4.4 CALCIUMINFLUX
4.5.1 Einfluss der Lagerungsdauer auf die Stimulierbarkeit der einzelnen
Die weitere Darstellung der Ergebnisse beschränkt sich auf den Anteil der progressiv motilen Spermien, die velocity average path (VAP), linearity (LIN), amplitude of lateral head-displacement (ALH) und beat cross frequency (BCF). Zum einen wurde der Anteil progressiv motiler Spermien als Parameter gewählt, da er im Vergleich zur Gesamtmotilität, trotz gleichgerichteter Veränderungen während der Lagerung, den Effekt der Aktivierung der Spermienmotilität von Bikarbonat anschaulicher abbildete.
Zum anderen fiel die Wahl auf die Parameter VAP, LIN, ALH und BCF, um möglichst vollständig die qualitative Veränderung der Spermienbewegung hinsichtlich Geschwindigkeit, Gerichtetheit der Bewegung, Kopfauslenkung und Intensität der Geißelbewegung zu erfassen. Darüber hinaus waren es diese vier Parameter (VAP,
LIN, ALH und BCF), die nach einer statistischen Vorüberprüfung als relevant für eine Subpopulationsanalyse eingestuft wurden (Tabelle 38 im Anhang).
Für einen Vergleich der Stimulationswirkung von Bikarbonat zwischen den einzelnen Lagerungszeitpunkten wurde für die CASA-Parameter die Differenz (Δ) zwischen den Werten aus TyrBik und TyrKontrolle an den einzelnen Untersuchungstagen, wie hier am Beispiel der VAP gezeigt, berechnet:
ΔVAP = VAP (TyrBik) – VAP (TyrKontrolle)
Dieser Differenzwert wird im Folgenden als Indikator für die Stimulierbarkeit der einzelnen Parameter verwendet (Tabelle 37 im Anhang).
Tab. 11: CASA-Motilitätsparameter (MW ± SD) nach 10 min Inkubation der Spermien bei 38°C in Tyrode ohne (TyrKontrolle) und mit 15 mM Bikarbonat (TyrBik) in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer bei 17°C (n = 42 Ejakulate von 14 Ebern). Beide Medien enthielten 1 mM EGTA. Weitere Parameter sind in Tabelle 36 im Anhang gelistet.
Lagerungsdauer [h]
Parameter* Medium 12 24 72 120 ** 168 ***
TyrKontrolle 68,1 ± 8,2 a 51,5 ± 7,7b 34,6 ± 11,8c 26,6 ± 14,9 d 12,4 ± 9,7e Mot progr.
[%] TyrBik 79,3 ± 7,6 a 64,3 ± 6,9b 50,5 ± 13,1c 35,4 ± 15,6 d 20,5 ± 13,6e TyrKontrolle 42,2 ± 4,9 a 40,3 ± 5,7a,b 33,1 ± 4,8b 37,2 ± 7,7 b 32,5 ± 9,8c VAP
[µm/s] TyrBik 110,8 ± 10,1 a 101,8 ± 14,7b 97,2 ± 10,4b 84,9 ± 12,5 c 63,7 ± 20,1d TyrKontrolle 0,43 ± 0,04 a 0,36 ± 0,02 b,c 0,36 ± 0,04 b 0,38 ± 0,05 c 0,34 ± 0,06 b,c LIN TyrBik 0,68 ± 0,06 a 0,63 ± 0,06 b 0,68 ± 0,06 a 0,63 ± 0,06 b 0,55 ± 0,10 c
TyrKontrolle 1,90 ± 0,21 a 2,04 ± 0,24 b 1,91 ± 0,25 a 1,79 ± 0,31 a 1,59 ± 0,49 c ALH
[µm] TyrBik 2,32 ± 0,21 a 2,46 ± 0,20 b 2,25 ± 0,25 a 2,20 ± 0,25 a,c 1,90 ± 0,52 c TyrKontrolle 34,3 ± 2,6 a 31,0 ± 3,0b 29,2,0 ± 2,7c 27,8 ± 4,6 d 24,3 ± 8,1e BCF
[Hz] TyrBik 35,4 ± 1,1 a,b 35,1 ± 1,2a,b 35,8 ± 1,7a,b 36,3 ± 3,1 a 33,4 ± 8,5b
a - e) Werte mit unterschiedlichen Buchstaben innerhalb einer Zeile unterscheiden sich (p < 0,05).
