob sich als Maximalwert mit 15,4 ± 3,5 % zum Teil signifikant (p < 0,05) von den übrigen Werten ab (Abbildung 4 (C)). Der Anteil PI-positiver Spermien stieg von 14,7 ± 3,2 % (3 min) auf 57,5 ± 4,1 % (180 min) an (p < 0,0001).

In TyrCa nahm die Population der PI- und Fluo-3-negativen Spermien während der Inkubation von 76,2 ± 4,7 % (3 min) auf 39,0 ± 5,1 % (180 min) ab (p < 0,0001).

Außer nach 3 min lagen die Werte für diese Population in TyrCa zu jedem Inkubationszeitpunkt oberhalb der Werte aus TyrBikCa (p < 0,01). Die PI-negative und

Fluo-3-positive Spermienpopulation erreichte im Gegensatz zu allen anderen Lagerungszeitpunkten nach 168 h während der Inkubation ein Plateau. Ab 40 min Inkubationsdauer gab es keine signifikanten Unterschiede mehr zu den weiteren Messzeitpunkten (p > 0,05). Die Höhe des Plateaus schwankte zwischen 12,9 ± 2,3 % (40 min) und 14,4 ± 3,5 % (120 min). Die Werte für die Population PI-negativer und Fluo-3-positiver Spermien waren zwischen TyrBikCa und TyrCa mit Ausnahme der Zeitpunkte 3, 20 und 60 min gleich (p > 0,05).

Die Population PI-positiver Spermien nahm von 14,7 ± 3,1 % (3 min) auf 46,5 ± 6,2 % (180 min) zu (p < 0,0001). Die Werte waren außer am Messzeitpunkt nach 3 min niedriger als in TyrBikCa (p < 0,01).

In TyrKontrolle sanken die Werte für die PI- und Fluo-3-negative Spermienpopulation von 83,5 ± 3,5 % (3 min) auf 59,9 ± 5,8 % (180 min) (p < 0,0001; Tabelle 31 im Anhang). Der Anteil PI- und Fluo-3-negativer Spermien lag in TyrKontrolle zu jedem Messzeitpunkt über dem aus TyrBikCa und TyrCa (p < 0,05). Für den Anteil der PI-negativen und Fluo-3-positiven Spermien war ein initial ansteigender und später abfallender Verlauf der Werte zu sehen. Ein Maximum wurde nach 60 min Inkubationsdauer mit 3,1 ± 0,8 % erreicht. Die Werte waren zu allen Messzeitpunkten niedriger als in TyrBikCa und TyrCa (p < 0,05). Der Anteil PI-positiver Spermien stieg während der Inkubation von 14,3 ± 3,3 % (3 min) auf 38,9 ± 5,4 % (180 min) an (p < 0,0001).

In allen Medien war zwischen den einzelnen Lagerungszeitpunkten eine kontinuierliche Verringerung des Anteils PI- und Fluo-3-negativer Spermien nach 3 min Inkubationsdauer zu verzeichnen (p < 0,05; Tabelle 32 im Anhang). Dagegen war mit steigender Lagerungsdauer am Beginn der Inkubation (3 min) ein immer größerer Anteil PI-negativer und Fluo-3-positiver Spermien in allen drei Medien zu verzeichnen (p < 0,05). Eine entsprechende Beobachtung wurde für die Population PI-positiver Spermien nur in TyrCa und TyrKontrolle gemacht. In TyrBikCa war dagegen der Anteil PI-positiver Spermien nach 3 min Inkubationsdauer nur nach 120 und 168 h Lagerungsdauer gegenüber dem Wert nach 12 h erhöht (p < 0,05).

4.4.2 Einfluss der Lagerungsdauer am Beispiel eines repräsentativen