*) Mot progr. = Anteil progressiv motiler Spermien VAP = velocity average path
LIN = linearity (VAP/VCL) ALH = amplitude of lateral head-displacement BCF = beat cross frequency
**) n = 41 Ejakulate von 14 Ebern
***) n = 27 Ejakulate von 11 Ebern
Progressive Motilität
Zu jedem Untersuchungszeitpunkt nahm der Anteil progressiv motiler Spermien in TyrKontrolle und TyrBik signifikant ab (p < 0,01). In TyrKontrolle verringerte er sich von 68,1 ± 8,2 % nach 12 h auf 12,4 ± 9,7 % nach 168 h (p < 0,0001), während sie in TyrBik von 79,3 ± 7,6 % nach 12 h auf 20,5 ± 13,6 % nach 168 h sank (p < 0,0001).
Die Stimulierbarkeit der progressiven Motilität (Abbildung 11) veränderte sich dagegen innerhalb der ersten 72 h der Lagerung nicht (p > 0,05) und erreichte mit 15,9 ± 9,8 % nach 72 h Lagerungsdauer ein relatives Maximum. Nach 120 und 168 h Lagerungsdauer war die Stimulierbarkeit geringer (p < 0,05) als nach 72 h, allerdings gleich (p > 0,05) zu den Werten nach 12 und 24 h (Abbildung 11).
0 5 10 15 20 25 30
12 24 72 120 * 168 **
Abb. 11: Differenz (Δ) des Anteils progressiv motiler Spermien zwischen calcium-freien Tyrodemedien mit 15 mM Bikarbonat (TyrBik) und ohne Bikarbonat (TyrKontrolle) in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer bei 17°C. Alle Werte als Mittelwert und Standardabweichung. (n = 42 Ejakulate von 14 Ebern).
Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich (p < 0,05).
*) n = 41 Ejakulate von 14 Ebern
**) n = 27 Ejakulate von 11 Ebern [%]
[h]
a,b a a,b b b
Lagerungsdauer
Δ progressive Motilität
Velocity average path (VAP)
Zum Zeitpunkt 12 h der Lagerung wurde die VAP der Spermien durch Bikarbonat um 68,6 ± 9,6 µm/s von 42,2 ± 4,9 µm/s in TyrKontrolle auf 110,8 ± 10,1 µm/s in TyrBik
gesteigert (p < 0,0001). Nach 24 h und 72 h war die Stimulierbarkeit der Geschwindigkeit (ΔVAP) mit 61,5 ± 11,9 bzw. 59,1 ± 9,1 µm/s gleich (p > 0,05), aber gegenüber dem Wert nach 12 h verringert (p < 0,05; Abbildung 12 (A)). Sowohl in TyrKontrolle und TyrBik war zum Zeitpunkt 24 und 72 h der Lagerung die VAP gleich (p > 0,05) und bis auf den Wert in TyrKontrolle nach 24 h niedriger als nach 12 h Lagerungsdauer (p < 0,01). Nach 120 h Lagerungsdauer sank die ΔVAP gegenüber den vorherigen Lagerungstagen auf 47,7 ± 7,4 µm/s (p < 0,05). Dies war durch eine Abnahme der VAP in TyrBik bedingt (p < 0,05). Die VAP in TyrKontrolle blieb bezogen auf den Wert nach 24 und 72 h unverändert (p > 0,05). Nach 168 h Lagerungsdauer sank die VAP mit 32,5 ± 9,8 µm/s in TyrKontrolle und 63,7 ± 20,1 µm/s in TyrBik auf die niedrigsten Werte während der Lagerung (p < 0,05). Die ΔVAP verringerte sich entsprechend auf 31,2 ± 11,5 µm/s und war damit niedriger als an allen vorherigen Untersuchungstagen (p < 0,05).
Linearity (LIN)
Nach 12 h Lagerungsdauer wurde der Parameter linearity (LIN) durch Bikarbonat im Mittel um 0,26 ± 0,06 (ΔLIN) von 0,43 ± 0,04 in TyrKontrolle auf 0,68 ± 0,06 in TyrBik
gesteigert (p < 0,0001). Nach 24 h Lagerungsdauer sank der Wert für die LIN im TyrKontrolle (p < 0,0001), und blieb an den folgenden Untersuchungstagen auf gleichem Niveau wie nach 24 h (p > 0,05). Dagegen zeigte die LIN in TyrBik bis zum Zeitpunkt 120 h der Lagerung einen undulierenden Verlauf. Nach 12 und 72 h bzw.
24 und 120 h Lagerung war die LIN gleich (p > 0,05), wobei die Werte nach 12 und 72 h größer waren (p < 0,05). Nach 168 h sank die LIN in TyrBik auf den niedrigsten Wert während der Lagerung (p = 0,001). Die Stimulierbarkeit der LIN (ΔLIN) war nach 72 h Lagerungsdauer mit 0,31 ± 0,07 größer als zu den übrigen Lagerungszeitpunkten (p < 0,01), an denen sich die ΔLIN nicht voneinander unterschied (p > 0,05; Abbildung 12 (B)).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
1 2 3 4 5
0 0,1 0,2 0,3 0,4
12 24 72 120 * 168 **
Abb. 12: Differenz (Δ) der velocity average path (VAP; A) und der linearity (LIN; B) der Spermien zwischen calciumfreien Tyrodemedien mit 15 mM Bikarbonat (TyrBik) und ohne Bikarbonat (TyrKontrolle) in Abhängigkeit von der Lage-rungsdauer bei 17°C. Alle Werte als Mittelwert und Standardabweichung.
(n = 42 Ejakulate von 14 Ebern). Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich (p < 0,05).
*) n = 41 Ejakulate von 14 Ebern
**) n = 27 Ejakulate von 11 Ebern [µm/s]
a b b c d
Δ VAP
a b a a a
Δ LIN
A
B
[h]
Lagerungsdauer
Amplitude of lateral head-displacement (ALH)
Nach 12 h Lagerungsdauer lag die mittlere seitliche Auslenkung des Spermienkopfes (ALH) in TyrKontrolle und TyrBik bei 1,90 ± 0,21 bzw. 2,32 ± 0,21 µm. Nach 24 h stieg die ALH in beiden Medien signifikant an (p < 0,05), und fiel zu den Zeitpunkten 72 und 120 h der Lagerung auf Werte, die identisch mit denen nach 12 h waren, zurück (p > 0,05). Nach 168 h Lagerungsdauer sank die ALH in TyrKontrolle gegenüber dem Wert nach 120 h ab (p < 0,05). In TyrBik zeigte sich eine ähnliche Tendenz (p = 0,0507). Die Stimulierbarkeit der ALH (ΔALH) war zu allen Lagerungszeitpunkten gleich (p > 0,05) und betrug zwischen 0,42 ± 0,23 und 0,31 ± 0,25 µm (Abbildung 13 (A)).
Beat cross frequency (BCF)
Zwischen den einzelnen Lagerungszeitpunkten nahm die beat-cross freqency (BCF) in TyrKontrolle stetig ab (p < 0,05). Sie verringerte sich von 34,30 ± 2,6 Hz nach 12 h Lagerungsdauer auf 24,3 ± 8,1 Hz nach 168 h (p = 0,001). Im Gegensatz dazu blieb die BCF in TyrBik während der Lagerung konstant (p > 0,05). Zwischen den Zeitpunkten 12 h (35,4 ± 1,1 Hz) und 168 h (33,4 ± 8,5 Hz) nahm nur die Standardabweichung zu. Daraus folgte, dass die Stimulierbarkeit der BCF (ΔBCF) zwischen 12 und 120 h Lagerung zu jedem Untersuchungszeitpunkt zunahm (p < 0,05) und sich insgesamt von 1,09 ± 2,69 auf 9,08 ± 3,55 Hz erhöhte (p < 0,0001; Abbildung 13 (B)). Nach 168 h war keine weitere Steigerung der ΔBCF zu verzeichnen (p > 0,05; Abbildung 13 (B)).
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
1 2 3 4 5
0 2 4 6 8 10 12 14
12 24 72 120 * 168 **
Abb. 13: Differenz (Δ) der amplitude of lateral head-displacement (ALH; A) und der beat cross frequency (BCF; B) der Spermien zwischen calciumfreien Tyrodemedien mit 15 mM Bikarbonat (TyrBik) und ohne Bikarbonat (TyrKontrolle) in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer bei 17°C. Alle Werte als Mittelwert und Standardabweichung. (n = 42 Ejakulate von 14 Ebern).
Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich (p < 0,05).
*) n = 41 Ejakulate von 14 Ebern [µm]
a a a a a
Δ ALH
[Hz]
a c b d d
Δ BCF
[h]
Lagerungsdauer
A
B